KR102101690B1 - 고추 녹광품종 유래 bZIP 전사인자 CaAIBZ1을 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고추 유래 신규 CaAIBZ1 (Capsicum annuum ASRF1-Interacting bZIP transcription factor 1) 유전자/단백질, 및 이를 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 건조 스트레스에 대한 음성적 조절인자 (negative regulator) 단백질을 암호화 하는 CaAIBZ1 유전자를 규명하였으며, 다만 상기 CaAIBZ1 유전자는, ABA 신호전달의 양성 조절자로서 기능하는 CaASRF1(Capsicum annuum ABA Sensitive RING Finger E3 ligase 1) 유전자에 의해 안정성이 조절되는 것을 특징으로 한다. 또한 CaAIBZ1 단백질이 ABA 신호전달의 음성 조절자로 기능하며 상기 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 형질전환 식물체에서 건조 스트레스 저항성 증진 효과를 확인하였는바, CaAIBZ1 유전자의 발현 조절을 통해 인류가 이용할 수 있는 작물 등의 개량에 활용할 수 있으며, 특히 식물의 생산성을 향상시키는데 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

고추 녹광품종 유래 bZIP 전사인자 CaAIBZ1을 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법 {Method for improving the resistance to drought stress using bZIP transcription factor CaAIBZ1 in plants}

본 발명은 고추 유래 신규 CaAIBZ1 (Capsicum annuum ASRF1-Interacting bZIP transcription factor 1) 유전자, 단백질 및 이를 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

지구온난화는 극심한 기후 변화를 야기하여 식물들의 정상적인 생장 및 발달을 저해하는 환경적 스트레스를 유발하며, 이에 대하여 식물체는 추위, 고염, 및 가뭄과 같은 불리한 환경에서 생존하기 위한 정교한 방어기작을 진화시켜왔다. 예컨대, 가뭄(drought)은 수분 부족 환경에 의해 일어나며 식물의 정상적인 성장에 심각한 영향을 미쳐 결국 곡물의 수확량 감소를 초래하는데, 식물은 이러한 건조 스트레스에 적응하기 위해 기공폐쇄, 앱시스산(abscisic acid; 이하 ABA)의 합성 및 축적과 같은 다양한 방어 기작을 활성화시킨다.

ABA는 비 생물적 스트레스 특히, 건조 스트레스에 대하여 식물을 보호하기 위한 조절인자이며, 식물 생장 및 발달에 매우 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 보고된 바에 의하면, ABA를 미리 처리하고 스트레스를 준 식물은 그렇지 않은 식물에 비해 스트레스에 잘 저항하는 반면 ABA를 생성하지 못하거나, ABA에 반응하지 못하는 돌연변이 식물들은 스트레스에 약한 것으로 알려졌다. 따라서 ABA의 반응에 관여하는 단백질들을 이용하면, 환경 스트레스에 대한 저항성이 향상된 식물을 개발할 수 있을 것으로 기대되고 있다.

ABA 신호는 삼투 적응 및 뿌리 수리 전도도(hydraulic conductivity)의 조절에 관여하는 전사인자와 E3 리가아제(E3 ligase)와 같은 다양한 스트레스 관련 유전자들의 발현을 조절다고 알려져 있으나, 완전한 ABA 신호전달 경로는 아직 규명되지 않았다. 식물세포에서 ABA 신호전달 개시를 위해서는 ABA 수용체가 존재해야 하고 신호를 하위 단백질로 전달해야한다. 현재까지 ABA 수용체로써 PYR/PYL/RCARs가 ABA를 인식하는 역할을 한다고 알려져 있다. 수용체가 ABA를 인식하면 표적 단백질의 인산화를 통해 특정 유전자들의 발현 및 이온 채널 활성화를 촉진시키며, 이는 식물체가 불리한 환경에 적응할 수 있도록 한다.

오늘날 사막화가 진행됨에 따라 물 부족이 농업과 환경에 큰 문제점을 초래하고 있으며, 이에 물을 적게 사용하여도 건조한 환경에서 견디고 살 수 있는 식물의 개발이 필요한 실정이다. 이러한 기술이 개발되어 작물에 적용되면 농업 생산량이 크게 증가할 것으로 기대되며, 특히 건조한 지역의 경우, 건조 저항성이 향상된 식물, 즉 증산 작용을 낮출 수 있는 식물들은 생존에 유리하므로, 농업 생산성 향상에 기여할 수 있을 뿐 아니라, 환경이 매우 건조한 지역에서 환경정화에도 유용할 수 있다.

이에, 식물체의 건조 스트레스에 대한 저항성을 증진시키기 위한 방법이 주요 연구 대상이 되고 있으며, 이와 관련하여 건조 스트레스 내성 및 생장 촉진 관련 유전자와 이에 따른 형질전환 식물체에 대한 연구가 이루어지고 있으나(한국등록특허 10-1291365), 아직 미비한 실정이다.

본 발명자들은 ABA 신호전달 경로 조절을 통한 건조 스트레스 반응간의 관련성을 알아보기 위해 연구하던 중, 고추에서 CaAIBZ1 (Capsicum annuum ASRF1-Interacting bZIP transcription factor 1) 유전자를 동정하였으며, 상기 유전자를 침묵시킬 경우, 식물의 건조 스트레스 저항성을 증진시키는 ABA 신호전달의 음성 조절자로서의 기능함을 규명하므로서, 본 발명을 완성하였다. 다만 상기 CaAIBZ1 유전자는, ABA 신호전달의 양성 조절자로서 기능하는 CaASRF1(Capsicum annuum ABA Sensitive RING Finger E3 ligase 1) 유전자에 의해 안정성이 조절되는 것을 특징으로 한다.

이에, 본 발명의 목적은 건조 스트레스에 대한 음성적 조절인자 (positive regulator) 단백질을 암호화하며, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CaAIBZ1 (Capsicum annuum ASRF1-Interacting bZIP transcription factor 1) 유전자, 상기 CaAIBZ1 유전자에 의해 코딩되는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 목적은 신규의 CaAIBZ1 유전자/단백질, 및 상기 유전자 또는 단백질을 유효성분으로 포함하는 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CaAIBZ1 유전자를 식물체에 형질 전환하여 과 발현시킴으로써 식물체의 건조 스트레스 저항성을 증진시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 건조 스트레스에 대한 음성적 조절인자(negative regulator) 단백질을 암호화하며, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CaAIBZ1 (Capsicum annuum ASRF1-Interacting bZIP transcription factor 1) 유전자, 상기 CaAIBZ1 유전자에 의해 암호화되는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 CaAIBZ1 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자 또는 상기 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법을 제공한다.

(a) CaAIBZ1 단백질을 암호화하는 서열번호 1의 유전자를 식물체에 형질전환 하는 단계; 및

(b) 상기 형질 전환된 식물체에서 CaAIBZ1 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 단계.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명은 건조 스트레스에 대한 음성적 조절인자(negative regulator) 단백질을 암호화 하는 신규 CaAIBZ1 유전자를 동정하였으며, CaAIBZ1 단백질은 ABA 신호전달의 음성 조절자로 기능하며, 다만 상기 CaAIBZ1 유전자는, ABA 신호전달의 양성 조절자로서 기능하는 CaASRF1(Capsicum annuum ABA Sensitive RING Finger E3 ligase 1) 유전자에 의해 안정성이 조절되는 것을 특징으로 한다. 또한 상기 단백질의 발현 또는 활성을 억제한 형질전환 식물체에서 건조 스트레스 저항성 증진 효과를 확인하였는바, CaAIBZ1 유전자의 발현 조절을 통해 인류가 이용할 수 있는 작물 등의 개량에 활용할 수 있으며, 특히 식물의 생산성을 향상시키는데 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1a는 RING zinc finger C3H2C3 유형 도메인의 정렬을 확인한 결과이다. 도 1b는 CaASRF1 단백질의 추정 아미노산 서열과 다른 아미노산 서열의 비교를 관찰한 결과이다. 도 1c는 CaASRF1 단백질의 식물 세포 내 위치를 확인하기 위해 CaASRF1-GFP 융합 단백질의 GFP(Green fluorescent protein) 신호를 공초점 현미경으로 관찰한 결과이다. 도 1d는 상기 CaASRF1의 발현 양상을 확인하기 위해 고추식물에 후추 Actin1 유전자를 내부 통제한 채 NaCl(200mM), 건조, ABA(10μM) 각각 처리한 후 한 결과이다. 도 1e는 CaASRF1의 자가-유비퀴틴화(Auto-ubiquitination)를 확인하기 위해, 유비퀴틴, E1(UbE1) 및 E2(UBHPCH5b)의 존재하에 MBP-CaASRF1 융합 단백질의 E3 유비퀴틴 리가제 활성(E3 ubiquitin ligase activity)을 나타낸 결과이다.
도 2a는 CaAsRF1-silenced 고추 식물 잎 (TRV : CaASRF1) 및 대조군(control plants) 인 빈 벡터 고추 식물(empty vector control pepper plants) 잎 (TRV : 00)에서 ABA 처리 후 CaASRF1 발현의 RT-PCR 분석을 확인한 결과이다. 도 2b는 CaAsRF1-silenced 식물체 및 대조군에 건조스트레스를 주었을 때 표현형의 차이를 확인한 결과이다. 도 2c는 다시 물 준 후 1일이 지난 때 CaAsRF1-silenced 식물체와 대조군의 생존률을 확인한 결과이다. 도 2d는 대조군과 CaAsRF1-silenced 식물체로부터 잎을 제거한 후 매 시간 별로 증발하는 물손실량을 확인한 결과이다. 도 2e는 CaAsRF1-silenced 식물체에 ABA(50 μM) 처리 후의 잎 온도가 감소됨을 확인한 결과이다. 도 2f는 CaAsRF1-silenced 식물체에 다양한 농도의 ABA 처리 후 기공 구획을 관찰한 결과이다.
도 3a는 야생형 식물(wild-type plant , WT)과 CaASRF1-OX 형질 전환 계통에서 CaASRF1 발현의 RT-PCR 분석을 확인한 결과이다. 도 3b는 CaASRF1-OX 형질전환 식물이 ABA에 감수성이 높은 표현형을 보여주기 위해 CaASRF1-OX 식물과 야생형에 ABA를 각각 다른 농도로 처리한 후, 5일 후의 대표이미지를 관찰한 결과이다. 도 3c는 다양한 농도의 ABA 처리 후 야생형 및 CaASRF1-OX 형질전환 식물의 종자발아율을 나타낸 결과이다. 도 3d는 CaASRF1-OX 형질전환 식물의 묘목성장을 알아보기 위해, ABA(0.5μM)처리 후 야생형 및 CaASRF1-OX 형질전환 식물 자엽량을 관찰한 결과이다. 도 3e 및 3f는 ABA 처리 후 야생형 및 CaASRF1-OX 형질전환 식물의 일차 뿌리 신장을 관찰한 결과이다.
도 4a는 CaASRF1-OX 형질전환 식물의 가뭄저항성 표현형을 관찰한 결과이다. 도 4b는 재 급수 후 CaASRF1-OX 형질전환 식물의 생존률을 관찰한 결과이다. 도 4c는 잎을 분리한 후 CaASRF1-OX 형질전환 식물과 야생형의 수분손실을 관찰한 결과이다. 도 4d는 ABA(0μM) 및 ABA(10μM) 처리 후 CaASRF1-OX 형질전환 식물 잎의 온도가 증가된다는 것을 관찰한 결과이다. 도 4e 및 4f는 3주된 각각 식물에서 잎 껍질을 수확하고 ABA(0μM) 및 ABA(10μM) 함유하는 SOS완충액에서 배양한 후에 야생형 및 CaASRF1-OX 형질전환 식물의 기공구멍을 관찰한 결과를 나타낸 것이다. 도 4g는 CaASRF1-OX 형질전환 식물에 3시간동안 가뭄스트레스를 준 후에 가뭄 - 유도성 유전자의 정량 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction , qRT-PCR) 분석을 관찰한 결과이다.
도 5a는 ClustalW2를 사용하여 CaAIBZ1 단백질과 그 상동성 bZIP 전사 인자의 아미노산 정렬을 나타낸 결과이다. 도 5b는 100 μM abscisic acid (ABA), 가뭄 또는 200 mM NaCl로 처리 한 후 고추 잎에서 CaAIBZ1 발현의 qRT-PCR 분석을 확인한 결과이다. 도 5c는 담배(Nicotiana benthamiana) 표피 세포에서 녹색 형광 단백질 (GFP) 융합 단백질의 일시적인 발현에 의한 CaAIBZ1의 세포 내 위치를 확인한 결과이다. 도 5d는 효모단백질잡종분석(Yeast two-hybrid assay, Y2H)을 통한 CaASRF1과 CaAIBZ1 사이의 상호 작용을 관찰한 결과이다. 도 5e는 CaASRF1과 CaAIBZ1 사이의 상호 작용에 대한 풀다운 분석(pull-down assay)을 관찰한 결과이다. 도 5f는 이분자 형광 상보성 분석(Bimolecular fluorescence complementation , BiFC) 분석을 통해 CaAsRF1과 CaAIBZ1 사이의 상호 작용을 관찰한 결과를 나타낸 것이다. 도 5g는 CaAIBZ1에 의한 CaASRF1의 시험관 내 유비퀴틴화(In vitro ubiquitination)를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 6a는 ABA로 처리 한 지 24 시간 후에 CaAIBZ1-silenced 고추 식물(TRV:CaAIBZ1) 및 대조 식물(control plant)인 빈 벡터 고추 식물 (TRV : 00)의 잎에서 CaAIBZ 발현을 RT-PCR 분석을 통해 확인한 결과이다. 도 6b는 대조 식물과 비교하여 CaAIBZ1-silenced 고추 식물의 가뭄 내성 표현형을 관찰한 결과이다. 도 6c는 다시 물을 준 1 일 후에 대조 식물와 CaAIBZ1-silenced 고추 식물의 생존율을 관찰한 결과이다. 도 6d는 잎 분리 후 다양한 시점에서 대조 식물인 빈 벡터 고추식물 및 CaAIBZ1-silenced 된 고추 식물의 잎으로부터 증발하는 물 손실량을 관찰한 결과이다. 도 6e는 50 μM ABA 처리에 대한 반응으로 CaAIBZ1-silenced 고추 식물의 잎 온도 증가를 나타낸 결과이다. 도 6f는 다양한 ABA 농도로 처리 한 후 대조군과 CaAIBZ1-silenced 고추 식물에서 기공 구배를 관찰을 나타낸 결과이다.
도 7a는 야생형(Wild-type , WT) 식물과 CaAIBZ1-OX 형질 전환 계통에서 CaAIBZ1 발현을 RT-PCR 분석을 통해 확인한 결과이다. 도 7b는 ABA처리 한지 5일 후 ABA에 대한 야생형 계통 및 형질 전환 계통의 종자 발아를 관찰한 결과이다. 도 7c는 0.0 μM 또는 1.5 μM ABA를 포함하는 0.5 MS 한천 평판에서 야생형 모종 및 CaAIBZ1-OX 모종의 성장을 관찰한 결과이다. 도 7d는 0.0 μM 또는 1.5 μM ABA를 함유하는 0.5 MS 한천 평판 상에 각각 심은 다음 10 일 후에 야생형 계통 및 각 돌연변이 계통에서의 자엽량(Quantification of green cotyledons)을 관찰한 결과이다. 도 7e는 ABA에 반응한 야생형 계통 및 형질 전환 계통의 뿌리 신장을 관찰한 결과이다. 도 7f는 모종을 심은 뒤 10일 후 야생형 계통 및 형질 전환 계통의 뿌리 길이를 관찰한 결과이다.
도 8a는 CaAIBZ1-OX 식물이 가뭄에 민감한지 표현형을 관찰한 결과이다. 도 8b는 다시 물을 준 뒤 1 일 후 식물의 생존율을 관찰한 결과이다. 도 8c는 잎을 분리 한 후 여러 시점에서 야생형 (wild-type , WT) 및 형질 전환 식물의 잎에서 발생하는 수분 손실을 관찰한 결과이다. 도 8d는 50 μM ABA 처리에 반응하여 잎 온도가 감소한 CaAIBZ1-OX 식물을 관찰한 결과이다. 도 8e 및 8f는 ABA로 처리한 WT 및 CaAIBZ1-OX 식물의 기공 구멍을 관찰한 결과이다. 도 8g는 분리 후 3 시간의 가뭄 스트레스에 대한 CaAIBZ1-OX 돌연변이의 가뭄 - 유도성 유전자(drought-inducible genes)의 qRT-PCR 분석을 확인한 결과이다.
도 9a는 ABA 처리 후에 야생형(Wild-type , WT) , CaASRF1 과발현(CaASRF1-OX) 형질전환 식물, CaAIBZ1 과발현(CaASRF1-OX) 형질전환 식물 및 CaASRF1/CaAIBZ1 과발현(CaASRF1-OX/CaAIBZ1-OX) 형질전환 식물의 발아률을 관찰한 결과이다. 도 9b는 ABA 처리 후 WT과 상기 CaASRF1-OX 식물, CaAIBZ1-OX 식물 및 CaASRF1-OX/CaAIBZ1-OX 식물의 1차 뿌리 신장을 관찰한 결과이다.

본 발명자들은, 식물의 건조 스트레스에 있어 ABA 신호전달 기전에서 음성 조절인자 (negative regulator)로 기능하는 CaAIBZ1 유전자를 동정하였고, 다만 상기 CaAIBZ1 유전자는, ABA 신호전달의 양성 조절자로서 기능하는 CaASRF1(Capsicum annuum ABA Sensitive RING Finger E3 ligase 1) 유전자에 의해 안정성이 조절되는 것을 특징으로 하며, 상기 CaAIBZ1 유전자가 침묵된 고추 식물에서 건조 스트레스에 대한 내성 증가, CaAIBZ1 유전자가 과 발현 (CaDIR1-OX)된 형질전환 애기 장대에서 ABA 민감도 감소 및 건조 스트레스에 대한 저항성 감소를 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 건조 스트레스에 대한 음성 조절인자 (negative regulator) 단백질을 암호화하는 CaAIBZ1 (Capsicum annuum ASRF1-Interacting bZIP transcription factor 1) 유전자를 제공한다. 다만 상기 CaAIBZ1 유전자는, ABA 신호전달의 양성 조절자로서 기능하는 CaASRF1(Capsicum annuum ABA Sensitive RING Finger E3 ligase 1) 유전자에 의해 안정성이 조절되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 유전자인 CaAIBZ1은 바람직하게는, 서열번호 1의 염기서열로 이루어져 있으며, 상기 CaAIBZ1 유전자에 의해 암호화되는 단백질은 바람직하게는, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 "음성 조절인자(negative regulator) 단백질"이란 생명현상 조절에서 억제방향으로 작용하는 단백질을 의미한다. 즉, 본 발명의 유전자인 CaAIBZ1은 건조 스트레스에 대한 조절에서 억제하는 기능을 갖는 단백질을 암호화하고, 이로 인해, CaAIBZ1 유전자가 과 발현되는 경우, ABA 민감도 감소 및 건조 스트레스에 대한 저항성이 감소될 수 있다.

본 발명자들은 먼저 ABA 신호전달 경로 조절을 통한 건조 스트레스 저항성에 대하여 연구하던 중, CaAIBZ1 유전자의 안정성을 조절하고, 앱시스산(ascisic avid; ABA)에 의해 유도된 ABA 감수성 E3 ligase 인 CaASRF1를 동정하여(실시예 2 참조), 상기 CaASRF1 유전자가 ABA 신호전달 및 비 생물적 스트레스 반응과 관련이 있는지 그 연관성을 규명하고자 하였다.

본 발명의 일실시예에서는, CaASRF1 단백질의 식물 세포 내 위치를 확인하기 위해 녹색 형광 단백질 ( green fluorescent protein; GFP ) 와 CaASRF1 융합 단백질을 제조하여 핵에서 GFP 형광이 발현되는 것을 확인하였고, 가뭄, ABA 및 염분과 같은 비 생물적 스트레스에 반응하는 CaASRF1 유전자의 발현수준을 확인하였으며, 유비퀴틴, E1(UbE1) 및 E2(UBHPCH5b)의 존재 하에 MBP -CaASRF1 융합 단백질의 E3 유비퀴틴 연결효소( ligase ) 가 활성 되는 것을 관찰하여 CaASRF1의 자가 유비퀴틴화( Auto-ubiquitination ) 를 확인하였다. (실시예 2 참조).

본 발명의 다른 일실험예에서는, CaASRF1 유전자 침묵(CaASRF1-silenced) 식물체 및 대조군에 건조스트레스를 주었을 때 표현형의 차이를 확인하여, 생존률, 잎제거 후 물손실, ABA처리 후 온도변화, ABA 처리 후 기공구획을 관찰하여 CaASRF1-silenced 고추식물의 가뭄 내성이 감소한다는 사실을 확인하였다 (실험예 3 참조),

본 발명의 또 다른 일실험예에서는, CaASRF1 과 발현 (CaASRF1-OX) 형질전환 애기 장대 식물과 야생형 식물을 비교하여 CaASRF1-OX 형질전환 애기 장대 식물이 ABA 감수성이 증가한다는 사실을 확인하였다(실험예 4 참조)

본 발명의 또 다른 일실험예에서는, CaASRF1 과 발현 (CaASRF1-OX) 형질전환 애기 장대 식물과 야생형 식물을 비교하여 CaASRF1-OX 형질전환 식물이 가뭄 스트레스에 대한 내성이 증가한다는 사실을 확인하였다 (실험예 5 참조).

또한 본 발명자들은 ABA 신호전달 경로 조절을 통한 건조 스트레스 저항성에 대하여 연구하던 중, ABA 신호전달의 양성 조절자로서 기능하는 CaASRF1(Capsicum annuum ABA Sensitive RING Finger E3 ligase 1) 유전자에 의해 안정성이 조절되는 것을 특징으로 하는, 앱시스산(ascisic avid; ABA)에 의해 유도된 bZIP 전사인자인 CaAIBZ1를 동정하여(실험예 6 참조), 상기 CaAIBZ1 유전자가 ABA 신호전달 및 비생물적 스트레스 반응과 관련이 있는지 그 연관성을 규명하고자 하였다.

본 발명의 일실험예에서는, CaAIBZ1 단백질과 그 상동성 bZIP 전사 인자의 아미노산 정렬 및 CaAIBZ1 단백질의 세포 내 위치를 확인 한 후, 효모단백질잡종분석, 풀다운 분석, 이분자 형광 상보성 분석 및 시험관 내 유비퀴틴화를 관찰한 결과 CaAIBZ1 (Capsicum annuum ASRF1-Interacting bZIP transcription factor 1)이 CaASRF1와 상호작용하는 것을 확인하였다. (실험예 6 참조).

본 발명의 다른 일실험예에서는, CaAIBZ1 유전자 침묵(CaAIBZ1-silenced) 식물체 및 대조 식물에 건조스트레스를 주었을 때 표현형의 차이와 , 생존률, 잎제거 후 물손실, ABA처리 후 온도변화 , ABA 처리 후 기공구획을 관찰하여 CaAIBZ1-silenced 고추식물의 가뭄 내성이 향상한다는 사실을 확인하였다 (실험예 7 참조),

본 발명의 또 다른 일실험예에서는, CaAIBZ1 과 발현 (CaAIBZ1-OX) 형질전환 애기 장대 식물과 야생형(Wild-type , WT) 식물을 비교하여 CaAIBZ1-OX 애기 장대 식물이 ABA 감수성이 감소한다는 사실을 확인하였다(실험예 8 참조)

본 발명의 또 다른 일실험예에서는, CaAIBZ1 과 발현 (CaAIBZ1-OX) 형질전환 애기 장대 식물과 야생형 식물을 비교하여 CaAIBZ1-OX 식물이 가뭄 스트레스에 대한 내성이 감소한다는 사실을 확인하였다 (실험예 9 참조).

CaASRF1/CaAIBZ1이 함께 과 발현 (CaASRF1-OX/CaAIBZ1-OX) 된 형질전환 애기 장대 식물이 ABA 감수성이 증가한다는 사실을 확인하였다. (실험예 10 참조)

따라서, CaAIBZ1 단백질의 발현 또는 활성을 억제시킴으로써, 식물체의 건조 스트레스에 대한 저항성(내성)을 증진시킬 수 있으며, 이에, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 CaAIBZ1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 식물체의 건조 저항성 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 (a) CaAIBZ1 (Capsicum annuum ASRF1-Interacting bZIP transcription factor 1) 단백질을 암호화하는 서열번호 1의 유전자를 식물체에 형질전환 하는 단계; 및 (b) 상기 형질전환 된 식물체에서 CaAIBZ1 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 단계를 포함하는 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법, 및 상기 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명에서 상기 식물(체)는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류 등일 수 있으며, 가장 바람직하게는 애기장대 또는 고추이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 실험준비 및 실험방법

1-1. 식물 재료 및 성장 조건

고추 (Capsicum annuum L., cv. Nockwang), 및 담배 (Nicotiana benthamiana) 종자는 증기 소독된 배합토(피트모스(peat moss):펄라이트(perlite):질석(vermiculite)=5:3:2, v/v/v), 사토(sand), 및 양토(loam soil)를 1:1:1(v/v/v)로 섞고 파종하였다. 이후 고추 식물은 27±1℃ 조건의 생육실에서 16시간 빛/ 8시간 암주기로 백색 형광등(80 μmol photons m^-2.S^-1) 빛 아래 성장시켰다. 담배 식물은 16 시간 빛 / 8 시간 암주기로 25±1℃ 조건의 성장 챔버에서 유지시켰다. 애기 장대(Arabidopsis thaliana, 생태형 Col-0) 식물 종자를 1 % sucrose와 Microagar (Duchefa 생화학)가 포함된 Murashige and Skoog (MS) 소금에서 발아시켰다. 모든 종자는 성장실에 넣기 전에, 4℃에서 2일간 개화결실을 맺게 하였고, 그 플레이트를 성장 챔버에서 16 시간 빛 / 8 시간 암주기로 24℃에서 배양하였다. 애기 장대 모종은 증기 소독된 배합토(피트모스(peat moss):펄라이트(perlite):질석(vermiculite)=9:1:1, v/v/v)에 24℃에서 16 시간 빛 / 8 시간 암주기로 백색 형광등(130 μmol photons m^-2.S^-1) 빛 아래 60% 상대습도로 유지시켰다.

1-2. CaAIBZ1 유전자가 과 발현된 형질전환 애기 장대의 제조

전장 CaAIBZ1의 cDNA를 pENTR / D-TOPO 벡터 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 결합하고, CaAIBZ1 유전자의 구성적 발현을 위해 LR 반응을 사용하여 pK2GW7 이원매개체( binary vector )를 애기 장대의 cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S 프로모터 제어 하에 삽입 하였다. 35S : CaAIBZ1 구조를 아그로박테리움( Agrobacterium tumefaciens )균주 GV3101 로 형질 전환시켰다. 아그로박테리움( Agrobacterium tumefaciens ) 매개한 형질전환은 꽃가루 딥 방법(floral dip method) (Clough and Bent, 1998)을 통해 수행되었다. 형질 전환된 계통을 선택하기 위해, 형질 전환된 식물체로부터 수확한 종자를 카나마이신(kanamycin) 5050 μg·mL^-1을 함유 한 MS 한천 평판에 뿌렸다.

1-3. 효모 단백질 잡종 분석(Yeast two-hybrid assay, Y2H)

CaAIBZ1 또는 CaASRF1의 전장 cDNA를 pGBKT7벡터에 서브 클로닝 하였다. 상기 방법으로 얻은 구조를 리튬 아세테이트 - 매개 형질 전환 방법(lithium acetate-mediated transformation method (Ito 등, 1983)에 따라 효모 AH109 균주에 도입 하였다. 합성이 완료된 (SC) - 류신 - 트립토판 배지에서 선별 한 후, 형질 전환체는 생장 평가를 위해 SC- 아데닌 - 히스티딘 - 류신 - 트립토판 배지로 옮겼다; 이 평가는 단백질 - 단백질 상호 작용의 지표를 제공했다. 다음으로 각 효모 세포 배양액(OD600 = 0.5) 에서 10 배 단계 희석액을 준비하고 각 시료 5 μL를 SC- 류신 - 트립토판 배지 또는 SC- 아데닌 - 히스티딘 - 류신 - 트립토판 배지에 스포팅(spotted) 시켰다.

1-4. 이분자 형광 상보성 분석 (Bimolecular fluorescence complementation assay , BiFC)

종결 코돈이 없는 CaAIBZ1 또는 CaASRF1의 전장 cDNA는 bimolecular fluorescence complementation (BiFC) 구조체 (Waadt et al., 2008)의 생성을 위해 35S-VYNE 벡터에 서브 클로닝 되었다. 일과성 발현을 위해서, 상기 구조을 보유하고 있는 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens) 균주 GV3101를 유전자 침묵을 피하기 위해 p19 균주와 혼합 한 후, 1mL 바늘 없는 주사기를 사용하여 5 주된 담배(N. benthamiana) 식물 (OD600 = 0.5)의 잎의 배축면에 침투시켰다. 침윤 3 일 후, 잎 디스크를 절단하고 LSM Image Browser 소프트웨어가 장착 된 공 촛점 현미경 (510 UV / Vis Meta; Zeiss) 하에서 하측 표피 세포를 검사 하였다.

1-5. 세포 내 위치 분석(Subcellular localization analysis)

정지 코돈이 없는 CaAIBZ1 코딩 영역을 GFP- 융합 이진 벡터 p326GFP에 삽입 하였다. 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens) 균주 GV3101를 p19 균주 (1 : 1 비율, OD600 = 0.5)와 혼합하고, 5 주된 완전히 팽창 된 담배 식물 잎에 공침시켰다. 침투 2 일 후, 현미경 분석을 전술 한 바와 같이 수행 하였다.

1-6. 시험관 내 유비퀴틴 분석 ( in vitro ubiquitination assay)

Park et al.(2016)에 말토오스 결합 단백질 (MBP) - CaAIBZ1 재조합 단백질의 발현 및 정제 과정이 나타나 있다. 시험관내 자가 유비퀴틴 분석(in vitro self-ubiquitination assay)을 위해, 정제된 MBP-CaAIBZ1(500 ng)을 재조합 인간 UBE1 (E1) (Boston Biochemicals, Cambridge, MA), 그 E1에 태그된 인간 h5b 효소 (E2) (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY) 및 10 μg의 소(bovine)의 유비퀴틴(Sigma-Aldrich)을 포함하는 유비퀴틴화 반응 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 2 mM ATP, 5 mM MgCl2, 2 mM DTT)과 30 ℃에서 3 시간 동안 배양시켰다.

CaASRF1이 CaAIBZ1 유비퀴틴화를 매개하는지 여부를 결정하기 위해서, 50 ng의 GST-CaAIBZ1 융합 단백질을 유비퀴틴 혼합물에 첨가하고 혼합물을 3 시간 동안 배양 하였다. 반응된 단백질을 SDS-PAGE를 사용하여 분리하고 항-Ub (Santa Cruz Biotechnology, SantaCruz, CA) 및 항-GST 항체(Santa Cruz Biotechnology)와 함께 면역 블로팅 (immunoblotting)을 사용하여 분석 하였다.

1-7. RNA 추출 및 qRT-PCR(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction)

RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA)을 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 각기 ABA를 처리하거나 건조 스트레스를 준 고추 및 애기 장대 식물의 잎을 수확하였다. 상기 식물체의 잎으로부터 추출한 모든 RNA 샘플에 대하여 RNA가 없는 DNase(RNA-free DNase)로 분해하여 genomic DNA를 제거하고, Transcript First Strand cDNA Synthesis kit(Roche, Indianapolis, IN, USA)를 사용해 cDNA를 합성하였다. qRT-PCR 분석을 위해, 상기 방법으로 합성한 cDNA를 iQ™SYBR Green Supermix 및 하기 표 1과 같은 특이적 프라이머와 함께 CFX96 Touch™ Real-Time PCR detection system(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 증폭시켰다. 모든 반응은 세 번 반복하여 수행하였다. PCR은 95℃에서 5분간, 95℃에서 20초, 60℃에서 20초, 72℃에서 20초 45싸이클의 프로그램으로 수행되었다. 각 유전자의 상대적인 발현량은 ΔΔCt 방법으로 계산하였으며, 애기장대 액틴8 (Arabidopsis actin8; AtACT8) 유전자 및 고추 액틴 1(CaACT1) 유전자를 정규화를 위해 사용하였다.

1-8. ABA, 건조스트레스, NaCl 처리 및 형태 분석

ABA에 반응한 CaAIBZ1의 발현 양상을 조사하기 위해, 6 엽 단계(six-leaf stage) 고추 식물에 100 μM ABA 또는 대조액을 뿌렸다. NaCl 처리를 위해 고추 식물을 200 mM NaCl 용액으로 관개 하였다. 건조스트레스 처리를 위해서, 고추 식물을 손상을 피하기 위해 토양에서 조심스럽게 제거 한 다음 3mm 용지 (Whatman)에 두었다. 각 처리 후 0 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간 및 24 시간에 잎을 수확하고 RNA 분리 및 RT-PCR 분석을 수행 하였다.

1-9. 표현형 분석 (Phenotypic analyses)

묘목 성장을 시험하기 위해, 다양한 ABA 농도를 가진 MS 한천 배지를 함유하는 플레이트 상에 유전자형 당 36 개의 씨앗을 뿌렸다. 야생형 애기 장대와 CaAIBZ1 과 발현(CaAIBZ1-OX) 형질 전환 애기 장대에서 얻은 1 주일 된 묘목을 토양 혼합물을 담고 있는 그릇에 무작위로 심어 물기가 있는 조건에서 2 주 동안 재배했다. 가뭄 스트레스를 주기 위해 급수를 9-10 일 동안 보류하고 다시 물을 준 후 1-2 일 후에 재수화 된 잎을 가진 식물의 생존율을 계산했다. 고추의 경우, 10-11 일 동안 급수를 보류하여 4 엽 단계(four-leaf stage) 식물에 가뭄 스트레스가 가해졌으며 다시 물을 준 날로 부터 1 일 후에 재수화 된 잎을 가진 식물의 생존율이 계산되었다. 가뭄 저항성은 증발 수분 손실을 측정하여 정량적으로 결정되었다. 네 엽 단계(four-leaf stage)고추와 3 주 된 애기 장대 식물에서 잎을 분리하여 페트리 접시에 넣었다. 접시를 성장 챔버에서 40 %의 상대 습도로 유지하고, 지시된 시점에서 생중량의 손실을 측정 하였다. 모든 실험은 생물학적 시료에서 독립적으로 최소 3회 반복되었다.

1-10. 열 영상법(Thermal imaging)

열 화상 분석(thermal imaging analysis)을 위해, 첫 번째와 두 번째 잎이 모두 자라는 4 주된 고추 식물과 3 주 또는 4 주된 애기 장대 식물을 50μM ABA로 처리했다. 열 화상 이미지는 적외선 카메라 (FLIR systems; T420)를 사용하여 얻었으며 잎 온도는 FLIR Tools + ver 5.2 소프트웨어로 측정했다.

1-11. Virus-induced gene silencing (VIGS)

CaAIBZ1의 기능 상실 분석(loss-of function analysis)을 위해, 고추 식물에서 바이러스 유도 유전자 침묵 (virus-induced gene silencing: VIGS)이 수행되었다. 간략하게 음성대조군으로서 pTRV1 및 pTRV2:CaAIBZ1 또는 pTRV2:00을 운반하는 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens) 균주 GV3101을 고추의 완전히 자란 자엽(fully expanded cotyledons)에 침투시켰다(각 균주별 OD₆₀₀=0.2). 식물체들은 생장 및 바이러스가 증식할 수 있도록 16시간 낮/8시간 밤으로 광주기를 설정한 24℃의 생육실에 두었다.

1-12. 기공개도(Stomatal aperture)의 생물학적 검정

기공개도(stomatal aperture)의 생물학적 정량은 이전에 설명한대로 수행되었다(Lim and Lee, 2016). 간단하게는, 3 주된 장미 잎에서 잎 껍질을 채취하고 기공 개방 용액 (SOS; 50 mM KCl, 10 mM MES-KOH, 10 μM CaCl2, pH 6.15)에 부유시켰다. 껍질을 애기 장대 식물 및 고추 식물에서 80 %초과 하는 기공 개구를 얻기 위해 3 시간 동안 배양 하였다. 완충액을 다양한 ABA 농도를 함유한 신선한 SOS로 대체하였다. 잎 껍질은 그 후 2 시간 더 배양되었다. 각각의 개별 샘플에서, 100 기공을 Nikon Eclipse 80i 현미경하에 무작위로 관찰 하였다. 각 실험은 3 배로 수행되었다.

실시예 2. CaASRF1 유전자의 동정과 CaASRF1 분자 특성 규명

ABA 처리한 고추 잎에서 ABA-유도 유전자(ABA-induced genes)를 분리하기 위해 RNA-seq 분석을 수행했다. CaASRF1 (Capsicum annuum ABA Sensitive RING Finger type E3 ligase 1) 유전자 (accession no. KU557245)를 확인할 수 있었다.

그 결과, 도 1a 및 도1b에 나타 낸 바와 같이, CaASRF1 cDNA는 152 아미노산 잔기를 암호화하는 459 bp의 전사 해석틀(Open Reading Frame; ORF)이다.

보다 구체적으로, 도 1a에 나타 낸 바와 같이, CaASRF1 단백질은 유비퀴틴 -26S 프로테아좀 시스템 (ubiquitin-26S proteasome system)에서 E3리가제 활성(E3 ligase activity) 에 필수적인 C3H2C3 유형의 RING finger motif를 포함한다.

또한 도 1b에 나타 낸 바와 같이, 다중 서열 정렬 분석(Multiple sequence alignment)을 통해, CaASRF1이 다른 RING유형 E3 리가제(RING type E3 ligases)와 비교적 높은 아미노산 서열 동일성 (75-97 %)을 갖는다는 것을 밝혀냈다. 몇몇 E3 리가제(E3 ligase)는 핵과 세포질에 위치하여 기능한다. CaASRF1의 세포 내 위치를 확인하기 위해, 우리는 35S 프로모터의 제어 하에 CaASRF1과 녹색 형광 단백질(GFP)의 융합 단백질(CaASRF1-GFP fusion protein)을 만들었다.

그 결과 도 1c에 나타낸 바와 같이, 담배 식물(Nicotiana benthamiana)의 표피세포에서 CaASRF1-GFP 융합 단백질이 일시적으로 발현됨을 관찰하므로서, CaASRF1-GFP 융합 단백질은 핵과 세포질에 위치됨을 알 수 있었다. 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)에 대한 청색 형광 신호가 핵에서 검출되었다. 이러한 결과는 CaASRF1이 핵과 세포질에서 기능한다는 것을 나타낸다.

도 1d에 나타낸 바와 같이, CaASRF1의 발현 양상을 알아보기 위해 고추 잎을 ABA 및 비 생물성 스트레스로 처리하고 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR) 분석을 수행 하였다. 처리 전엔 CaASRF1 발현은 약하게 유도되었다. ABA, 가뭄 및 NaCl 처리 후에 CaASRF1 전사체가 더 강하게 축적되었다. E3 ligases와 공통적으로, CaASRF1은 유비퀴틴 활성(ubiquitination activity)을 나타내는 RING finger motif를 포함하고 있다.

도 1e에 나타낸 바와 같이, CaASRF1이 E3 리가아제 활성(E3 ligase activity)을 가지고 있는지 확인하기 위해 정제 된 CaASRF1 단백질을 사용하여 상기 실시예 1-6에 따라 시험관 내 유비퀴틴 분석(in vitro ubiquitination assay)를 수행했다. 정제 된 CaASRF1 단백질을 유비퀴틴(ubiquitin), E1, E2와 함께 1 시간 동안 항온 처리한 결과, 유비퀴틴화 된 CaASRF1 단백질을 항-MBP 또는 항-유비퀴틴 항체로 면역 블롯 분석(immunoblot analysis)을 사용하여 검출되었다. 몇 가지 더 높은 분자량 단백질 밴드(molecular-weight protein bands)를 검출한 결과, CaASRF1 단백질이 자동-유비퀴틴화되었음(auto-ubiquitinated)을 알 수 있었다.

실험예 3. CaASRF1가 침묵된(CaASRF1-silenced) 고추 식물의 가뭄 내성 감소

고추 식물에서 CaASRF1의 생물학적 기능을 연구하기 위해 실시예 1-11에 따라 바이러스-유도 유전자 침묵 (virus-induced gene silencing ;VIGS) 기반 유전자 기능 분석을 사용했다.

먼저, 도 2a에 나타낸 바와 같이 실시예 1-7에 따른 반-정량적 RT-PCR 분석(semi-quantitative RT-PCR analysis)을 사용하여 CaASRF1의 발현 수준을 측정 하였다. CaASRF1 전사체는, 대조식물(TRV : 00) 보다 CaASRF1가 침묵된 (CaASRF1-silenced) 고추식물(TRV : CaASRF1)에서 덜 강하게 발현되었다. 따라서, 우리는 우리의 표현형 분석에서 이들 CaASRF1-silenced 고추 식물을 사용했다. 우리의 이전 연구는 비 생물적 스트레스에 의해 유도 된 여러 고추 RING finger type E3 ligases의 기능이 스트레스 반응의 조절과 관련이 있음을 밝혀냈다.

도 2b에 나타낸 바와 같이, 가뭄 스트레스에 대한 CaASRF1의 기능을 조사하기 위해, 우리는 대조 식물 및 CaASRF1-silenced 고추식물을 가뭄 스트레스를 10 일 동안 물을 주지 않고, 그 후 1 일 동안 다시 물을 주어 처리했다. 도 2b의 왼쪽 패널에 나타낸 바와 같이, 물을 잘 준 조건 하에서는, CaASRF1-silenced 식물과 대조 식물 사이에 표현형상의 차이점을 관찰하지 못했다. 그러나, 도 2b의 가운데 및 오른쪽 패널에 나타낸 바와 같이, 가뭄 스트레스 조건과 그 후 다시 물을 준 조건에서는, CaASRF1-silenced 식물은 대조 식물보다 더 시들어 진 표현형을 보였다.

더 나아가 도 2c에 나타낸 바와 같이, 다시 물을 준 후에 CaASRF1-silenced 식물의 생존율 33 % 였고, 대조식물은 약 99 %였다.

도 2d에 나타낸 바와 같이, CaASRF1-silenced 식물에 의해 나타나는, 가뭄에 민감한 표현형(drought-sensitive phenotype)이 변경된 수분보습력(water retention capacity)에서 파생되었는지 여부를 평가하기 위해 분리 된 장미 잎의 생중량을 측정했다. 잎의 생중량은 대조 식물에서보다 CaASRF1-silenced 식물에서 현저히 낮았다.

이전 연구는 ABA 민감도가 변경된 수분 유지에 영향을 준다는 것을 보여주었다. 그래서 ABA 처리 후 잎 온도와 기공 구멍을 측정해보았다. (도 2e와 2f). 도 2e에 나타낸 바와 같이, CaASRF1-silenced 식물의 잎 온도는 대조 식물의 잎 온도보다 낮았다. 변경된 잎 온도는 기공 운동의 변화로 인해 야기되며, 이는 증발 냉각의 증가 또는 감소를 초래한다. 그러므로 우리는 ABA 처리 전후에 기공의 크기를 측정 하였다. ABA가 없는 경우, 기공 구경은 대조 식물과 CaASRF1-silenced 식물 간에 차이가 없었다. 그러나 도 2f에 나타낸 바와 같이, ABA 처리 후, CaASRF1-silenced 식물의 기공 구경은 대조 식물의 기공 구경보다 컸다.

실험예 4. CaASRF1가 과발현된 (CaASRF1-OX) 형질 전환 애기 장대 식물의 향상된 ABA 감수성

CaASRF1-silenced 고추 식물은 가뭄에 민감하고 ABA에 민감하지 않은 표현형을 나타냈다. 따라서 우리는 ABA와 가뭄 스트레스에 대한 CaASRF1의 생물학적 기능을 평가하기 위해 추가 유전 분석을 수행했다. 우리는 CaASRF1가 과발현된(CaASRF1-OX) 형질 전환 애기 장대 식물을 생성한 후 유전적 분석에 사용했다. 먼저, 우리는 상기 실시예 1-7에 따른 반 정량적 RT-PCR 분석(semi-quantitative RT-PCR assay)을 사용하여 CaASRF 과 발현을 검사했다.

도 3a에 나타낸 바와 같이, 우리는 두 개의 독립적인 T3 homozygous 형질 전환 계통에서 CaASRF1 전사체의 발현을 검출 하였지만 야생형(Wild-type , WT) 식물에서는 그렇지 않았다.

ABA 신호 전달과 CaASRF1의 관련성을 밝히기 위해, 우리는 ABA에 반응한 CaASRF1-OX 식물의 표현형 분석을 수행했다. ABA가 매개하는 분자 반응은 종자휴면(seed dormancy)에 있어서 중요하다.

따라서 도 3b 및 3c에 나타낸 바와 같이, 발아 단계에서 야생형과 형질 전환 식물을 비교했다. ABA가 없는 경우 야생형과 CaASRF1-OX 종자간에 발아율에 다른 현저한 차이가 없다는 결론을 얻었다. 그러나, 점차 증가하는 ABA 농도의 존재 하에서, 야생형 및 형질 전환 식물의 발아율은 점차 감소되었다. 또한, CaASRF1-OX 종자의 발아율은 야생 종자의 발아율보다 상당히 낮았다.

도 3d, 3e 및 3f에 나타낸 바와 같이, ABA에 반응하는 야생형과 CaASRF1-OX 식물의 입모와 뿌리 성장을 조사했다. 발아율과 비슷하게, CaASRF1-OX 식물의 입모와 뿌리의 성장률은 야생 식물보다 현저히 낮았다. 이에 따른 결과는 CaASRF1 발현이 발아 및 발아 발달 단계에서 ABA 반응에 영향을 미친다는 것을 나타낸다.

실험예 5. CaASRF1가 과발현된 (CaASRF1-OX) 형질 전환 애기 장대 식물의 향상된 가뭄 내성

가뭄 저항성에 대한 CaASRF1 과 발현의 영향을 조사하기 위해, 우리는 가뭄 스트레스 조건 하에서 야생형(Wild-type , WT) 및 CaASRF1-OX 식물을 사용하여 더 많은 상기 실시예 1-9에 따른 표현형 분석을 수행했다.

도 4a에 나타낸 바와 같이, 물을 잘 준 조건 하에서 CaASRF1-OX 식물과 야생형 식물사이에 표현형의 차이를 관찰하지 못했다(도 4a, 왼쪽 패널). 그러나 상기 식물들에게 10 일 동안 물을 주지 않은 후 2 일 동안 다시 물을 주어 가뭄 스트레스를 주었을 때, CaASRF1-OX 식물은 야생형 식물보다 시든 표현형이 적었다 (도 4a, 중간 및 오른쪽 패널). 또한 도 4b에 나타낸 바와 같이, 다시 물을 준 후에는 CaASRF1-OX 식물은 62-98 %가 생존하였으나 야생형 식물은 1 %만이 성장을 재개했다.

도 4c에 나타낸 바와 같이, 변경된 수분보습력(water retention capacity)을 통해 CaASRF1-OX 식물에 의해 나타나는 가뭄에 견디는 표현형이 유도되는 지 여부를 알아보기 위해, 분리 된 장미 잎의 생중량을 측정했다. 잎의 생중량은 야생형 식물에서보다 CaASRF1-OX 식물에서 현저히 높았다.

도 4d, 4e 및 4f에 나타낸 바와 같이, CaASRF1-OX 식물체의 ABA 민감도를 조사하기 위해 잎 온도 (도 4d)와 기공 구멍 (도 4e 및 4f)을 측정했다. 그 결과, CaASRF1-OX 식물이 ABA에 과민성임을 알아냈다. 데이터는 CaASRF1-OX 식물에 의해 표현된 수분보습력의 향상된 능력은 ABA 과민성으로부터 유도되었으며, 이는 가뭄 저항성 표현형을 유도한다는 것을 시사한다.

도 4g에 나타낸 바와 같이, CaASRF1이 향상된 가뭄 저항성에서 기능하는 메커니즘을 밝히기 위해, 잎 분리를 통해 가뭄 스트레스를 받은 야생형 및 CaASRF1-OX 잎을 사용하여 여러 가지 스트레스 관련 유전자에 대한 상기 실시예 1-7에 따른 qRT-PCR 분석을 수행했다. 가뭄 저항성 표현형과 일치하여 RD29B, RD20, RD22 및 NCED3을 비롯한 스트레스 관련 유전자의 발현 수준은 야생형 식물보다 CaASRF1-OX 식물에서 현저히 높았다. 이를 통해, CaASRF1이 ABA 매개성 기공 폐쇄의 조절을 통해 가뭄 내성을 적극적으로 조절한다는 것을 알 수 있었다.

실험예 6. 고추 bZIP 전사 인자 (bZIP transcription factor) CaAIBZ1 유전자의 특성과, CaAIBZ1 유전자와 CaASRF1 유전자의 물리적 상호 작용

CaASRF1 표적을 확인하기 위해, CaASRF1과 고추 cDNA 라이브러리를 각각 미끼와 먹이로 사용하여 상기 실시예 1-3에 따른 효모 단백질 잡종 분석(Yeast two-hybrid assay, Y2H)을 수행했다.

도 5a에 나타낸 바와 같이, CaAIBZ1 (Capsicum annuum ASRF1-Interacting bZIP transcription factor 1)을 포함하여 여러 상호 작용 파트너 단백질(interacting partner proteins)을 분리했다.

도 5b 및 5c에 나타낸 바와 같이, CaASRF1과 대조적으로, CaAIBZ1 전사체의 발현 수준은 가뭄이나 NaCl에 의해 상승 또는 하향 조절되지 않았다(도 5b). 또한, 일시적 담배 식물(N. benthamiana) 의 상피 세포에서 35S : CaAIBZ1-GFP 융합 단백질의 발현은 핵에서만 GFP 신호를 생성 하였다 (도 5c).

도 5d , 5e 및 5f에 나타낸 바와 같이, CaAIBZ1이 CaASRF1의 표적인지를 결정하기 위해, 우리는 효모에서 CaASRF1과 함께 CaAIBZ1을 발현시켰다 (도 5d). 선택 배지에서 성장 분석을 통해 CaASRF1이 CaAIBZ1과 상호 작용 함을 나타내었다. 풀다운 분석(pull-down assay) (도 5e)과 상기 실시예 1-4 에 따른 이분자 형광 상보성 분석 (Bimolecular fluorescence complementation assay , BiFC) 분석 (도 5f)을 통해 이 상호 작용을 확인했다. CaASRF1 : VYNE와 CaAIBZ1: CYCE의 동시 발현은 핵에서 주로 황색 형광 (yellow fluorescence , YFP)을 나타내며 이는 DAPI 염색과 일치한다.

도 5g에 나타낸 바와 같이, CaASRF1이 CaAIBZ1와 유비퀴틴화하는지 여부를 결정하기 위해, 우리는 정제된 MBP-CaASRF1 및 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (glutathione S-transferase , GST)-CaAIBZ1 융합 단백질을 사용하여 상기 실시예1-6에 따른 시험관 내 유비퀴틴 분석(in vitro ubiquitination assay)을 수행 하였다. E1과 E2의 존재 하에서, CaASRF1은 CaAIBZ1을 폴리유비퀴틴화(polyubiquitinated)시켰다.

실험예 7. CaAIBZ1 유전자가 침묵된 (CaAIBZ1-silenced) 고추 식물의 향상된 가뭄 내성

CaAIBZ1의 생물학적 기능을 조사하기 위해 고추에서 상기 실시예 1-11에 따른 VIGS 분석을, 애기 장대에서는 과 발현 분석을 각각 수행했다.

도 6a에 나타낸 바와 같이, VIGS의 효능을 검증하기 위해 상기 실시예 1-7에 따른 반 정량적 RT-PCR 분석(semi-quantitative RT-PCR analysis)을 수행했다. CaAIBZ1의 발현 수준은 CaAIBZ1-silenced 고추 식물 (TRV : CaAIBZ1)이 대조 식물 (TRV : 00)보다 낮았다.

도 6b에 나타낸 바와 같이, 가뭄 스트레스에 대한 반응에서 CaAIBZ1의 기능을 조사하기 위해, 대조 식물(control pepper plant) 과 CaAIBZ1-silenced 고추 식물에게 우리는 11 일 동안 물을 주지 않았다가 1 일 동안 다시 물을 줌으로써 가뭄 스트레스를 주었다. 가뭄 스트레스 조건 및 그 후에 다시 물준 결과, CaAIBZ1-silenced 고추 식물은 대조 식물보다 덜 민감한 표현형을 보였다 (도 6b, 중간 및 우측 패널). 도 6c에 나타낸 바와 같이, 또한, 다시 물을 준 후에, CaAIBZ1-silenced 식물의 생존률은 대조 식물의 생존률보다 높았다.

다음으로, 도 6d에 나타낸 바와 같이, 분리 된 잎의 생중량을 측정하여 보습능력을 조사했다. 조사 된 모든 시점에서, 잎의 생중량은 대조군 식물에서보다 CaAIBZ1-silenced 식물에서 현저히 높았다.

마지막으로, 도 6e 및 6f에 나타낸 바와 같이, ABA 처리 전후 잎 온도와 기공 구멍을 측정하여 ABA 감수성의 차이를 평가했다. 대조 식물과 비교하여, CaAIBZ1-silenced 고추 식물은 ABA 과민성임을 알 수 있었다.

실험예 8. CaAIBZ1가 과발현된 (CaAIBZ1-OX) 형질 전환 애기 장대 식물의 감소된 ABA 감수성

비 생물적 스트레스에 반응하여 CaAIBZ1이 기능하는 메카니즘을 이해하기 위해 우리는 CaAIBZ1-OX 애기 장대 식물을 생성했다.

도 7a에 나타낸 바와 같이, 유전자 발현 분석 결과 CaAIBZ1 전사체가 2 개의 독립적인 T3 동형 접합체인 CaAIBZ1-OX 식물에서 유도되었지만 야생형 (Wild-type , WT) 식물에서는 그렇지 않았다.

ABA 신호 전달과 CaAIBZ1의 관련성을 조사하기 위해, 우리는 CaAIBZ1-OX 식물과 야생형 식물에서 발아율, 모종 설치 및 주요 뿌리 성장을 포함한 ABA 매개 반응을 분석했다. ABA가 없는 경우, 발아 및 묘목 단계에서 CaAIBZ1-OX와 야생형 식물 사이에 표현형 차이가 관찰되지 않았다.

그러나 ABA 처리 후 CaAIBZ1-OX 식물의 발아율(도 7b), 묘목 수립 (도 7c 및 7d)및 1 차 성장(도 7e 및 7f)은 야생형 식물보다 현저히 높았는데, 이는 CaAIBZ1 발현이 높을수록 ABA 반응에 영향을 미친다는 것을 암시한다.

실험예 9. CaAIBZ1가 과발현된 (CaAIBZ1-OX) 형질 전환 애기 장대 식물의 감소된 가뭄 내성

가뭄 저항성에 대한 CaAIBZ1 과발현의 영향을 조사하기 위해, 우리는 가뭄 스트레스 조건 하에서 야생형(Wild-type , WT) 및 CaAIBZ1-OX 식물을 사용하여 더 많은 표현형 분석을 수행했다.

도 8a에 나타낸 바와 같이, 물을 잘 준조건 하에서는 야생형과 CaAIBZ1-OX 식물 사이에 표현형의 차이를 관찰하지 못했다 (그림 8a, 왼쪽 패널). 그러나 가뭄 스트레스 조건과 다시 물을 준 후에 CaAIBZ1-OX 식물은 야생형 식물보다 더 시들어 진 표현형을 보였다 (그림 8a, 중간 및 오른쪽 패널)

도 8b에 나타낸 바와 같이, 다시 물을 준 후에, CaAIBZ1-OX 식물의 생존률은 야생형 식물의 생존률보다 낮았다. 또한, 도 8c에 나타낸 바와 같이, 가뭄에 민감한 표현형과 일치하여 분리된 장미 잎의 수분 손실은 야생형 식물에서보다 CaAIBZ1-OX 식물에서 상당히 높았다.

도 8d,8e 및 8f에 나타낸 바와 같이, CaAIBZ1-OX 식물에 나타나는 낮은 수분보습량이 변화된 ABA 민감도와 관련이 있는지를 결정하기 위해 잎 온도와 기공 간 구멍을 측정했다. ABA가 없는 경우, 우리는 잎 온도 또는 CaAIBZ1-OX와 야생형 식물 사이의 기공 구배에 상당한 차이는 없음을 확인했다. 그러나, ABA의 존재 하에서 잎 온도는 야생형 식물에서보다 CaAIBZ1-OX 식물에서 상당히 높았다 (도 8d). 또한, CaAIBZ1-OX 식물의 기공 구경은 야생형 식물의 기공 구경보다 훨씬 컸다 (도 8e 및 8f). 이는 CaAIBZ1-OX 식물에 의해 나타나는 ABA-감응 표현형(ABA-hyposensitive phenotype)이 수분보습량의 용량에 영향을 미치므로 가뭄 내성을 감소시킨다는 것을 뜻한다.

CaAIBZ1-OX 식물은 스트레스 관련 유전자의 증가된 발현 수준을 보였다. 따라서 도 8g에 나타낸 바와 같이, CaAIBZ1-OX 식물을 이용한 상기 실시예 1-7에 따른 qRT-PCR 분석을 통해 증가된 CaAIBZ1 발현이 스트레스 관련 유전자의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 여부를 조사 하였다. 가뭄에 민감한 표현형과 일관되게, 스트레스와 관련된, RD29B, RD22 및 NCED3을 포함한 일부 유전자의 발현은 야생형 식물보다 CaAIBZ1-OX 식물에서 현저히 낮았다 그러나 RD20 전사체 수준은 야생형 와 CaAIBZ1-OX 식물간에 상당한 차이는 없었다.

실험예 10. CaASRF1 와 CaAIBZ1이 함께 과발현된 유전자 변형 애기 장대 식물 (CaASRF1-OX / CaAIBZ1-OX transgenic Arabidopsis plants) 의 향상된 ABA 감수성

CaASRF1과 CaAIBZ1 사이의 기능적으로 상관관계가 있는지 조사하기 위해, 우리는 CaASRF1 / CaAIBZ1 이중 과발현 형질 전환 식물(CaASRF1/CaAIBZ1 double overexpressing transgenic plants)을 생성시켰다.

도 9a에 나타난 바와 같이, 이상적인 성장 조건에서는 야생형, CaASRF1-OX, CaAIBZ1-OX 및 CaASRF1-OX / CaAIBZ1-OX 식물간에 표현형 차이를 관찰하지 못했다. 그러나 ABA 처리 후 CaASRF1-OX / CaAIBZ1-OX 식물의 발아율은 야생형 식물의 발아율보다 현저히 낮았으며, CaASRF1이 발아 단계에서 CaAIBZ1의 전사 활성을 저해한다는 것을 알 수 있다.

도 9b에 나타난 바와 같이, 발아 단계에서 CaASRF1-OX / CaAIBZ1-OX 식물체의 ABA 과민성이 육묘 단계에서 유지되는지 여부를 확인하기 위해, 일차 뿌리 길이를 측정 하였다. 발아 분석과 일치하여, 1 차 뿌리 길이는 야생형 식물에서보다 CaASRF1-OX / CaAIBZ1-OX 식물에서 현저히 낮았다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Method for improving the resistance to drought stress using bZIP transcription factor CaAIBZ1 in plants <130> MP18-058 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1128 <212> DNA <213> Capsicum annuum ASRF1-Interacting bZIP transcription factor 1 - CaAIBZ1 <400> 1 atgaattctt caacatacac tcagttcgtt gcctcaagaa ggatgggtat atgcgagcca 60 ctacatcaaa ttggcatgtg ggatgatttc aatgccagtt gcccgagtac atcggcaaca 120 atgattctcg aagttgagaa atgcctagag gagcagatac ctattatgga gaaaagatta 180 gacaatgaga tagaagatac ttcgcatgga acagtaggga cttctaatag atatgaagca 240 gaaacaagta aacccatcga gaaggtactt cgacgtcttg cacaaaaccg tgaggctgct 300 cgtaaaagcc gtttgcggaa gaaggcctat gttcaacagt tagaaaatag taaattgaag 360 ctgattcaat tggaacaaga actagaacgg gccagaaaac agggtctgta tgtaggtggt 420 ggtttagatg ctagccagct aagttactct ggaactgcta gctcaggaac tgctgcattt 480 gatacggagt atggtcaatg ggtggaagag caaaatagac aaacaaatga tttaagaaat 540 gcattgtatc attctcaaat tagtgaagcg gatttacgcg ttatcgttga tggttgcctg 600 aaccactatt ctaatctctt ccgtattaag gctacggctg ctaaagatga tgtcctatat 660 atcatgtctg gcatgtggaa gacatcagca gagcgttttt tcatgtggat tggggggttt 720 cggccatccg agcttctaaa ggttctcaca ccacatcttc agctcttgac agaacaacaa 780 ctccgggagg tttgtaacct cacgcaatcg tgtcagcaag cagaagatgc cttgtcacaa 840 ggaatggtaa aactccatca gattcttgct gaggctattg cagctggccg actaggtgaa 900 ggaaattact ctcttccgca gatggggcct gccatcgaga agttggaagc tcttgttagg 960 ttcgtaaatc agcaggcaga tcatcttcgc caagaaaccc tccaacagat gtcccgcatc 1020 ctgaatacgc accaagcagc tcagggtttt cttgccttag gggaatactt cgaacgactt 1080 cgtgttttaa gctcacagtg ggctactcgt cttcgtgagc ctgcctaa 1128 <210> 2 <211> 375 <212> PRT <213> Capsicum annuum ASRF1-Interacting bZIP transcription factor 1 - CaAIBZ1 <400> 2 Met Asn Ser Ser Thr Tyr Thr Gln Phe Val Ala Ser Arg Arg Met Gly 1 5 10 15 Ile Cys Glu Pro Leu His Gln Ile Gly Met Trp Asp Asp Phe Asn Ala 20 25 30 Ser Cys Pro Ser Thr Ser Ala Thr Met Ile Leu Glu Val Glu Lys Cys 35 40 45 Leu Glu Glu Gln Ile Pro Ile Met Glu Lys Arg Leu Asp Asn Glu Ile 50 55 60 Glu Asp Thr Ser His Gly Thr Val Gly Thr Ser Asn Arg Tyr Glu Ala 65 70 75 80 Glu Thr Ser Lys Pro Ile Glu Lys Val Leu Arg Arg Leu Ala Gln Asn 85 90 95 Arg Glu Ala Ala Arg Lys Ser Arg Leu Arg Lys Lys Ala Tyr Val Gln 100 105 110 Gln Leu Glu Asn Ser Lys Leu Lys Leu Ile Gln Leu Glu Gln Glu Leu 115 120 125 Glu Arg Ala Arg Lys Gln Gly Leu Tyr Val Gly Gly Gly Leu Asp Ala 130 135 140 Ser Gln Leu Ser Tyr Ser Gly Thr Ala Ser Ser Gly Thr Ala Ala Phe 145 150 155 160 Asp Thr Glu Tyr Gly Gln Trp Val Glu Glu Gln Asn Arg Gln Thr Asn 165 170 175 Asp Leu Arg Asn Ala Leu Tyr His Ser Gln Ile Ser Glu Ala Asp Leu 180 185 190 Arg Val Ile Val Asp Gly Cys Leu Asn His Tyr Ser Asn Leu Phe Arg 195 200 205 Ile Lys Ala Thr Ala Ala Lys Asp Asp Val Leu Tyr Ile Met Ser Gly 210 215 220 Met Trp Lys Thr Ser Ala Glu Arg Phe Phe Met Trp Ile Gly Gly Phe 225 230 235 240 Arg Pro Ser Glu Leu Leu Lys Val Leu Thr Pro His Leu Gln Leu Leu 245 250 255 Thr Glu Gln Gln Leu Arg Glu Val Cys Asn Leu Thr Gln Ser Cys Gln 260 265 270 Gln Ala Glu Asp Ala Leu Ser Gln Gly Met Val Lys Leu His Gln Ile 275 280 285 Leu Ala Glu Ala Ile Ala Ala Gly Arg Leu Gly Glu Gly Asn Tyr Ser 290 295 300 Leu Pro Gln Met Gly Pro Ala Ile Glu Lys Leu Glu Ala Leu Val Arg 305 310 315 320 Phe Val Asn Gln Gln Ala Asp His Leu Arg Gln Glu Thr Leu Gln Gln 325 330 335 Met Ser Arg Ile Leu Asn Thr His Gln Ala Ala Gln Gly Phe Leu Ala 340 345 350 Leu Gly Glu Tyr Phe Glu Arg Leu Arg Val Leu Ser Ser Gln Trp Ala 355 360 365 Thr Arg Leu Arg Glu Pro Ala 370 375

Claims (5)

1. 삭제
2. 삭제
3. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CaAIBZ1 (Capsicum annuum ASRF1-Interacting bZIP transcription factor 1) 유전자의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물로서,
   상기 억제제는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 CaAIBZ1 단백질을 코딩하는 유전자 서열을 포함하는 재조합 VIGS(Virus Induced Gene Silencing) 벡터인 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
4. 하기의 단계를 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법:
   (a) CaAIBZ1 단백질을 암호화하는 서열번호 1의 유전자를 식물체에 형질전환 하는 단계; 및
   (b) 상기 형질전환 된 식물체에서 CaAIBZ1 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 단계.
   
5. 제4항의 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체.
   

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