KR101840044B1 - 고추 녹광 품종 유래 E3 ligase CaDTR1을 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고추 유래 신규 CaDTR1(Capsicum annuum Drought Tolerance RING 1) 유전자/단백질, 및 이를 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 건조 스트레스에 대한 저항성 증진 단백질을 암호화하는 CaDTR1 유전자를 규명하였으며, CaDTR1 단백질이 ABA 신호전달의 양성 조절자로 기능하며 상기 단백질이 과발현된 형질전환 식물체에서 건조 스트레스 저항성 증진 효과를 확인하였는바, CaDTR1 유전자의 발현 조절을 통해 인류가 이용할 수 있는 작물 등의 개량에 활용할 수 있으며, 특히 식물의 생산성을 향상시키는데 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

고추 녹광 품종 유래 E3 ligase CaDTR1을 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법 {Method for improving the resistance to the drought stress using pepper E3 ligase, CaDTR1, in plants}

본 발명은 고추 녹광 품종 유래 신규 CaDTR1(Capsicum annuum Drought Tolerance RING 1) 유전자/단백질, 및 이를 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

지구온난화는 극심한 기후 변화를 야기하여 식물들의 정상적인 생장 및 발달을 저해하는 환경적 스트레스를 유발하며, 이에 대하여 식물체는 추위, 고염, 및 가뭄과 같은 불리한 환경에서 생존하기 위한 정교한 방어기작을 진화시켜왔다. 예컨대, 가뭄(drought)은 수분 부족 환경에 의해 일어나며 식물의 정상적인 성장에 심각한 영향을 미쳐 결국 곡물의 수확량 감소를 초래하는데, 식물은 이러한 건조 스트레스에 적응하기 위해 기공폐쇄, 앱시스산(abscisic acid; 이하 ABA)의 합성 및 축적과 같은 다양한 방어 기작을 활성화시킨다.

ABA는 비생물적 스트레스 특히, 건조 스트레스에 대하여 식물을 보호하기 위한 조절인자이며, 식물 생장 및 발달에 매우 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. ABA 신호는 삼투 적응 및 뿌리 수리 전도도(hydraulic conductivity)의 조절에 관여하는 전사인자와 E3 리가아제(E3 ligase)와 같은 다양한 스트레스 관련 유전자들의 발현을 조절다고 알려져 있으나, 완전한 ABA 신호전달 경로는 아직 규명되지 않았다. 식물세포에서 ABA 신호전달 개시를 위해서는 ABA 수용체가 존재해야 하고 신호를 하위 단백질로 전달해야한다. 현재까지 ABA 수용체로써 PYR/PYL/RCARs가 ABA를 인식하는 역할을 한다고 알려져 있다. 수용체가 ABA를 인식하면 SnRK2(non-fermenting 1-related subfamily 2) 단백질 인산화효소(kinase) 및 PP2Cs(type 2C protein phosphatases) 각각에 의해 하위 단백질이 인산화 및 탈인산화 된다. SnRK2.2, SnRK2.3, 및 SnRK2.6(OST1)와 같은 SnRK2 인산화효소는 ABA 신호전달의 양성 조절자로써 기능하고, 이와 반대로 group A PP2Cs 인산가수분해효소는 ABA의 음성 조절자 기능을 하며, ABA 수용체인 PYR/PYL/RCAR 단백질들은 group A PP2Cs과 상호작용하여 이들의 활성을 억제한다고 보고되어 있다. PYR/PYL/RCAR에 의해 ABA 발현 증가가 인식되면 단백질 인산가수분해효소-인산화효소 상호작용이 억제되고, SnRK2 type 인산화효소 분비가 유도된다. SnRK2 인산화효소는 전사인자 및 SLAC1 음이온 채널을 포함하는 표적 단백질의 인산화를 통해 특정 유전자들의 발현 및 이온 채널 활성화를 촉진시키며, 이는 식물체가 불리한 환경에 적응할 수 있도록 한다.

한편, 유비퀴틴화(ubiquitination) 경로를 통한 단백질 분해는 식물체가 비생물적 스트레스에 대한 적응 및 방어 반응을 조절하기 위한 중요한 기작 중 하나이다. 유비퀴틴화는 E1(ubiquitin activating enzyme), E2(ubiquitin-conjugating enzyme) 및 E3(ubiquitin ligase)로 구성되는 3가지 효소의 연속적인 작용에 의해 일어나는 중요한 번역 후 조절과정이다. 유비퀴틴이 E1에 의해 활성화되면, 활성화된 유비퀴틴은 E2로 전달되고 E3 리가아제가 유비퀴틴과 표적 단백질을 결합시킨다. 이러한 과정에서 E3 리가아제가 표적 단백질을 결정하고 이에 결합한다.

유비퀴틴화는 세포 내 고유 기작이며, 진핵세포에서 다양한 표적 단백질에 따라 수백 또는 수천 개의 E3 리가아제가 존재한다고 알려져 있다. E3 리가아제는 서브유닛 구성에 따라 두 가지 타입으로 분류되는데, RING(really interesting new gene), HECT(homology to E6-AP C-terminus), 및 PUB(plant U-box) E3 리가아제는 단일 서브유닛으로 구성되는 반면, SCF(Skp(S-phase kinase-associated protein)/cullin/F-box) 및 CUL4-DDB1(CULLIN4-damaged-specific DNA binding protein1)는 다중 서브유닛으로 구성된다. 최근, 애기장대(Arabidopsis) 식물에 1,400 종 이상의 E3 리가아제가 존재한다고 보고되었으며, 애기장대 게놈은 242개의 RING E3 리가아제를 암호화하고, RING E3 리가아제가 생물 및 비생물적 스트레스에 대한 적응에 관여한다고 보고되었다. RING E3 리가아제는 벼(Oryza sativa), 옥수수(Zea mays), 고추(Capsicum annum) 및 애기장대(Arabidopsis thaliana)와 같은 다양한 외떡잎 및 쌍떡잎 식물에서 ABA 신호전달 및 비생물적 스트레스에 반응하여 양성 또는 음성 조절자로써 역할을 한다고 알려져 있으며, 이는 식물체에서 널리 보존되어 있음을 의미한다(Plant Biotechnol J 11, 432-445). 최근에는, RING type E3 리가아제인 RSL1이 세포막에서 PYR1 및 PYL4과 같은 ABA 수용체의 유비퀴틴화를 통한 분해에 관여하고, CRL4-type E3 리가아제 복합체는 PYL8 ABA 수용체를 분해한다고 보고되었다.

이와 같이, 많은 식물체를 이용하여 E3 리가아제가 ABA 신호전달 경로를 통해 건조 스트레스 반응에 관여하는지 연구되고 있으나, 그 결과는 아직 미비한 실정이다.

본 발명자들은 ABA 신호전달 경로 조절을 통한 건조 스트레스 반응간의 관련성을 알아보기 위해 연구하던 중, 고추녹광 품종에서 C3HC4-type RING finger E3 리가아제인 CaDTR1(Capsicum annuum Drought Tolerance RING 1) 유전자를 동정하였으며, 상기 유전자가 과발현되면, 식물의 건조 스트레스 저항성을 증진시킨다는 것을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은 신규의 CaDTR1 유전자 및/또는 단백질, 및 상기 유전자 또는 단백질을 유효성분으로 포함하는 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 CaDTR1 유전자를 식물체에 형질전환하여 과발현시킴으로써 식물체의 건조 스트레스 저항성을 증진시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 건조 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 단백질을 암호화하며, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CaDTR1(Capsicum annuum Drought Tolerance RING 1) 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 CaDTR1 단백질을 유효성분으로 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법을 제공한다.

(a) CaDTR1(Capsicum annuum Drought Tolerance RING 1) 단백질을 암호화하는 서열번호 1의 유전자를 식물체에 형질전환 하는 단계; 및

(b) 상기 형질전환된 식물체에서 CaDTR1 단백질을 과발현시키는 단계.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명은 건조 스트레스에 대한 저항성 증진 단백질을 암호화 하는 신규 CaDTR1 유전자를 동정하였으며, CaDTR1 단백질은 ABA 신호전달의 양성 조절자로 기능하며 상기 단백질이 과발현된 형질전환 식물체에서 건조 스트레스 저항성 증진 효과를 확인하였는바, CaDTR1 유전자의 발현 조절을 통해 인류가 이용할 수 있는 작물 등의 개량에 활용할 수 있으며, 특히 식물의 생산성을 향상시키는데 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 CaDTR1의 아미노산 서열 분석을 실시한 결과로, 도 1A는 계통수 분석 결과를 나타낸 도면으로 CaDTR1과 다른 식물종 (Solanum lycopersicum, Solanum tuberosum, Nicotiana sylvestris, Glycine max, 및 Arabidopsis thaliana)간의 아미노산 서열을 비교한 결과이고, 도 1B는 계통 분석 결과를 나타낸 것이며, 도 1C는 RING zinc finger C3H2C3-type 도메인의 정렬 결과를 나타낸 것이다.
보존된 cysteine(C) 및 histidine(H) 잔기는 붉은색으로 표시되었다.
도 2는, CaDTR1의 RING, TM1, 및 TM2 도메인 분석결과로, 다른 식물종 (Solanum lycopersicum, Solanum tuberosum, P. mume, 및 M. domestica)에서 상기 도메인 간 아미노산 서열을 비교한 결과이다.
도 3은 ABA, 건조, 고염 스트레스 조건에서, 시간에 따른 CaDTR1 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 4는 CaDTR1 단백질의 식물 세포 내 위치를 확인하기 위하여 CaDTR1-GFP 융합단백질의 형광 신호를 공초점 현미경을 관찰한 결과이다.
도 5는 건조 스트레스 조건에서, TRV:CaDTR1 삽입에 의해 CaDTR1이 침묵된 고추 및 빈벡터 (TRV:00)가 삽입된 대조군 사이의 (A) CaDTR1 발현, (B) 표현형, (C) 생존율, (D) 생중량, (E) 잎의 온도, 및 (F)/(G) 기공개도를 비교한 결과이다.
도 6은 CaDTR1 과발현 식물 및 대조군 (야생형, WT) 식물의 RT-PCR 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 ABA 처리 조건에서, CaDTR1 과발현 식물 (CaDTR1-OX, #1, #2)과 대조군 (야생형, WT) 식물간 (A) 발아율, (B)/(C) 녹색 자엽 비율, 및 (D)/(E) 뿌리의 성장을 비교한 결과이다.
도 8은 건조 스트레스 및 ABA 처리 조건에서, CaDTR1 과발현 식물 (CaDTR1-OX, #1, #2)과 대조군 (야생형, WT) 대조군 (야생형, WT) 식물을 비교한 결과로, 건조 조건에서 CaDTR1 과발현 식물 (CaDTR1-OX, #1, #2)과 대조군 (야생형, WT) 간 (A) 표현형, (B) 생존율, (C) 생중량을 비교한 결과이고, ABA 처리 조건에서 (D) 잎의 온도, 및 (E)/(F) 기공개도를 비교한 결과이며, 건조 스트레스 처리 조건에서 (E) CaDTR1 과발현 식물 (CaDTR1-OX)과 대조군(야생형, WT) 간의 DREB2A, NCED3, RD29A 및 KIN2의 발현을 확인한 결과이다.

본 발명자들은, ABA 신호전달의 양성 조절자로 기능하는 RING type E3 리가아제인 CaDTR1 유전자를 동정하였고, 상기 유전자가 과발현된 형질전환 애기장대 식물체에서 건조 스트레스에 대한 저항성 증가를 확인함으로써 본 발명은 완성하였다.

이에, 본 발명은 본 발명은 건조 스트레스에 대한 양성 조절인자(positive regulator) 단백질을 암호화하는, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CaDTR1(Capsicum annuum Drought Tolerance RING 1) 유전자를 제공한다.

본 발명의 유전자인 CaDTR1은 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어져 있으며, 상기 CaDTR1 유전자에 의해 암호화되는 펩타이드는 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 "양성 조절인자(positive regulator) 단백질"이란 생명현상 조절에서 증가방향으로 작용하는 단백질을 의미한다. 즉, 본 발명의 유전자인 CaDTR1이 과발현되는 경우, ABA 민감도 증가, 및 건조 스트레스에 대한 저항성이 증가될 수 있다.

본 발명자들은 건조 스트레스 반응에 관여하는 유전자에 대해 연구하던 중, E3 리가아제 단백질인 CaDTR1을 동정하였고(실시예 2 참조), 상기 CaDTR1이 ABA, 건조, 및 고염 조건에서 증가하는 것을 확인하였으므로, 상기 단백질이 ABA 건조 스트레스 반응과 관련이 있는지 그 연관성을 규명하고자 하였다.

우선, 본 발명의 일실시예에서는, ABA, 건조, 또는 고염 처리한 고추 식물 잎에서 CaDTR1 유전자의 발현이 증가하는 것을 확인하였다(실시예 3 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, CaDTR1 단백질이 핵에서 발현되는 것을 GFP 형광을 통해 확인하였다(실시예 4 참조). 본 발명의 다른 실시예에서는, VIGS (Virus Induced Gene Silencing) 기법으로 CaDTR1 유전자를 침묵시킨 고추 식물의 경우, ABA에 대한 민감성 감소에 의하여 기공이 열려 증산률이 증가되고, 결과적으로 건조 스트레스에 대한 내성 (저항성)을 상당히 감소시킴을 확인하였다 (실시예 5 참조). 또한, 애기장대에서 CaDTR1 유전자를 과발현시킨 결과, 발아기, 유묘기 단계에서 ABA에 대한 감수성을 증가시킬 뿐만 아니라, 건조, 삼투, 고염 스트레스에 대한 저항성을 현저하게 증진시킴을 확인함으로써, CaDTR1 단백질이 ABA 신호전달의 양성 조절자 역할을 수행한다는 사실을 규명하였다 (실시예 6 및 7 참조).

따라서, CaDTR1 단백질의 발현 또는 활성을 증가시킴으로써 식물체의 건조 스트레스에 대한 내성(저항성)을 증진시킬 수 있으며, 이에, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 CaDTR1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 식물체의 건조 저항성 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 식물(체)는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류 등일 수 있으며, 가장 바람직하게는 애기장대 또는 고추이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험준비 및 실험방법

1-1. 식물 재료 및 성장 조건

고추녹광(Capsicum annuum L., cv. Hanbyul) 및 담배(Nicotiana benthamiana) 종자는 증기 소독된 배합토(피트모스(peat moss):펄라이트(perlite):질석(vermiculite)=5:3:2, v/v/v), 사토(sand), 및 양토(loam soil)를 1:1:1(v/v/v)로 섞고 파종하였다. 이후 고추 식물은 하루에 16시간 동안 백색 형광등 세기 80 μmol photons m^-2S^-1로 빛을 비춘 27±1℃ 방에서 성장시켰고, 담배 식물은 16시간 낮/8시간 밤 사이클, 25±1℃ 온도로 설정한 챔버에서 성장시켰다. 애기장대(Arabidopsis thaliana: ecotype Col-0) 종자는 1% 수크로오스 및 Microagar(Duchefa Biochemie)가 보충된 MS(Murashige and Skoog) salt에서 발아시켜, 16시간 낮/8시간 밤 사이클, 24℃ 온도로 설정한 챔버에서 성장시켰다. 애기장대 묘목은 증기 소독된 배합토(피트모스(peat moss):펄라이트(perlite):질석(vermiculite)=9:1:1, v/v/v)에서 24℃ 온도, 60% 습도, 16시간/8시간의 낮/밤 사이클 조건으로 형광등(130 μmol photons m^-2s^-1) 빛에서 성장시켰다. 모든 종자는 챔버에 파종하기 전에 2일 동안 4℃에서 춘화처리(vernalized)를 하였다.

1-2. 서열 분석(Sequence analysis)

CaDTR1에 대한 추정되는 아미노산 서열 및 이의 상동 서열은 BLAST searches (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)를 사용하여 얻었다. SMART (http://smart.embl6heidelberg.de/) 및 TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) 웹 서버는 RING 및 transmembrane domain의 인식에 사용되었다. 이에 더하여 소수성 플롯은 PROTSCALE (http://web.expasy.org/protscale)로 작성되었다. 아미노산 서열 정렬은 CLUSTALW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2)를 사용하여 수행하였고, 결과는 Genedoc software (http://www.nrbsc.org/gfx/genedoc)를 사용하여 편집하였다.

1-3. Ca AINR1 유전자가 과발현된 형질전환 애기장대 제조

전장 CaDTR1 cDNA를 pK2GW7 binary vector에 삽입하여 애기장대에서 CaMV(cauliflower mosaic virus) 35S 프로모터의 조절 하에 CaDTR1 유전자의 과발현을 유도하였다. The CaDTR1 binary vector는 Agrobacterium tumefaciens strain GV3101로 변형되었다. CaDTR1 과발현 형질전환체를 선별하기 위해, 형질전환된 것으로 추정되는 식물로부터 종자를 얻어 Kanamycin 50 ㎍/mL을 함유하는 MS 한천 플레이트상에 플레이팅하였다.

1-4. 세포 내 위치 분석(Subcellular localization analysis)

종결코돈이 없는 CaDTR1 유전자의 암호화 영역을 GFP가 삽입되어 있는 p326GFP 바이너리 벡터(binary vector)에 삽입하였다. 각각의 컨스트럭트를 운반하는 아그로박테리움 균주 GV3101을 p19 균주와 1:1 비율로 혼합한 후(OD600 = 0.5), 5주 된 담배(N. benthamiana) 식물체의 완전히 자란 잎에 함께 침투시켰다. 2일 후 잎 조각을 잘라 아래쪽의 표피세포를 LSM Image Browser software가 설치된 공초점 현미경(510 UV/Vis Meta; Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 관찰하였다.

1-5. Virus-induced gene silencing (VIGS)

고추에서 CaDTR1 유전자를 침묵(knockdown) 시키기 위해 담배얼룩바이러스(tobacco rattle virus: TRV) 기반 VIGS(virus-induced gene silencing) 시스템을 이용하였다. 보다 구체적으로, CaDTR1 cDNA의 420-630-bp 단편을 pTRV2 벡터에 삽입하고, 전기천공법(electroporation)을 이용하여 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens) 균주 GV3101 내로 상기 벡터를 도입하였다. 그리고 각각 pTRV1, pTRV2:00, 및 pTRV2:CaDTR1을 운반하는 아그로박테리움 균주 GV3101을 고추의 완전히 자란 자엽(fully expanded cotyledons)에 침투시켰다(각 균주별 OD₆₀₀=0.2). 식물체들은 생장 및 바이러스가 증식할 수 있도록 16시간 낮/8시간 밤으로 광주기를 설정한 24℃의 생육실에 두었다.

1-6. ABA 및 건조 스트레스에 대한 표현형 분석

애기장대 식물 묘목의 발아율은 야생형 및 35S:CaDTR1 형질전환 애기장대의 종자 100개를 다양한 농도의 ABA가 처리된 MS 한천 배지 플레이트에 파종하고 7일 후 발아된 종자의 개수를 세어 측정하였다.

뿌리 성장 측정은 발아 후 측정된 것으로, 발아된 종자는 다양한 농도의 ABA로 처리된 MS 한천 배지 플레이트에 옮긴 후 뿌리의 길이를 측정했다.

건조 저항성 측정은 야생형 및 CaDTR1 과발현인 1주된 묘목을 배양토(9:1:1 ratio of peat moss, perlite, 및 vermiculite)에 무작위로 심고, 2주간 일반적인 조건으로 관수하여 성장시켰다. 건조스트레스 적용을 위해서 관수를 중단하여 건조 스트레스를 준 후, 고추 잎을 회수한 후, 상기 잎의 물 손실량을 측정하였다.

잎에서 손실되는 물의 양을 측정하기 위해서, 3주된 식물로부터 10개의 잎을 떼낸 뒤 페트리 접시(petri-dish)에 놓고 상기 페트리 접시를 40% 상대 습도의 성장 챔버에 두고 정해진 시간에 생중량의 손실을 측정하였으며, 실험은 3번 반복 수행하였다.

1-7. 기공개도(Stomatal aperture)의 생물학적 검정

기공개도의 생물학적 검정을 위해, 3주된 애기장대 식물체의 로제트 잎에서 잎의 껍질을 분리하고, 아그로박테리움을 감염시키고 10일째인 고추 식물체의 1차 및 2차 잎을 수확하여 빛이 있는 조건으로 기공 개구 용액(stomatal opening solution, SOS: 50 mM KCl, 10 mM MES-KOH, pH 6.15, 10 μM CaCl₂) 위에 띄웠다. 3시간 동안 배양한 후, 상기 용액을 다양한 용량의 ABA가 함유된 SOS 용액으로 교체하고, 3시간을 더 배양하였다. 이후 Nikon eclipse 80i microscope를 이용해 각 샘플에서 임의적으로 100개의 기공을 관찰하였으며, Image J 1.46r를 이용해 기공의 넓이와 길이를 측정하였다. 상기 실험은 각각 세 번 독립적으로 수행하였다.

1-8. RNA 추출 및 qRT-PCR

건조 스트레스를 주거나 ABA를 처리한 애기장대 및 고추 식물의 잎으로부터 총 RNA를 추출하여 qRT-PCR을 실시하였다. 상기 식물체의 잎으로부터 추출한 RNA 1 μg에 대하여 Transcript First Strand cDNA Synthesis kit(Roche, Indianapolis, IN, USA)를 사용해 cDNA를 합성하였다. Semi-quantitative RT-PCR 분석은 Extaq DNA polymerase와 특이적인 프라이머를 사용하여 수행하였다. qRT-PCR 분석을 위해, 상기 방법으로 합성한 cDNA를 iQ™SYBR Green Supermix 및 하기 표 1에 나타낸 특이적 프라이머와 함께 CFX96 Touch™ Real-Time PCR detection system(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 증폭시켰다. 모든 반응은 세 번 반복하여 수행하였고, 각 유전자의 상대적인 발현량은 ΔΔCt 방법으로 계산하였으며, 애기장대 액틴8(Arabidopsis actin8; AtACT8) 유전자 및 고추 액틴 1(CaACT1 ) 유전자를 정규화를 위해 사용하였다.

Primer name	Primer sequence (5'-3')
For cloning
CaDTR1	Forward (서열번호 3)	ATGCAGAAGTCAACTGCTACGGCA
	Reverse (서열번호 4)	CTAACCAAACAAATATAGGAATACAAGAA
For RT-PCR
CaDTR1	Forward (서열번호 5)	GGTAACTTTACAATGTCTGCTGGTT
	Reverse (서열번호 6)	AACTTCAGATTATTGTCTGCCTGTC
CaACT1	Forward (서열번호 7)	GACGTGACCTAACTGATAACCTGAT
	Reverse (서열번호 8)	CTCTCAGCACCAATGGTAATAACTT
Actin8	Forward (서열번호 9)	CAACTATGTTCTCAGGTATTGCAGA
	Reverse (서열번호 10)	GTCATGGAAACGATGTCTCTTTAGT
NCED3	Forward (서열번호 11)	ACATGGAAATCGGAGTTACAGATAG
	Reverse (서열번호 12)	AGAAACAACAAACAAGAAACAGAGC
DREB2A	Forward (서열번호 13)	CTACAAAGCCTCAACTACGGAATAC
	Reverse (서열번호 14)	AAACTCGGATAGAGAATCAACAGTC
RD29A	Forward (서열번호 15)	CACAATCACTTGGCTCCACTGTTG
	Reverse (서열번호 16)	ACCTAGTAGCTGGTATGGAGGAACT
KIN1	Forward (서열번호 17)	TGTTAACTTCGTGAAGGACAAGAC
	Reverse (서열번호 18)	AAGTTTGGCTCGTCTAATAATTTTG

1-9. 열 영상법(Thermal imaging)

완전히 자란 1차 및 2차 잎을 가진 4주 된 고추 식물 및 3주 된 애기장대 식물에 50 μM ABA를 처리하거나 물주기를 중단하여 건조 스트레스를 주었다. 열 영상은 infrared camera(FLIR systems; T420)을 이용하여 얻었으며, 식물의 잎 온도는 FLIR Tools+ ver 5.2 software를 이용해 측정하였다.

1-10. 재조합 단백질의 정제

박테리아 세포에서 maltose-binding protein(MBP)-CaDTR1Δ1-573 및 MBP-CaDTR1Δ1-573 H863Y/C867S 재조합 단백질을 발현시키기 위하여, 전장 CaDTR1 cDNA 서열을 pMAL-c2X 벡터(New England BioLabs) 내로 삽입하고, 상기 벡터를 대장균 균주 C+ 세포 내로 도입하였다. 이후 MBP-CaDTR1 융합 단백질 발현을 유도한 후 제조사의 프로토콜에 준하여 단백질을 정제하였다.

1-11. Cell-free degradation 및 in vitro ubiquitination assay

In vitro self-ubiquitination assay를 위해, 상기 실시예 1-8에서 정제된 MBP-CaDTR1 재조합 단백질(500 ng)을 재조합 인간 UBE1(Boston Biochemiclas, Cambridge, MA, USA), his로 표지된 재조합 애기장대 E2s, 및 소 유비퀴틴(Sigma-Aldrich)을 포함하는 유비퀴틴화 반응(Ubiquitination reaction) 완충 용액[50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM MgCl₂, 0.05 mM ZnCl₂, 1 mM Mg-ATP, 0.2 mM DTT, 10 mM phosphocreatine, 및 0.1 unit of creatine kinase(Sigma- Aldrich)]과 혼합한 후 30℃에서 3시간 동안 배양하였다.

실시예 2. Ca DTR1 유전자 분리 및 서열 분석

Differential hybridization 분석으로 건조스트레스를 처리한 고추 잎에서 얻은 cDNA 라이브러리로부터 CaDTR1 (accession no.KT361852) cDNA를 추출하였다. 건조스트레스를 처리한 고추 잎에서, CaDTR1 유전자의 발현 증가를 확인하였다.

CaDTR1 cDNA는, 660bp ORF (open reading frame)을 포함하고, 219개의 아미노산 잔기를 포함하며, 이들은 23.7 kD의 분자량, 6.57의 등전점을 갖는 것으로 추정되었다(도 1A).

CaDTR1 유전자는 N-말단에 C3HC4-type RING finger 도메인(26-67 aa) 및 C-말단에 two transmembrane(TM) 도메인(137-159, 201-218 aa)을 포함하는 단백질을 암호화하며, 상기 도메인들은 Ub/26S proteasome system 및 세포내 위치에서 E3 리가아제 활성에 필수적이다(도 1B).

서열 정렬 분석의 결과 및 계통도를 확인하면, CaDTR1은 RING finger protein과 60~92%의 높은 아미노산 서열 indentity 를 가진다(도 2).

몇몇 RING finger protein은 생체외에서(in vitro) E3 ligase activity를 가지고, CaDTR1이 RING 도메인을 가지기 때문에, CaDTR1이 E3 리가아제 활성을 가지는지 확인하기 위해서 self-ubiquitination assay를 수행하였다. maltose binding protein (MBP)-tagged CaDTR1 단백질 및 정제된 CaDTR1ΔTM -MBP를 대장균에서 발현시켰을 때, 전 단백질의 가용성 분획으로부터 친화 크로마토그래피(affinity chromatography)를 수행하여 그 결과를 확인하였다(도 1C). human E1, 및 Arabidopsis E2가 사용되었고, 유비퀴틴화된 단백질은 안티-유비퀴틴 및 안티-MBP 항체를 사용하여 검출되었다. CaDTR1ΔTM-MBP는 E1 및 E2의 존재하에 E3 유비퀴틴 리가아제 활성을 나타내며, 이는 CaDTR1이 E3 유비퀴틴 리가아제의 역할을 한다는 것을 알 수 있다.

실시예 3. Ca DTR1 유전자 발현의 유도

비생물적 스트레스 조건 동안 CaDTR1 발현이 증가하는지 확인하기 위해서, ABA, 건조, 및 고염 (NaCl)을 각각 처리한 후, 고추 잎에서 시간대별 CaDTR1 발현을 확인하였다(도 3).

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, ABA 처리 2시간 후 부터 CaDTR1 전사물의 축적이 발견되었고, 24시간 후에 최대치를 보였다. 건조 처리를 한 경우 2시간 후에 축적이 발견되었고, 12시간 후에 최대치를 보였으며, 고염 처리에서도 발현이 상향조절되는 것이 확인되어 상기 결과로부터, CaDTR1이 비생물적 스트레스에 대한 반응에 관여한다는 것을 알 수 있었다.

실시예 4. Ca DTR1 유전자 발현 위치 확인

CaDTR1 단백질의 식물 세포 내 위치를 확인하기 위하여, CaDTR1 전장 cDNA의 C-말단에 형광단백질인 Green flourescent protein (GFP)을 35S 프로모터의 조절 하에서 융합시켰다(fused). 담배 (Nicotiana benthamiana)의 표피 세포(epidermal cell)에 있는 35S:CaDTR1-GFP fusion protein의 발현은 핵에서 GFP 신호를 만들어낸다는 것을 확인하였다(도 4).

CaDTR1은 C말단에서 두 개의 TM 도메인을 포함하는데(aa 137-159, 201-218), CaDTR1의 세포 내 위치에서 상기 TM 도메인의 기능을 확인하기 위해서, TM domains 결실 돌연변이 CaDTR1-GFP 융합 단백질(35S:CaDTR1ΔTM-GFP)을 코딩하는 융합 단백질이 사용되었다. 형광 신호는 핵과 세포질에서 검출되었으며, 이는 TM 도메인이 CaDTR1의 세포 내 핵에서 위치하는 것에 필수적인 역할을 한다는 것을 알 수 있다.

실시예 5. Ca DTR1 유전자가 침묵된 고추 식물에서 건조 저항성 증가 확인

도 3의 내용을 바탕으로, CaDTR1 유전자 발현이 저해된 고추 식물의 건조 스트레스에 대한 생리학적 및 분자적 반응을 분석하였다.

먼저, 물이 있는 환경 하에서 성장시킨 정상 대조군(TRV:00) 및 CaDTR1 유전자 발현이 저해된 고추 식물(TRV2:CaDTR1)의 전사 축적을 확인한 결과, TRV2:CaDTR1에서 낮은 CaDTR1 축적을 보인다(도 5A). 정상 관수와 관수를 중단한 조건에서 대조군 식물과 CaDTR1 침묵된 식물 사이의 표현형 차이는 관찰되지 않았다(도 5B). 그러나 재관수하자, CaDTR1 침묵된 식물이 더 느리게 회복된다는 것을 알 수 있다.

상기와 같은 조건 하에서 80%의 대조군 식물이 회복되었으나, CaDTR1 침묵된 식물은 55%만이 회복되었다(도 5C).

증산에 의한 수분 손실이 CaDTR1 침묵된 식물의 건조-민감성 표현형에 영향을 주는지 확인하기 위해서, 떼어낸 잎의 생중량을 측정하였다(도 5D). 잎의 생중량은 CaDTR1 침묵된 식물에서 대조군 식물의 77% 수준으로, 현저히 낮아진다는 것을 알 수 있다.

따라서 ABA 처리에 의한 건조 저항성을 확인하여 도 5E-G에 나타내었다.

먼저, ABA 50 μM를 처리한 대조군 식물 및 CaDTR1 침묵된 식물의 잎 온도를 측정하였다. 그 결과, CaDTR1 침묵된 식물의 잎 온도가 더 낮은 것을 확인하였다(도 5E). ABA 50 μM를 처리한 후 기공을 확인한 결과 CaDTR1 침묵된 식물에서 더 컸고(도 5F), 기공의 크기는 CaDTR1 침묵된 식물에서 더 크게 나타났다.

상기 결과들을 통해 CaDTR1 유전자의 침묵은 잎에서 증산에 의한 수분 손실을 증가시킴으로써 건조에 대한 민감성을 증가시킨다는 것을 알 수 있다.

실시예 6. 애기장대 식물에서 Ca DTR1 유전자 과발현에 의한 ABA 감수성 증가 확인

ABA에 반응하는 식물에서 CaDTR1의 영향을 더욱 확실히 알아보기 위해, 상기 실시예 1-3의 방법에 따라 CaMV(Cauliflower mosaic virus) 35S 프로모터의 조절 하에서 CaDTR1 유전자를 과발현하는 애기장대 형질전환 식물체(이하, 35S:CaDTR1)을 제조하고, 두 개의 독립된 T3 동형 라인(CaDTR1-OX #1 및 CaDTR1-OX #2)을 얻었고(도 6), 이를 표현형 분석에 이용하였다.

종자 발아는 지베렐린 및 ABA를 포함하는 식물 호르몬에 의해서 조절되고, 비생물적 스트레스에 대한 반응은 ABA에 의해 조절되는 것이 알려져 있다. 따라서 야생형 식물과 과발현 식물간의 표현형 차이를 확인하였다(도 7).

이에 다양한 농도(0, 0.5 및 1.0μM)의 ABA를 보충한 MS 플레이트 상에 CaDTR1-OX 식물 및 야생형 식물의 종자를 각각 파종하고 발아시키면서 발아율을 비교하였다. 그 결과, 도 7A에 나타낸 바와 같이, ABA를 처리하지 않은 경우, 파종 후 야생형 식물과 CaDTR1-OX 식물의 종자 간에는 발아율에 있어 별다른 차이가 발생하지 않았다. 하지만, 0.5μM 및 1.0μM의 ABA를 처리한 경우, CaDTR1-OX 식물의 종자가 야생형 종자에 비하여 발아율이 감소하였는바, 상기 결과로부터 CaDTR1-OX 식물의 종자가 야생형 종자에 비하여 ABA에 대한 민감도가 낮음을 알 수 있었다.

또한 0.0, 0.5 또는 0.75μM의 ABA를 보충한 MS 플레이트 상에 CaDTR1-OX 식물 및 야생형 식물의 종자를 각각 파종하여 성장시킨 결과, 도 7B 및 7C에 나타낸 바와 같이, 자엽(cotyledon)을 가진 다수의 묘목이 야생형보다 CaDTR1 과발현(CaDTR1-OX) 식물에서 더 적었고, 도 7D에 나타낸 바와 같이, 8일 동안 성장시킨 결과 CaDTR1 과발현(CaDTR1-OX) 식물에서 뿌리 길이는 줄어들었다(도 7D 및 7E).

상기 결과로부터, 애기장대에서 CaDTR1 유전자 과발현은 발아기 및 유모기 동안 ABA 민감도(sensitivity)를 부여한다는 것을 알 수 있었다.

실시예 7. 애기장대 식물에서 Ca DTR1 유전자 과발현에 의한 건조 저항성 증가 확인

CaDTR1이 침묵된 식물이 건조 저항성이 줄어든다는 것과(도 5), CaDTR1 과발현 식물은 ABA에 대해서 높은 감수성을 보인다는 것으로부터, CaDTR1-OX 식물의 건조 스트레스에 대한 저항성을 확인하였다.

상기 실시예 5와 유사하게 CaDTR1 유전자를 과발현하는 애기장대 형질전환 식물체(CaDTR1-OX)를 제조하였고, 4주된 대조군 식물 및 CaDTR1-OX을 대상으로, 9일간 관수를 중지한 후, 3일 동안 관수하여 건조 스트레스를 조성했다. 이들은 정상적인 환경에서는 다른 표현형을 보이지 않았으나(도 8A), 건조스트레스 이후에는 야생형이 더 시든 것이 확인된다. 이에 더하여 재관수 후에는 CaDTR1-OX가 보다 회복된다는 것을 알 수 있고, CaDTR1-OX의 생존율은 55-85%로 나타났으나, 야생형 식물에서는 0%에 수렴했다(도 8B).

수분 보유량이 건조 저항 표현형에 관련 있는지 알아보기 위해서, 증산율을 확인하기 위해 로제트 잎의 생중량을 측정하였다. 그 결과, 야생형에 비교하여 CaDTR1-OX 식물이 더 낮은 증산 수분 손실을 보인다는 것을 알 수 있다(도 8C).

이에 더하여 CaDTR1 유전자 과발현이 ABA 매개 기공폐쇄에 영향을 미치는지 알아보기 위해, ABA에 대한 잎 온도와 기공개도 변화를 측정하여 분석하였다.

먼저 CaDTR1-OX 및 애기장대 야생형(WT) 식물의 잎에 ABA를 처리하고 온도를 측정한 결과, 도 8D에 나타낸 바와 같이, ABA 처리 전에는 상기 두 식물의 잎 온도에 차이가 없었으나, ABA를 처리한 후에는 CaDTR1-OX 식물이 야생형보다 잎 온도가 더 높게 측정되었다.

또한, ABA에 의한 기공폐쇄를 관찰하여, 도 8E 및 8F에 나타낸 바와 같이, CaDTR1-OX 식물의 기공개도가 감소한 것을 확인하였다. 상기 결과는 CaDTR1 유전자의 과발현이 ABA에 반응하여 기공폐쇄를 증가시킨다는 것을 의미한다.

마지막으로 건조 조건 하에서 스트레스-반응성 유전자의 발현을 조절하면서 야생형 식물과 CaDTR1 과발현 식물에서 qRT-PCR을 수행하였다. 보통은 건조 스트레스 조건에서 식물 조직에서 ABA의 레벨이 올라가는데, 이는 DREB2A, NCED3, RD29A, 및 KIN1의 발현을 유도한다. 건조 스트레스 처리 후, CaDTR1의 과발현 식물은 야생형에 비해서 NCED3, KIN2, COR15A 및 RD29B 유전자의 발현이 높다는 것이 확인되었다(도 8).

상기 결과로부터, CaDTR1의 과발현은 건조 스트레스에 대한 저항성을 증진시킴을 알 수 있었다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Method for improving the resistance to the drought stress using CaDTR1 in plants <130> MP16-225 <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 660 <212> DNA <213> Capsicum annuum Drought Tolerance RING 1_CaDTR1 <400> 1 atgcagaagt caactgctac ggcatttgag aattcttcgt cctcggggaa tggcagcaat 60 gatgctggtg attttgaatg caacatctgc tttgaattgg cccaagaccc tattgtgacc 120 ctctgtggtc acctctactg ttggccatgt ctttatagat ggctaaggct tcactctcaa 180 tcccatgagt gccctgtttg taaggccctt atacaagagg agaagttagt tcctctttat 240 ggaagaggga ggacgtcaac tgatcccaga tcaaaaccag tacctggagt tgaaattcct 300 agaaggccag cagggcaaag acctgaaacg gctcctccac cagaatcaaa tacttttcct 360 aattccgggt ttggccttat gggaggactt tttccaggag caactgcaag ttttggtaac 420 tttacaatgt ctgctggttt cggtggattt atcccatcct tgctcagttt tcagtttcat 480 ggattccctg gtccaactgc ctttggtaca acgccaaatt accagtatgg gtatcctcct 540 gcctatcatg gggcgaatgt tcagaatgct gcacacccgt cccaaggaca ggcagacaat 600 aatctgaagt tcatgttctt gcttgttgga tttcttgtat tcctatattt gtttggttag 660 660 <210> 2 <211> 219 <212> PRT <213> Capsicum annuum Drought Tolerance RING 1_CaDTR1 <400> 2 Met Gln Lys Ser Thr Ala Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ser Ser Ser Gly 1 5 10 15 Asn Gly Ser Asn Asp Ala Gly Asp Phe Glu Cys Asn Ile Cys Phe Glu 20 25 30 Leu Ala Gln Asp Pro Ile Val Thr Leu Cys Gly His Leu Tyr Cys Trp 35 40 45 Pro Cys Leu Tyr Arg Trp Leu Arg Leu His Ser Gln Ser His Glu Cys 50 55 60 Pro Val Cys Lys Ala Leu Ile Gln Glu Glu Lys Leu Val Pro Leu Tyr 65 70 75 80 Gly Arg Gly Arg Thr Ser Thr Asp Pro Arg Ser Lys Pro Val Pro Gly 85 90 95 Val Glu Ile Pro Arg Arg Pro Ala Gly Gln Arg Pro Glu Thr Ala Pro 100 105 110 Pro Pro Glu Ser Asn Thr Phe Pro Asn Ser Gly Phe Gly Leu Met Gly 115 120 125 Gly Leu Phe Pro Gly Ala Thr Ala Ser Phe Gly Asn Phe Thr Met Ser 130 135 140 Ala Gly Phe Gly Gly Phe Ile Pro Ser Leu Leu Ser Phe Gln Phe His 145 150 155 160 Gly Phe Pro Gly Pro Thr Ala Phe Gly Thr Thr Pro Asn Tyr Gln Tyr 165 170 175 Gly Tyr Pro Pro Ala Tyr His Gly Ala Asn Val Gln Asn Ala Ala His 180 185 190 Pro Ser Gln Gly Gln Ala Asp Asn Asn Leu Lys Phe Met Phe Leu Leu 195 200 205 Val Gly Phe Leu Val Phe Leu Tyr Leu Phe Gly 210 215 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CaDTR1_Forward primer for cloning <400> 3 atgcagaagt caactgctac ggca 24 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CaDTR1_Reverse primer for cloning <400> 4 ctaaccaaac aaatatagga atacaagaa 29 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CaDTR1_Forward primer for RT-PCR <400> 5 ggtaacttta caatgtctgc tggtt 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CaDTR1_Reverse primer for RT-PCR <400> 6 aacttcagat tattgtctgc ctgtc 25 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CaACT1_Forward primer for RT-PCR <400> 7 gacgtgacct aactgataac ctgat 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CaACT1_Reverse primer for RT-PCR <400> 8 ctctcagcac caatggtaat aactt 25 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Actin8_Forward primer for RT-PCR <400> 9 caactatgtt ctcaggtatt gcaga 25 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Actin8_Reverse primer for RT-PCR <400> 10 gtcatggaaa cgatgtctct ttagt 25 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCED3_Forward primer for RT-PCR <400> 11 acatggaaat cggagttaca gatag 25 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCED3_Reverse primer for RT-PCR <400> 12 agaaacaaca aacaagaaac agagc 25 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DREB2A_Forward primer for RT-PCR <400> 13 ctacaaagcc tcaactacgg aatac 25 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DREB2A_Reverse primer for RT-PCR <400> 14 aaactcggat agagaatcaa cagtc 25 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RD29A_Forward primer for RT-PCR <400> 15 cacaatcact tggctccact gttg 24 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RD29A_Reverse primer for RT-PCR <400> 16 acctagtagc tggtatggag gaact 25 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KIN1_Forward primer for RT-PCR <400> 17 tgttaacttc gtgaaggaca agac 24 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KIN1_Reverse primer for RT-PCR <400> 18 aagtttggct cgtctaataa ttttg 25

Claims (5)

1. 삭제
2. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 CaDTR1(Capsicum annuum Drought Tolerance RING 1) 단백질을 유효성분으로 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물.
   
3. 하기의 단계를 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법:
   (a) CaDTR1(Capsicum annuum Drought Tolerance RING 1) 단백질을 암호화하는 서열번호 1의 유전자를 식물체에 형질전환 하는 단계; 및
   (b) 상기 형질전환된 식물체에서 CaDTR1 단백질을 과발현시키는 단계.
   
4. 제3항에 있어서,
   상기 CaDTR1 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 방법.
   
5. 제3항의 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체.

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