KR102076318B1

KR102076318B1 - 고추 녹광 품종 유래 인산화효소 CaAIMK1 유전자 및 이를 이용한 식물체의 건조스트레스 저항성 증진방법

Info

Publication number: KR102076318B1
Application number: KR1020190042329A
Authority: KR
Inventors: 이성철; 임채우; 정순곤; 임준섭
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2019-04-11
Filing date: 2019-04-11
Publication date: 2020-02-11

Abstract

본 발명은 고추 녹광 품종 유래 인산화효소 CaAIMK1 유전자, 상기 유전자에 의해 코딩되는 아미노산으로 이루어진 단백질, 및 상기 유전자 또는 단백질을 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법 등에 관한 것으로, CaAIMK1 단백질은 ABA 신호전달의 양성 조절자로 기능하며 상기 단백질이 과발현된 형질전환 식물체에서 건조 스트레스 저항성 증진 효과를 확인하였는바, CaAIMK1 유전자의 발현 조절을 통해 인류가 이용할 수 있는 작물 등의 개량에 활용할 수 있으며, 특히 식물의 생산성을 향상시키는데 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

고추 녹광 품종 유래 인산화효소 CaAIMK1 유전자 및 이를 이용한 식물체의 건조스트레스 저항성 증진방법{Method for improving the resistance to the drought stress using pepper protein kinase CaAIMK1 in plants}

본 발명은 고추 녹광 품종 유래 인산화효소 CaAIMK1(Capsicum annuum ABA Induced MAP Kinase 1) 유전자, 상기 유전자에 의해 코딩되는 아미노산으로 이루어진 단백질 및 상기 유전자 또는 단백질을 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법 등에 관한 것이다.

지구온난화는 극심한 기후 변화를 야기하여 식물들의 정상적인 생장 및 발달을 저해하는 환경적 스트레스를 유발하며, 이에 대하여 식물체는 추위, 고염, 및 가뭄과 같은 불리한 환경에서 생존하기 위한 정교한 방어기작을 진화시켜왔다. 예컨대, 가뭄(drought)은 수분 부족 환경에 의해 일어나며 식물의 정상적인 성장에 심각한 영향을 미쳐 결국 곡물의 수확량 감소를 초래하는데, 식물은 이러한 건조 스트레스에 적응하기 위해 기공폐쇄, 앱시스산(abscisic acid; 이하 ABA)의 합성 및 축적과 같은 다양한 방어 기작을 활성화한다.

ABA는 비생물적 스트레스 특히, 건조 스트레스에 대하여 식물을 보호하기 위한 조절 인자이며, 식물 생장 및 발달에 매우 중요한 역할을 한다고 알려졌다. 보고된 바에 의하면, ABA를 미리 처리하고 스트레스를 준 식물은 그렇지 않은 식물에 비해 스트레스에 잘 저항하는 반면 ABA를 생성하지 못하거나, ABA에 반응하지 못하는 돌연변이 식물들은 스트레스에 약한 것으로 알려졌다. 따라서 ABA의 반응에 관여하는 단백질들을 이용하면, 환경 스트레스에 대한 저항성이 향상된 식물을 개발할 수 있을 것으로 기대되고 있다.

ABA 신호는 삼투 적응 및 뿌리 수리 전도도(hydraulic conductivity)의 조절에 관여하는 전사인자와 E3 리가아제(E3 ligase)와 같은 다양한 스트레스 관련 유전자들의 발현을 조절한다고 알려졌으나, 완전한 ABA 신호전달경로는 아직 규명되지 않았다. 식물 세포에서 ABA 신호전달 개시를 위해서는 ABA 수용체가 존재해야 하고 신호를 하위 단백질로 전달해야 한다. 현재까지 ABA 수용체로써 PYR/PYL/RCARs가 ABA를 인식하는 역할을 한다고 알려졌다. 수용체가 ABA를 인식하면 표적 단백질의 인산화를 통해 특정 유전자들의 발현 및 이온 채널 활성화를 촉진시키며, 이는 식물체가 불리한 환경에 적응할 수 있도록 한다.

오늘날 사막화가 진행됨에 따라 물 부족이 농업과 환경에 큰 문제점을 초래하고 있으며, 이에 물을 적게 사용하여도 건조한 환경에서 견디고 살 수 있는 식물의 개발이 필요한 실정이다. 이러한 기술이 개발되어 작물에 적용되면 농업 생산량이 매우 증가할 것으로 기대되며, 특히 건조한 지역의 경우, 건조 저항성이 향상된 식물, 즉 증산 작용을 낮출 수 있는 식물들은 생존에 유리하므로, 농업 생산성 향상에 기여할 수 있을 뿐 아니라, 환경이 매우 건조한 지역에서 환경정화에도 유용할 수 있다.

이에, 식물체의 건조 스트레스에 대한 저항성을 증진시키기 위한 방법이 주요 연구 대상이 되고 있으며, 이와 관련하여 건조 스트레스 내성 및 생장 촉진 관련 유전자와 이에 따른 형질전환 식물체에 대한 연구가 이루어지고 있으나 아직 미비한 실정이다.

대한민국특허공개공보 10-2018-0093481

본 발명자들은 ABA 신호전달 경로 조절을 통한 건조 스트레스 반응간의 관련성을 알아보기 위해 연구하던 중, 고추에서 CaAIMK1 유전자를 동정하였으며, 상기 유전자가 ABA 매개성 기공 폐쇄를 조절함으로써, 이를 통해 식물의 건조 스트레스 저항성을 증진시키는 양성조절자로서 기능함을 규명하여 본 발명을 완성하였다.

이에 본 발명의 목적은, CaAIMK1 유전자, CaAIMK1 단백질 및 상기 유전자 또는 단백질을 유효성분으로 포함하는 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, CaAIMK1 단백질을 암호화하는 유전자를 식물체에 형질전환 하는 단계를 포함하는 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법 및 상기 방법으로 제조된 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 건조 스트레스에 대한 양성 조절인자(positive regulator) 단백질을 암호화하며, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CaAIMK1 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 CaAIMK1 유전자에 의해 암호화되는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 CaAIMK1 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자 또는 상기 단백질을 유효성분으로 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법을 제공한다:

(a) CaAIMK1 단백질을 암호화하는 서열번호 1의 유전자를 식물체에 형질전환 하는 단계; 및

(b) 상기 형질전환된 식물체에서 CaAIMK1 단백질을 과발현시키는 단계.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명에서는 건조 스트레스에 대한 저항성 증진 단백질을 암호화 하는 CaAIMK1 유전자를 동정하였으며, CaAIMK1 단백질은 ABA 신호전달의 양성조절자로 기능하며 상기 단백질이 과발현된 형질전환 식물체에서 건조 스트레스 저항성 증진 효과를 확인하였는바, CaAIMK1 유전자의 발현 조절을 통해 인류가 이용할 수 있는 작물 등의 개량에 활용할 수 있으며, 특히 식물의 생산성을 향상시키는데 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1a는 본 발명의 CaAIMK1 및 다른 종의 MAP 키나아제 아미노산 서열을 비교한 결과이다.
도 1b는 CaAIMK1 단백질의 분자계통학적(Molecular phylogenetic) 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2a는 다양한 스트레스 조건에서 CaAIMK1 유전자의 발현 양상을 시간별로 관찰한 결과이다.
도 2b는 녹색 형광 단백질을 이용하여 CaAIMK1의 세포 내 위치를 확인한 결과이다.
도 3a 내지 3d는 CaAIMK1-silenced 고추 및 대조군 식물에 가뭄처리 후 결과를 관찰한 것으로, 도 3a는 상기 식물에 가뭄처리 후 표현형을, 도 3b는 상기 식물 잎의 수분손실 정도를, 도 3c는 상기 식물 잎의 온도를, 도 3d는 상기 식물의 기공개도를 비교한 결과이다.
도 4a 내지 4d는 야생형(WT)에 비해 CaAIMK1-OX 식물에서 향상된 ABA 민감도를 관찰한 결과로, 도 4a는 야생형 및 CaAIMK1-OX 식물에서 CaAIMK1 발현정도를, 도 4b는 상기 식물의 발아율을, 도 4c는 상기 식물의 녹색자엽의 비율을, 도 4d는 상기 식물의 주근의 길이를 비교한 결과이다.
도 5a 내지 5d는 가뭄 스트레스에 대한 CaAIMK1-OX 식물의 내성 강화를 확인한 것으로, 도 5a는 야생형(WT) 및 CaAIMK1-OX 식물의 가뭄 처리후 표현형을, 도 5b는 상기 식물 잎의 수분 손실량을, 도 5c는 상기 식물 잎의 온도를, 도 5d는 상기 식물의 기공개도를 비교한 결과이다.
도 6은 가뭄 스트레스에 노출된 CaAIMK1-OX 식물에서 가뭄 유도성 유전자의 발현 양상을 나타낸 것이다.

본 발명자들은 고추에서 CaAIMK1 유전자를 동정하였으며, 상기 유전자가 ABA 매개성 기공 폐쇄를 조절함으로써, 이를 통해 식물의 건조 스트레스 저항성을 증진시키는 양성 조절자로서 기능함을 규명하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일 실시예에서는, 고추에서 CaAIMK1 유전자를 분리하여 그 특성 및 CaAIMK1 단백질과 다른 종의 MAP 키나아제 사이에 높은 아미노산 서열 동일성을 확인하였다(실시예 2 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, 다양한 환경 스트레스 하에서 CaAIMK1 유전자의 발현 패턴을 분석하고 녹색 형광 단백질을 이용하여 CaAIMK1 단백질이 핵과 세포질에서 기능함을 확인하였다(실시예 3 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, CaAIMK1-silenced 고추 식물의 경우 가뭄처리시 생존률이 야생형 보다 더 낮았고 기공개도도 더 크게 나타나는 등 가뭄저항성 및 ABA 감수성이 감소함을 확인하였다(실시예 4 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, CaAIMK1을 과발현하는 형질전환식물의 경우 야생형에 비하여 낮은 발아율을 보이고 짧은 주근 성장이 나타나는 등 ABA 감수성이 향상됨을 확인하였다(실시예 5 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, CaAIMK1을 과발현하는 형질전환식물의 경우 야생형에 비하여 가뭄처리시 생존률이 증가하고 작은 기공개도를 나타내는 등 향상된 가뭄 내성을 확인하였다(실시예 6 참조).

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 건조 스트레스에 대한 양성 조절인자(positive regulator) 단백질을 암호화하며, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CaAIMK1 유전자를 제공한다.

본 발명에서 "양성 조절인자(positive regulator) 단백질"이란 생명현상 조절에서 증가방향으로 작용하는 단백질을 의미한다. 즉, 본 발명의 유전자인 CaAIMK1이 과발현되는 경우, ABA 민감도 증가, 및 건조 스트레스에 대한 저항성이 증가될 수 있다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 CaAIMK1 유전자에 의해 암호화되는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 CaAIMK1 단백질을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 유전자 또는 상기 단백질을 유효성분으로 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법을 제공한다:

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명에서 상기 식물(체)는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료 물류 등일 수 있으며, 가장 바람직하게는 애기장대 또는 고추이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 실험준비 및 방법

1-1. 식물 재료 및 성장 조건

고추(Capsicum annuum L., cv. Nockwang), 애기장대(Arabidopsis thaliana: ecotype Col-0) 및 담배(Nicotiana benthamiana) 종자는 증기 소독된 배합토(피트모스(peat moss):펄라이트(perlite):질석(vermiculite)=5:3:2, v/v/v), 사토(sand), 및 양토(loam soil)를 1:1:1(v/v/v)로 섞고 파종하였다. 이후 고추 식물 및 담배 식물은 24±1℃ 조건의 생육실에서 백색 형광등(130 μmol photons m^-2S^-1; 하루 16시간 동안) 빛 아래 성장시켰다.

1-2. 서열 정렬 (Sequence alignment)

CaAIMK1로 암호화된 아미노산 서열 및 이의 상동 서열은 BLAST searches (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)를 사용하여 얻었다. SMART (http://smart.embl-heidelberg.de) web server는 RING finger를 식별하는데 사용하였다. 아미노산 정렬은 CLUSTALW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2)를 사용하여 수행하였고, 결과는 Genedoc software (http://www.nrbsc.org/gfx/genedoc)를 사용하여 편집하였다.

1-3. Virus-induced gene silencing ( VIGS )

CaAIMK1의 기능 상실 분석(loss-of function analysis)을 위해, 고추 식물에서 바이러스 유도 유전자 침묵 (virus-induced gene silencing: VIGS)이 수행 되었다. 간략하게 음성대조군으로서 pTRV1 및 pTRV2:CaAIMK1 또는 pTRV2:00을 운반하는 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens) 균주 GV3101을 고추의 완전히 자란 자엽(fully expanded cotyledons)에 침투시켰다(각 균주별 OD₆₀₀=0.2). 식물체들은 생장 및 바이러스가 증식할 수 있도록 16시간 낮/8시간 밤으로 광주기를 설정한 24℃의 생육실에 두었다.

1-4. CaAIMK1 유전자가 과발현된 형질전환 애기장대 제조

CaAIMK1의 기능 분석을 위해 CaAIMK1 유전자가 과별현된 애기장대를 제조하였다. CaAIMK1 유전자의 전장 코딩 영역은 pENTR / D-TOPO 벡터 (Invitrogen, Carlsbad, CA)에 삽입 하였다. LR 반응을 통해, 클로닝 된 유전자를 pK2GW7에 도입하여 CaMV 35S 프로모터의 제어 하에 각 유전자를 구성적으로 발현시키고, 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens) 균주 GV3101에 정확한 구조를 도입하였다. 꽃가루 딥 방법(floral dip method)은 CaAIMK1을 이용한 애기장대의 형질 전환에 적용되었다. 과발현된 식물은 카나마이신 (kanamycin) 50 μgㆍmL^-1의 선택 마커가 보충된 MS 플레이트에서 형질전환 종자로 추정되는 발아 종자를 선택한 것이다. T3 식물의 씨앗은 동일한 항생제가 보충된 MS 플레이트에서 3 : 1 분리 비율을 보이는 2세대 형질 전환 식물에서 수확했다.

1-5. ABA, 건조 스트레스, NaCl, H ₂ O ₂ 처리 및 형태 분석

고추 식물에서 CaAIMK1 유전자의 발현 패턴 변화를 관찰하기 위해, ABA, NaCl, H₂O₂ 및 건조 처리한 잎 샘플을 준비하였다. 6엽 단계(six-leaf stage)의 고추 식물에 ABA(100 μM), 염 용액(salt solution)(200 mM) 또는 H₂O₂(100mM)를 처리한 다음, 손상을 방지하기 위해 토양에서 조심스럽게 제거했다. 다음으로, 전체 식물을 3-mm 종이(Whatman, Clifton, UK)에서 건조 시키거나 뿌리를 제거하고 식물의 공중 부분을 말렸다. 이와 같이 처리한 후, 세 번째와 네 번째 잎은 주어진 시점에서 수확했다.

건조 저항성 분석(dehydration tolerance assays)을 위해, 4주된 유전자 침묵(gene-silenced) 고추 식물 및 대조군 고추 식물과 형질 전환 계통의 3 주된 애기장대 및 야생형 식물을 무작위로 배치했고, 각각 18일 및 16일 동안 물주기를 중단함으로써 건조 스트레스를 주었다. 그 후 2일 동안 다시 식물체에 물을 주고, 재수화 된 잎(rehydrated leaves)을 가진 식물의 수를 세어 생존율을 계산하였다. 건조 저항성을 정량적으로 측정하기 위해, 유전자 침묵(gene-silenced) 고추 식물 및 형질 전환된 애기장대 식물에서 분리한 잎을 건조해 수분 손실률을 측정하였다. 잎을 40% 상대 습도의 성장 챔버에 두고, 정해진 시간에 생중량의 손실을 측정하였으며, 실험은 3번 반복 수행하였다.

정량 역전사 중합효소 연쇄반응(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction, qRT-PCR) 분석을 위해, CaAIMK1 유전자를 과발현하는 4주 된 형질전환 식물과 야생형(wild-type) 식물을 토양에서 조심스럽게 제거하고 건조 스트레스를 주어 처리 후 정해진 시간에 수확하였다.

1-6. 기공개도(Stomatal aperture)의 생물학적 검정

기공개도의 생물학적 검정을 위해, 고추 및 4주된 애기장대 식물체의 1차 및 2차 잎을 수확하여 잎의 껍질을 분리하고, 빛이 있는 조건으로 2.5시간 동안 기공 개구 용액(stomatal opening solution, SOS: 50 mM KCl, 10 mM MES-KOH, pH 6.15, 10 mM CaCl₂) 위에 띄웠다. 기공 폐쇄는 다양한 농도의 ABA가 함유된 SOS 용액으로 교체하며 유도되었다. 2.5시간을 더 배양한 후, Nikon eclipse 80i microscope를 이용해 각 샘플에서 임의로 100개의 기공을 관찰하였으며, Image J 1.46r(http://imagej.nih.gov/ij)를 이용해 기공의 넓이와 길이를 측정하였다. 상기 실험은 각각 세 번 독립적으로 수행하였다.

1-7. 열 영상법 (Thermal imaging)

완전히 자란 1차 및 2차 잎을 가진 4주 된 고추 식물에 50 μM ABA를 처리하고, 3주 된 애기장대 식물의 뿌리를 제거하여 건조 스트레스를 주었다. 열 영상은 infrared camera(FLIR systems; T420)을 이용하여 얻었으며, 식물의 잎 온도는 FLIR Tools+ ver 5.2 software를 이용해 측정하였다.

1-8. RNA 추출 및 qRT - PCR

RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA)을 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 각기 ABA를 처리하거나 건조 스트레스를 준 고추 및 애기장대 식물의 잎을 수확하였다. 상기 식물체의 잎으로부터 추출한 모든 RNA 샘플에 대하여 RNA가 없는 DNase(RNA-free DNase)로 분해하여 genomic DNA를 제거하고, Transcript First Strand cDNA Synthesis kit(Roche, Indianapolis, IN, USA)를 사용해 cDNA를 합성하였다. qRT-PCR 분석을 위해, 상기 방법으로 합성한 cDNA를 iQ™SYBR Green Supermix 및 하기 표 1에 기재한 특이적 프라이머와 함께 CFX96 Touch™ Real-Time PCR detection system(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 증폭시켰다. 모든 반응은 세 번 반복하여 수행하였다. PCR은 95℃에서 5분간, 95℃에서 20초, 60℃에서 20초, 72℃에서 20초 45싸이클의 프로그램으로 수행되었다. 각 유전자의 상대적인 발현량은 ΔΔCt 방법으로 계산하였으며, 애기장대 액틴 8(Arabidopsis actin8; AtACT8) 유전자 및 고추 액틴 1(CaACT1) 유전자를 정규화를 위해 사용하였다.

Primer name		Primer sequence (5'- 3')	서열번호
Cloning	CaAIMK1 CDS	Forward ATGGATTGGACCAGAGGCCATA	3
	CaAIMK1 CDS	Reverse CTATTCACCGCTTCTTCTAACAGTAAC	4
	CaAIMK1 w/o stop codon	Forward CGAATTCGCCCTTTTCACCGCTTCTTCTAACAGTAAC	5
	CaAIMK1 w/o stop codon	Reverse GTTACTGTTAGAAGAAGCGGTGAAAAGGGCGAATTCG	6
	CaAIMK1 VIGs	Forward TCTAGAGATGGATTGGACCAGAGGC	7
	CaAIMK1 VIGs	Reverse CTCGAGAGCTCAATTGCGACATAAT	8
	CaAIMK1 dead kinase	Forward GGATAGCTCCACGGAGTTGACAGCAAAAAATTCATCG	9
	CaAIMK1 dead kinase	Reverse CGATGAATTTTTTGCTGTCAACTCCGTGGAGCTATCC	10
	CaAIPP1 CDS	Forward ATGGCTGGCATGTGTTGTGGTGTTA	11
	CaAIPP1 CDS	Reverse TTATAGCTTTCTCAAATCAACCACGAC	12
RT-PCR - pepper	CaAIMK1 (Ca07g11550)	Forward ATGGATTGGACCAGAGGCCATAC	13
	CaAIMK1 (Ca07g11550)	Reverse TGGCTCATTGATCCGAATACCC	14
	CaACT1 (CA12g08730)	Forward GACGTGACCTAACTGATAACCTGAT	15
	CaACT1 (CA12g08730)	Reverse CTCTCAGCACCAATGGTAATAACTT	16
RT-PCR - Arabidopsis	NCED3	Forward ACATGGAAATCGGAGTTACAGATAG	17
	NCED3	Reverse AGAAACAACAAACAAGAAACAGAGC	18
	DREB2A	Forward CTACAAAGCCTCAACTACGGAATAC	19
	DREB2A	Reverse AAACTCGGATAGAGAATCAACAGTC	20
	RAB18	Forward GGAAGAAGGGAATAACACAAAAGAT	21
	RAB18	Reverse GCGTTACAAACCCTCATTATTTTTA	22
	RD20	Forward TGGTTTCCTATCTAAAGAAGCTGTG	23
	RD20	Reverse ATACAAATCCCCAAACTGAATAACA	24
	RD29A	Forward CACAATCACTTGGCTCCACTGTTG	25
	RD29A	Reverse ACCTAGTAGCTGGTATGGAGGAACT	26
	RD29B	Forward GTTGAAGAGTCTCCACAATCACTTG	27
	RD29B	Reverse ATACAAATCCCCAAACTGAATAACA	28
	ABI1	Forward GTTTGGGATGTAATGACGGATG	29
	ABI1	Reverse TGAACTGAGGCAGAGAGGGTCC	30
	ABI2	Forward AGAAAAGAGGAGAAGGAAAAGATCC	31
	ABI2	Reverse TAAAGAGAATTTTTACCCACCATCA	32
	HAB1	Forward GACTACCTCTCAATGCTTGCTCTAC	33
	HAB1	Reverse AAAAACCTGTCGAAATTAGATCCTT	34
	AtActin8	Forward CAACTATGTTCTCAGGTATTGCAGA	35
	AtActin8	Reverse GTCATGGAAACGATGTCTCTTTAGT	36
Yeast-two hybrid	CaAIMK1 Kinase domain Reverse	CATAAGAAATGGATGTTTCAGGAGTTG	37

1-9. 세포 내 위치 분석(Subcellular localization analysis)

CaAIMK1-GFP 융합 단백질은 p19 균주를 갖는 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens) 균주 GV3101(1:1 비율; OD₆₀₀ = 0.5)의 agroinfiltration을 사용하여 담배(N. benthamiana) 표피 세포의 잎에서 일시적으로 발현되었다. 2일간 침투시킨 후, LSM Image Browser software가 설치된 공초점 현미경(510 UV/Vis Meta; Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 GFP 신호를 관찰하였다.

1-10. 통계적 분석(Statistical analyses)

통계적 분석은 유전형 사이의 유의한 차이를 결정하기 위해서 student's t-test 또는 ANOVA(Fisher's LSD test)를 이용하여 수행되었다. P value가 0.05 이하일 때 유의한 수준의 차이로 판단하였다.

실시예 2. CaAIMK1 유전자의 동정 및 서열 분석

가뭄에 반응하는 고추의 MAP 키나아제(Kinase)를 분리하기 위해 가뭄 처리된 고추 잎에서 RNA-seq 분석을 수행하여 CaAIMK1 유전자를 동정하였으며 분리된 CaAIMK1은 분자량 38.01 kDa와 등전점 5.72의 339 아미노산 잔기를 암호화하는 1020-bp의 오픈리딩프레임(open reading frame)으로 구성됨을 확인하였다.

또한, 다중 서열 정렬 분석(Multiple sequence alignment analysis) 및 단백질 BLAST 검색 결과 CaAIMK1 단백질과 고도로 보존된 세린/트레오닌 키나아제(Serine/Threonine Kinase) 도메인(도 1a 참조)을 포함하는 다른 종의 MAP 키나아제 사이에 높은 아미노산 서열 동일성 (36.1 내지 61.5 %)이 나타났으며, 계통 발생 분석 결과 예상대로 CaAIMK1은 추정적인 고추의 MAP 키나아제 및 Arabidopsis thaliana의 MAP 키나아제 키나아제 키나아제(MAP Kinase Kinase Kinase) 단백질과 유사성이 있었다(도 1b 참조).

실시예 3. CaAIMK1 유전자의 발현 및 CaAIMK1 단백질의 세포내 위치 규명

CaAIMK1의 발현에 미치는 ABA 및 비생물적 스트레스의 영향을 조사하기 위하여, 6엽 상태인 고추를 이용하여 정량적 RT-PCR(quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)를 통한 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 2a에 나타난 바와 같이 CaAIMK1 전사체 유도는 ABA 처리후 2시간째 발견되었고 이후 12시간까지 증가했다. 가뭄 처리 고추의 경우 가뭄 처리 후 2시간째 CaAIMK1 발현 수준이 중간 정도로 유도된 다음 지속적으로 억제되었으며, NaCl의 경우 처리후 CaAIMK1 전사체가 발현되고 24시간째 최대 수준에 도달했다. 또한, CaAIMK1의 발현 수준은 또한 H₂O₂에 의해 조절되었으며 상기 결과는 CaAIMK1의 기능이 ABA 신호전달 및 비생물적 스트레스 반응과 관련이 있음을 나타낸다.

종래 연구에서, CaAIPP1은 핵에 국한되어, CaAIPP1과 CaAIMK1 사이의 상호 작용이 핵에서도 검출되었으므로 이를 바탕으로 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP)을 사용하여 CaAIMK1의 세포 내 위치를 분석하였다. 그 결과, 도 2b에 나타난 바와 같이, GFP 신호는 핵에서 강하게 검출되었고 세포질에서는 약하게 검출되었다. 상기 결과는 CaAIMK1의 기능이 핵과 세포질에서 이루어진다는 것을 의미한다.

실시예 4. CaAIMK1 -silenced 고추 식물의 가뭄저항성 및 ABA 감수성 감소

CaAIMK1 유전자 분석을 위해 바이러스 유도 유전자 사일린싱(virus-induced gene silencing, VIGS) 및 고추 및 애기장대(Arabidopsis)에서 유전자 과발현을 이용하였다.

우선, 가뭄에 대한 CaAIMK1 사일런싱 효과를 관찰하기 위해 CaAIMK1-silenced 고추 및 대조군 식물에 가뭄 처리를 위해 18일 동안 급수를 제한한 다음 2일 동안 재급수 하고 표현형을 관찰하였다. 그 결과, 도 3a에 나타난 바와 같이 CaAIMK1-silenced 고추는 대조 식물보다 더 시든 표현형을 보였다. 또한, 대조군과 CaAIMK1-silenced 고추 식물의 생존율은 각각 61.1 %와 33.3 %로 나타나 CaAIMK1-silenced 고추 식물의 생존율이 현저히 낮은 것을 확인하였다.

또한, 증발 수분 손실을 억제하여 식물체의 수분을 유지하는 능력은 가뭄 내성을 결정하는 데 중요한 역할을 하므로 식물체의 무게를 측정하여 수분 손실률을 검사하였다. 그 결과, 도 3b에 나타난 바와 같이 CaAIMK1-silenced 고추 식물의 수분 손실률이 야생형에 비해 높은 것을 확인하였다.

나아가, 가뭄 스트레스 반응과 ABA 의존성 기공 폐쇄 사이의 관계를 조사하기 위하여 우선 상기 두 식물에서 잎 온도를 측정했다. 그 결과, 도 3c에 나타난 바와 같이 잎 온도는 대조군 식물보다 CaAIMK1-silenced 고추에서 더 낮았다. 식물에서 증발 냉각은 기공 폐쇄에 기인하며 잎의 온도가 상승하게 되므로 CaAIMK1-silenced 고추 식물의 잎 온도가 낮으면 기공 열림이 증가한다고 가정하고 이를 검증하기 위해, CaAIMK1-silenced 고추 및 대조군 식물에서 기공 구경을 측정 하였다. 그 결과, 도 3d에 나타난 바와 같이 ABA를 처리하지 않은 경우 거의 모든 기공이 CaAIMK1-silenced 고추와 대조군 식물의 잎에서 열렸다. 그러나 10, 20 μM ABA 처리한 경우 상기 식물 모두 기공 구경이 감소하였으나 CaAIMK1-silenced 고추 식물은 대조군과 비교하여 기공 구경의 크기가 덜 감소하였다. 상기 결과는 CaAIMK1이 ABA 의존성 신호 전달을 통하여 가뭄 스트레스에 대한 반응한다는 것을 의미한다.

실시예 5. CaAIMK1-OX 형질 전환 애기장대에서 향상된 ABA 감수성 분석

CaAIMK1 유전자의 추가적인 분석을 위해 CaAIMK1을 구성적으로 발현하는 CaAIMK1 과발현(OX)형 유전자 변형 애기장대를 제작하였으며 2개의 독립적인 형질 전환 계통(CaAIMK1-OX #1 및 #2)을 선택하고 이후 표현형 검사를 사용했다.

우선, 정량적 RT-PCR을 이용하여 CaAIMK1의 발현 정도를 확인한 결과, 도 4a에 나타난 바와 같이, CaAIMK1의 전사체는 CaAIMK1-OX 식물에서 검출되었지만 야생형 식물에서는 검출되지 않아 형질전환식물이 본 발명의 목적에 맞게 제작되었음을 확인하여 하기 실험이 이용하였다.

종래 실험에서 CaAIPP1-OX 식물은 모든 성장 단계에서 ABA 감수성 표현형을 보였으며, CaAIMK1 발현은 ABA에 의해 유도됨을 앞서 확인하였는바 발아 및 묘목 단계에서 CaAIMK1-OX 식물의 ABA 표현형을 조사했다. 그 결과, 도 4b에 나타난 바와 같이 ABA가 없는 경우 발아율은 상기 식물간에 차이가 없었으나 ABA 존재 하에서는, CaAIMK1-OX 가 야생형 식물보다 낮은 발아율을 보였다.

또한, 도 4c 및 4d에 나타난 바와 같이 묘목 단계에서 CaAIMK1-OX 식물은 야생형 식물에 비해 낮은 녹색자엽 비율과 짧은 주근(primary root) 성장이 나타나는 ABA 과민성 표현형을 보였다. 상기 결과는 CaAIMK1의 발현이 증가하면 애기장대에서 발아 및 묘목 단계 동안 ABA 과민성이 나타난다는 것을 의미한다.

실시예 6. CaAIMK1 -OX 형질전환 애기 장대 식물의 향상된 가뭄 내성

가뭄 스트레스에 대한 CaAIMK1의 생물학적 역할을 보다 명확히 밝히기 위하여 야생형 및 CaAIMK1-OX 식물체를 정상 성장 조건에서 3주 동안 성장시켰다. 그 결과, 도 5a에 나타난 바와 같이 정상 성장 조건에서는 상기 식물들은 어떠한 표현형 차이도 나타내지 않았다. 그러나 16일 동안 급수를 제한하여 가뭄 스트레스에 노출시킨 다음 2일 동안 재급수한 경우, 야생형 식물보다 CaAIMK1-OX 식물에서 시든 표현형이 적게 나타나는 것을 확인하였다. 또한, 야생형 및 형질전환식물의 생존율은 각각 28.27 % 및 69.44 내지 83.33 %로 CaAIMK1-OX 식물에서 현저히 높게 나타났다.

다음으로, 분리된 로제트(rosette) 잎의 생중량을 측정하여 증발 수분 손실을 분석하였다. 그 결과, 도 5b에 나타난 바와 같이 CaAIMK1-OX 식물에서 생중량 감소는 야생형 식물보다 분리 후 1시간에서 8시간까지 현저히 적었다.

또한, 잎 온도 및 기공개도를 측정하여 ABA 민감도를 조사했다. 그 결과 도 5c에 나타난 바와 같이 ABA의 존재 하에서, CaAIMK1-OX 식물의 잎 온도는 야생형 식물의 잎 온도보다 높았으며, 도 5d에 나타난 바와 같이, 기공개도의 경우 ABA 처리 전에는 야생형과 CaAIMK1-OX 식물 간에 유의한 차이는 없었으나 10 또는 20μM ABA 처리 후 CaAIMK1-OX 식물은 야생형 식물에 비해 작은 기공개도를 보였다. 상기 결과를 통해 향상된 식물의 수분 유지 능력은 ABA 과민성에 의해 가뭄 내성이 증진된 결과임을 확인하였다.

나아가, CaAIMK1의 발현이 ABA 생합성 및 ABA와 가뭄 신호에 영향을 미치는 분자 메커니즘을 검증하기 위해 스트레스 관련 유전자를 이용한 정량적 RT-PCR 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 가뭄 처리 전에 스트레스 관련 유전자의 발현 수준은 대부분 야생형 식물과 CaAIMK1-OX 식물간에 차이가 없었으나 DREB2A의 경우는 야생형 식물보다 CaAIMK1-OX 식물에서 유의하게 더 많이 유도되었다. 그러나, 가뭄 스트레스 처리 3시간 후 실험한 모든 스트레스 관련 유전자 발현은 CaAIMK1-OX #1 및 CaAIMK1-OX #2 식물에서 높게 유도되었다. 상기 결과는 CaAIMK1-OX 식물의 가뭄 내성 표현형은 스트레스 관련 유전자의 발현을 조절할 수 있음을 의미한다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Method for improving the resistance to the drought stress using pepper protein kinase CaAIMK1 in plants <130> MP19-075 <160> 37 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1020 <212> DNA <213> CaAIMK1 <400> 1 atggattgga ccagaggcca tactataggc cacggttcca ccgccgtcgt ctccattgcc 60 aagtcacgtt tctccgatga attttttgct gtcaagtccg tggagctatc ccaggctcaa 120 ttcttacaaa aggaacagaa aattatgtcg caattgagct ccccttatat agttagctcc 180 aaggggtgcg atgttactaa agagaaggac aaactcatgt ttaatcttat gatggagtac 240 atgtcagagg gtacactcat cgatgaaaat cggaaacagg gtattcggat caatgagcca 300 ttgatcgggt actacacgaa gcaaattctt ctaggattag attacctaca ttcaaggggc 360 gtagcacatt gtgacatcaa ggggcagaac attttgttag gtaaaactgg tgccaaaatt 420 gccgactttg gttgtgccag gtgggttgat ccggctgaga gggacggtgg tatggcagca 480 gcttctgccg agccaattag cggcacacca atgttcatgg caccggaggt ggcacgtggg 540 gaagaacagg ggtgtcccgc tgatatttgg gcattgggat gtactattat agaaatggcc 600 attggtagat taccatgggc 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Claims

건조 스트레스에 대한 양성 조절인자(positive regulator) 단백질을 암호화하며, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CaAIMK1(Capsicum annuum ABA Induced MAP Kinase 1) 유전자.
제1항에 기재된 CaAIMK1(Capsicum annuum ABA Induced MAP Kinase 1) 유전자에 의해 암호화되는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 CaAIMK1 단백질.
제1항의 유전자 또는 제2항의 단백질을 유효성분으로 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물.
하기의 단계를 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법:
(a) CaAIMK1(Capsicum annuum ABA Induced MAP Kinase 1) 단백질을 암호화하는 서열번호 1의 유전자를 식물체에 형질전환 하는 단계; 및
(b) 상기 형질전환된 식물체에서 CaAIMK1 단백질을 과발현시키는 단계.
제4항의 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체.