KR101710806B1 - CaAINR1을 이용한 식물체의 비생물적 스트레스 저항성 증진방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규 CaAINR1 (Capsicum annuum ABA-Induced RING Protein 1) 유전자/단백질, 및 이를 이용한 식물체의 비생물적 스트레스 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서, CaAINR1이 과발현된 형질전환 식물체 (CaAINR1-OX)의 앱시스산 (ABA)에 대한 감수성 증진효과, 및 건조, 삼투, 고염과 같은 비생물적 스트레스에 대한 저항성 증진효과를 확인하였는바, CaAINR1 발현 조절을 통해 인류가 이용할 수 있는 작물 등의 개량에 유용하게 활용될 수 있으며, 특히 식물의 생산성을 향상시킬 수 있을 것으로 기대된다.

Description

CaAINR1을 이용한 식물체의 비생물적 스트레스 저항성 증진방법 {Method for improving the resistance to the abiotic stresses using CaAINR1 in plants}

본 발명은 신규 CaAINR1 (Capsicum annuum ABA-Induced RING Protein 1) 유전자/단백질, 및 이를 이용한 식물체의 비생물적 스트레스 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

식물은 가뭄, 염, 추위, 더위, 병충해 등의 다양한 환경적 스트레스에 자주 노출되기 때문에 스트레스의 해로운 효과에 대처하는 생리학적, 생화학적, 분자적 방어 기작을 발전시켜왔으며, 특히 앱시스산 (abscisic acid: ABA) 신호 변환 조절은 식물이 상기 스트레스를 극복할 수 있도록 한다. 보고된 바에 의하면, 앱시스산을 미리 처리하고 스트레스를 준 식물은 그렇지 않은 식물에 비해 스트레스에 잘 저항하는 반면 앱시스산을 생성하지 못하거나, 앱시스산에 반응하지 못하는 돌연변이 식물들은 스트레스에 약한 것으로 알려졌다. 따라서 앱시스산의 반응에 관여하는 단백질들을 이용하면, 환경 스트레스에 대한 저항성이 향상된 식물을 개발할 수 있을 것이다.

ABA는 여러 가지 환경요인에 반응하는 신호 분자 역할을 하며, 다양한 생리학적 및 발생과정에서 변화를 유발함으로써, 생물적 및 비-생물적 스트레스에 적응하도록 한다. 스트레스 상황에서 ABA 수준은 증가하여 기공 폐쇄와 같은 다양한 반응을 유도한다. 즉, ABA 시그널링에 의해 표적화된 이온채널 (K⁺ 채널과 음이온채널)은 원형질막과 액포막 (tonoplast)을 통하여 이온의 흐름을 조절하고, 이에 의해 공변세포의 팽압을 조정한다.

건조 (drought), 고염과 같은 환경 스트레스들은 직접적으로 곡물의 성장 및 생산에 해로운 효과들을 야기한다. 특히, 오늘날 사막화가 진행됨에 따라 물 부족이 농업과 환경에 큰 문제점을 초래하고 있으며, 이에 물을 적게 사용하여도 건조한 환경에서 견디고 살 수 있는 식물의 개발이 필요한 실정이다. 이러한 기술이 개발되어 작물에 적용되면 농업 생산량이 크게 증가할 것으로 기대되며, 특히 건조한 지역의 경우, 건조 저항성이 향상된 식물, 즉 증산 작용을 낮출 수 있는 식물들은 생존에 유리하므로, 농업 생산성 향상에 기여할 수 있을 뿐 아니라, 환경이 매우 건조한 지역에서 환경정화에도 유용할 수 있다.

이와 같이, 종래 식물의 건조 스트레스에 대하여 광범위한 연구가 행해져 왔으나, CaAINR1과 비생물적 스트레스와의 상관관계, ABA 시그널링에서의 역할, 특이적인 생리 기능 및 명확한 분자 메커니즘은 아직 밝혀진 바가 없다.

본 발명자들은, 고추 녹광품종으로부터 ABA (abscisic acid) 처리에 의해 발현이 증가된 CaAINR1 (Capsicum annuum ABA-Induced RING Protein 1) 유전자를 분리 동정하였으며, 상기 유전자는 고추 잎에 ABA, NaCl 처리, 또는 건조 스트레스를 주었을 때 발현이 증가되며, CaAINR1 유전자가 비생물적 스트레스 저항성 기전에서 양성 조절자 (positive regulator)로서 기능함을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은, 신규의 CaAINR1 유전자/단백질, 및 CaAINR1 유전자를 식물체에 형질전환하여 과발현시킴으로써 식물체의 비생물적 스트레스 저항성을 증진시키는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 비생물적 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 비생물적 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 단백질을 암호화하며, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CaAINR1 (Capsicum annuum ABA-Induced RING Protein 1) 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 CaAINR1 단백질을 유효성분으로 포함하는, 식물체의 비생물적 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 식물체의 비생물적 스트레스 저항성 증진방법을 제공한다.

(a) CaAINR1 단백질을 암호화하는 서열번호 1의 유전자를 식물체에 형질전환하는 단계; 및

(b) 상기 형질전환된 식물체에서 CaAINR1 단백질을 과발현시키는 단계.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 비생물적 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 형질전환 식물체는 애기장대 (Arabidopsis)인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 식물체의 비생물적 스트레스 저항성 증진방법은 CaAINR1 (Capsicum annuum ABA-Induced RING Protein 1) 단백질을 과발현시키는 단계를 포함하며, CaAINR1이 과발현된 형질전환 식물체 (CaAINR1-OX)의 앱시스산 (ABA)에 대한 감수성 증진효과, 건조, 삼투, 및 고염과 같은 비생물적 스트레스에 대한 저항성 증진효과를 확인하였는바, CaAINR1 발현 조절을 통해 인류가 이용할 수 있는 작물 등의 개량에 유용하게 활용될 수 있으며, 특히 식물의 생산성을 향상시킬 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은, CaAINR1과 다른 식물종 (Solanum lycopersicum, Solanum tuberosum. Nicotiana sylvestris, Glycine max, 및 Arabidopsis thaliana )간 아미노산 서열을 비교한 결과이다.
도 2는, 도 1의 아미노산 서열 결과를 바탕으로 계통수 분석을 실시한 결과이다.
도 3은, CaAINR1의 Ring fiber 도메인과 다른 식물종 (Solanum lycopersicum, Solanum tuberosum. Nicotiana sylvestris, Glycine max, 및 Arabidopsis thaliana )의 Ring fiber 도메인간 아미노산 서열을 비교한 결과이다.
도 4는, CaAINR1 단백질의 식물 세포 내 위치를 확인하기 위하여 CaAINR1-GFP 융합단백질의 형광 신호를 공초점 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 5는, (A) ABA, (B) 건조, 및 (C) 고염 스트레스 조건에서, 시간에 따른 CaAINR1 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 6은, CaAINR1의 E3 리가아제 활성을 확인하기 위하여 in vitro ubiquitination을 수행한 것으로서, (A) anti-MBP 항체를 이용하여 CaAINR1-MBP (maltose-binding protein) 재조합 단백질, 및 (B) anti-Ub 항체를 이용하여 Ub가 표지된 재조합 단백질을 확인한 결과이다.
도 7은, 건조 스트레스 또는 ABA 처리 조건에서, TRV:CaAINR1 삽입에 의해 CaAINR1이 침묵된 고추 및 빈 벡터 (TRV:00)가 삽입된 대조군간 (A) CaAINR1 발현, (B) 표현형, (C) 생존율, (D) 생중량, (E) 잎의 온도, 및 (F) 기공개도를 비교한 결과이다.
도 8은, 삼투 스트레스 조건에서, CaAINR1 과발현 식물 (CaAINR1-OX)과 대조군 (야생형, WT) 식물간 (A) CaAINR1 발현, (B) 발아율, 및 (C)/(D) 뿌리의 성장, (E)/(F) 녹색 자엽 비율을 비교한 결과이다.
도 9는, 삼투 스트레스 조건에서, CaAINR1 과발현 식물 (CaAINR1-OX)과 대조군 (야생형, WT) 식물간 (A) 발아율, (B)/(C) 뿌리의 성장, 및 (D)/(E) 녹색 자엽 비율을 비교한 결과이다.
도 10은, ABA 처리 조건에서, CaAINR1 과발현 식물 (CaAINR1-OX)과 대조군 (야생형, WT) 식물간 (A) 기공개도, 및 (B) 잎의 온도를 비교한 결과이다.
도 11은, 건조 스트레스 처리 조건에서, CaAINR1 과발현 식물 (CaAINR1-OX)과 대조군 (야생형, WT) 식물간 (A)/(B) 생중량, 및 (C)/(D) 생존율을 비교한 결과이다.

본 발명자들은, 앱시스산 (abscisic acid, 이하 ABA), 건조, 고염 스트레스 조건에서 CaAINR1 (Capsicum annuum ABA-Induced RING Protein 1) 유전자 발현 증가, 및 CaAINR1 유전자가 과발현된 형질전환 애기장대에서 ABA 감수성 증가, 건조, 삼투 및 건조 스트레스에 대한 저항성 증가를 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 비생물적 스트레스에 대한 양성적 조절인자 (positive regulator) 단백질을 코딩하는, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CaAINR1 유전자를 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "비생물적 스트레스"는 비생물적 요인에 의해 유도되는 스트레스를 의미하며, 바람직하게 건조, 삼투 또는 고염 스트레스일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 유전자인 CaAINR1은 Differential hybridization analysis를 통하여 고추로부터 분리하였으며, 상기 CaAINR1 유전자는 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어져 있으며, 상기 CaAINR1 유전자에 의해 코딩되는 펩티드는 바람직하게는 서열번호 2로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 "양성 조절인자 (positive regulator) 단백질"이란 생명현상 조절에서 증가방향으로 작용하는 단백질을 의미한다. 즉, 본 발명의 유전자인 CaAINR1 유전자가 과발현되는 경우, ABA 민감도 증가, 및 건조, 삼투, 고염 스트레스에 대한 저항성이 증가될 수 있다.

본 발명자들은 비생물적 스트레스에 대한 반응에서 상기 CaAINR1 유전자의 새로운 기능을 밝히기 위해 연구하던 중, CaAINR1 유전자는 앱시스산 (abscisic acid: ABA), 건조, 및 고염 (NaCl) 스트레스에 노출된 고추 잎에서 강하게 유도되며, E3 리가아제 활성을 나타낸다는 사실을 최초로 규명하였으며 (실시예 4 및 5 참조), 이러한 실험 결과에 기반하여, CaAINR1 유전자의 발현과 건조, 삼투, 고염과 같은 비생물적 스트레스에 대한 저항성간 연관성을 규명하고자 하였다.

우선, 본 발명의 일 실시예서는, CaAINR1 유전자를 분리하고, CaAINR1 단백질과 다른 식물종의 단백질 간 아미노산 서열의 상동성을 확인하였으며, 35S:CaAINR1-GFP 융합단백질을 이용하여 CaAINR1 단백질이 핵 및 세포질에 위치함을 확인하였다 (실시예 2 및 3 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, VIGS (Virus Induced Gene Silencing) 기법으로 CaAINR1 유전자를 침묵시킨 고추 식물의 경우, ABA에 대한 민감성 감소에 의하여 기공이 열려 증산률이 증가되고, 결과적으로 건조 스트레스에 대한 내성 (저항성)을 매우 감소시킴을 확인하였다 (실시예 6 참조). 또한, 애기장대에서 CaAINR1 유전자를 과발현시킨 결과, 발아기, 유묘기 단계에서 ABA에 대한 감수성을 증가시킬 뿐만 아니라, 건조, 삼투, 고염 스트레스에 대한 저항성을 현저하게 증진시킴을 확인함으로써, CaAINR1가 ABA 신호전달의 양성 조절자 역할을 수행한다는 사실을 규명하였다 (실시예 7 내지 10 참조).

따라서 CaAINR1 단백질의 발현 또는 활성을 증가시킴으로써 식물체의 비생물적 스트레스에 대한 내성(저항성)을 증진시킬 수 있으며, 이에, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 CaAINR1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 식물체의 비생물적 저항성 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 식물(체)는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료 물류 등일 수 있으며, 가장 바람직하게는 애기장대 또는 고추이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 실험준비 및 실험방법

1-1. 식물 재료 및 성장 조건

고추 (Capsicum annuum L., cv. Hanbyul) 및 담배 (Nicotiana benthamiana) 종자는 증기 소독된 배합토(피트모스(peat moss):펄라이트(perlite):질석(vermiculite)=5:3:2, v/v/v), 사토(sand), 및 양토(loam soil)를 1:1:1(v/v/v)로 섞고 파종하였다. 그리고 하루에 16시간 동안 백색 형광등 세기 80 μmol photons m^-2·S^{- 1} 로 빛을 비춘 27±1℃ 방에서 성장시켰다. 담배 식물은 16시간 낮/8시간 밤 사이클, 25±1℃ 온도로 설정한 챔버에서 성장시켰다. 애기장대(Arabidopsis thaliana: ecotype Col-0) 종자는 1% 수크로오스 및 Microagar (Duchefa Biochemie)가 보충된 MS (Murashige and Skoog) salt에서 발아시켜, 16시간 낮/8시간 밤 사이클, 24℃ 온도로 설정한 챔버에서 성장시켰다. 애기장대 묘목은 증기 소독된 배합토(피트모스(peat moss):펄라이트(perlite):질석(vermiculite)=9:1:1, v/v/v)에서 24℃ 온도, 60% 습도, 16시간/8시간의 낮/밤 사이클 조건으로 형광등(130 μmol photons m^-2·s^-1) 빛에서 성장시켰다. 모든 종자는 챔버에 파종하기 전에 2일 동안 4℃에서 춘화처리(vernalized)를 하였다.

1-2. 서열 정렬(Sequence alignment)

CaAINR1에 대한 추정되는 아미노산 서열 및 이의 상동 서열은 BLAST searches (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)를 사용하여 얻었다. 아미노산 정렬은 CLUSTALW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2)를 사용하여 수행하였고, 결과는 Genedoc software (http://www.nrbsc.org/gfx/genedoc)를 사용하여 편집하였다. CaAINR1의 cDNA 클론을 다른 유기체(organism)의 것과 비교하기 위해 수동으로 아미노산 서열 정렬을 조절하였다.

1-3. Ca AINR1 유전자가 과발현된 형질전환 애기장대 제조

전장 CaAINR1 cDNA(702-bp)를 pK2GW7 binary vector에 삽입하여 애기장대에서 CaMV (cauliflower mosaic virus) 35S 프로모터의 조절하에 CaAINR1 유전자의 상시 발현을 유도하였다. 전기천공법(electroporation)을 통해 Agrobacterium tumefaciens 균주 GV3101 내로 CaAINR1 binary vector를 도입하고, CaAINR1 유전자를 가진 애기장대에 floral dip 방법으로 아그로박테리움-매개의 형질전환을 수행하였다. CaAINR1-과발현(ox) 형질전환체의 선택을 위해, 형질전환된 것으로 추정되는 식물로부터 종자를 얻어 Kanamycin 50μg/mL을 함유하는 MS 한천 플레이트상에 플레이팅하였다.

1-4. Virus-induced gene silencing ( VIGS )

고추에서 CaAINR1 유전자를 침묵 (knockdown) 시키기 위해 담배얼룩바이러스(tobacco rattle virus: TRV) 기반 VIGS 시스템을 이용하였다. 보다 구체적으로, CaAINR1 cDNA의 180-390 bp 단편을 pTRV2 벡터에 삽입하여 pTRV2:CaAINR1을 제작하였다. 그리고 pTRV1, pTRV2:00, 및 pTRV2:CaAINR1을 운반하는 아그로박테리움 (Agrobacterium tumefaciens) 균주 GV3101를 고추의 완전히 자란 자엽 (fully expanded cotyledons)에 침투시켰다 (각 균주별 OD₆₀₀=0.2). 식물체들은 생장 및 바이러스가 번질 수 있도록 16시간 낮/8시간 밤으로 광주기를 설정한 26℃의 생육실에 두었다.

1-5. ABA, 건조 스트레스 및 NaCl 처리

ABA 처리 후의 고추 식물에서 CaAINR1 유전자의 발현 패턴 변화를 확인하기 위해, six-leaf stage의 고추 식물에 100 μM ABA 또는 대조군 용액을 분사하였다. NaCl 및 건조 스트레스 처리를 위해, 고추 식물을 200mM NaCl 용액으로 관개한 후, 상처 나지 않도록 조심스럽게 토양에서 분리하고, 3mm 여과 종이 위에서 두어 탈수시켰다. 각각의 처리 후 0, 2, 6, 12 및 24시간째에 잎을 회수하고, RNA 분리 및 RT-PCT 분석을 실시하였다. 발아율 및 입모율을 측정하기 위해, 야생형과 CaAINR1 과발현 (CaAINR1-OX) 형질전환 애기장대 종자를 4℃에서 2일 동안 층화하고 다양한 ABA가 보충된 0.5×MS 아가 배지 상에 파종하였다. 식물체는 24℃ 온도, 16시간/8시간의 낮/밤 사이클 조건으로 형광등 (130 μmol photons m^-2·s^-1) 빛에서 성장시켰다.

3주 된 야생형 및 CaAINR1-OX 형질전환 애기장대를 무작위로 심은 후, 10일 동안 물주기를 중단함으로써 건조 스트레스를 주었다. 그리고 회복되도록 2일 동안 다시 식물체에 물을 주고, 식물체의 생존율을 계산하였다.

고추 식물의 경우에는, four-leaf stage의 고추 식물에 13일 동안 물주기를 중단함으로써 건조 스트레스를 주었다. 그리고, 회복되도록 3일 동안 다시 식물체에 물을 주고, 식물체의 생존율을 계산하였다.

건조 저항성은 증발하는 물 손실량을 측정함으로써 정량적으로 확인하였다. 이를 위해, four-leaf stage의 고추 식물 및 3주 된 애기장대로부터 회수한 잎을 페트리 접시 (petri-dish)에 놓았다. 상기 페트리 접시를 40% 상대 습도의 성장 챔버에 두고, 정해진 시간에 생중량의 손실을 측정하였으며, 실험은 3번 반복 수행하였다.

1-6. 기공개도(Stomatal aperture)의 생물학적 검정

기공개도 생물학적 검정을 위해 3주된 식물체의 로제트 잎에서 잎의 껍질을 수확하여 빛이 있는 조건으로 기공 개구 용액 (stomatal opening solution, SOS: 50 mM KCl, 10 mM MES-KOH, pH 6.15, 10 mM CaCl₂) 위에 띄웠다. 3시간 동안 배양한 후, 상기 용액을 20μM ABA 함유 SOS 용액으로 교체하고, 2.5시간을 더 배양하였다. 이후 각 샘플에서 기공을 측정하였으며, 상기 실험을 각각 세 번 독립적으로 수행하였다.

1-7. RNA 추출 및 qRT - PCR

총 RNA는 탈수되고, 박테리아 병원체로 감염된 애기장대 잎 조직으로부터 RNeasy Mini kit(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 추출하였다. 모든 RNA 샘플은 genomic DNA를 제거하기 위하여 RNA-free DNase로 다이제스트하였다. 분광 광도계로 정량화한 후, 총 RNA 1μg을 Transcript First Strand cDNA Synthesis kit (Roche, Indianapolis, IN, USA)를 이용한 cDNA 합성에 사용하였다. 이와 동시에 역전사 효소없이 cDNA를 합성하여 semi-quantitative RT-PCT을 수행하여 cDNA 샘플에서 genomic DNA의 오염 가능성을 배제시켰다.

qRT-PCR 분석을 위해, 합성한 cDNA는 iQ™SYBR Green Supermix 및 하기 표 1에 나타낸 프라이머와 함께 CFX96 Touch™ Real-Time PCR detection system (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 증폭시켰다. 모든 반응은 세 번 반복하여 수행하였으며, PCR 조건은 다음과 같다: 95℃에서 5분 가열 후, [95℃에서 20초, 60℃에서 20초, 72℃에서 20초]를 한 사이클로 하여 45 사이클 반복. 각 유전자의 상대적 발현량은 ΔΔCt 방법으로 계산하였으며, 애기장대 액틴 1 (Arabidopsis actin 1) 유전자를 정규화를 위해 사용하였다.

1-8. 박테리아에서의 MBP - Ca AINR1 재조합 단백질의 발현 및 in vitro ubiquitination

maltose-binding protein (MBP)-CaAINR1 재조합 단백질을 발현시키기 위해, 전장 CaAINR1 cDNA가 포함된 pMAL-c2X vector를 Escherichia coli 균주 C+ 세포 내로 도입하였다. 이후, 세포에 0.1μM isopropylthio-β-galactoside를 첨가한 후, 20℃에서 6시간 동안 성장시켰으며 (OD₆₀₀=0.6-1.0), 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 및 200 mM NaCl이 포함된 MBP colum 완충 용액에서, 수득한 세포 펠릿(pellet)을 재현탁시켰고, 이를 Vibracell sonicator (Sonic and Materials)로 초음파분해시켰다. MBP-CaAINR1 재조합 단백질은 amylose reisin과 10 mM Maltose로 정제하였으며, 이의 농도는 Pierce BCA Protein Assay kit (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)로 측정하였다.

in vitro Ubiquitination assay를 위해, 상기 정제된 MBP-CaAINR1 재조합 단백질 (500ng)은 재조합 인간 UBE1 (Boston Biochemiclas, Cambridge, MA, USA) 250 ng, his로 표지된 재조합 애기장대 E2s 250 ng, 및 소 ubiquitin (Sigma-Aldrich) 10 μg를 포함하는 Ubiquitination reaction 완충 용액 [50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM MgCl₂, 0.05 mM ZnCl₂, 1 mM Mg-ATP, 0.2 mM DTT, 10 mM phosphocreatine, 및 0.1 unit of creatine kinase (Sigma- Aldrich)]과 혼합하였다. 30℃에서 3시간 동안 배양시킨후, 반응을 마친 단백질을 SDS-PAGE로 분리하였으며, anti-Ub 항체, 및 anti-MBP 항체를 이용한 면역블로팅(immunoblotting)으로 분석하였다.

실시예 2. Ca AINR1 유전자 분리 및 서열 분석

Differential hybridization 분석으로 앱시스산 (abscisic acid, 이하 ABA)을 처리한 고추 잎에서 얻은 cDNA 라이브러리로부터 CaAINR1 (accession no.KT361852) cDNA를 추출하였다. ABA를 처리한 고추 잎에서, CaAINR1 유전자의 발현 증가를 확인하였다.

CaAINR1 cDNA는, 702bp ORF (open reading frame)을 포함하고, 233개의 아미노산 잔기를 포함하며, 이들은 26.3 KD의 분자량, 4.74의 등전점을 갖는 것으로 추정되었다. 또한, PROSITE 및 SMART 프로그램을 이용하여, N-말단 (잔기 23-51), 및 C-말단 (잔기 202-209)에서 2 개의 Coiled-coil 도메인, C-말단 (잔기 153-194)에서 C3H2C3 type Ring 도메인을 확인하였으며, 상기 도메인들은 Ub/26S Proteasome system에서 E3 ligase 활성에 필수적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

또한, 실시예 1-2에 따른 아미노산 서열 정렬(Sequence alignment)을 실시한 결과, 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, CaAINR1이 다른 Ring finger 단백질과 높은 상동성을 가진다는 것을 알 수 있었다. 보다 구체적으로, CaAINR1 단백질은 Solanum lycopersicum (accession no XP_004245207.1), Solanum tuberosum (accession no. XP_006361527.1), Nicotiana sylvestris (accession no. XP_009760745.1), Glycine max (accession no. XP_003544578.1), 및 Arabidopsis thaliana (accession no. NP_197591.1)의 Ring finger 단백질과 높은 상동성을 보였다 (65.2-88.8%).

또한, 도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 CaAINR1의 Ring fiber 도메인과 다른 식물의 Ring fiber 단백질간 서열의 상동성을 확인한 결과, 높은 상동성(88-93%)을 나타냈으며, E3 Ub ligase 활성에 필수적인 8개의 Cys 및 His 잔기가 보존되어 있음을 확인하였다.

실시예 3. Ca AINR1 단백질의 세포 내 발현 및 작용 위치 확인

CaAINR1 단백질의 식물 세포 내 위치를 확인하기 위하여, CaAINR1 coding region의 C-말단에 형광단백질인 Green flourescent protein (GFP)을 결합시켜 cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S 프로모터 하에서 발현되도록 벡터를 구축하였다. 일시 발현을 위해서, 상기 CaAINR1-GFP가 삽입된 벡터를 갖는 Agrobacterium tumefaciens 균주 GV3101을 p19 균주와 혼합하여 유전자 silencing을 피하고, 1ml needless 주사기를 사용하여 5주된 Nicotiana benthamiana 잎의 배축면에 주입하였다. 현미경 분석을 위해 잎절편을 주입 2일 후에 잘랐다. 표피 세포를 LSM Image Browser software로 조작되는 공초점 현미경 (model Zeiss 510 UV/Vis Meta)으로 분석하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 담배 (Nicotiana benthamiana)의 표피 세포(epidermal cell)에 있는 35S:CaAINR1-GFP 융합단백질이 핵과 세포질 내에서 GFP 신호를 만들어냈다. 상기 결과로부터, CaAINR1 단백질은 핵과 세포질을 타겟으로 하고, 해당 위치에서 기능을 한다는 것을 알 수 있었다.

실시예 4. ABA, 건조, 및 고염 처리에 의한 Ca AINR1 유전자의 유도

CaAINR1 유전자 발현과 관련된 비생물적 스트레스 요인들을 결정하기 위하여, ABA, 건조, 및 고염 (NaCl)을 각각 처리한 후, 고추 잎에서 시간대별 CaAINR1 발현을 확인하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, ABA 처리 전에는 CaAINR1 전사물 (transcripts)의 발현이 미미하였으나, ABA 처리 6시간 후 부터는 CaAINR1 전사물의 발현이 강하게 유도되었다 (도 5a 참조). 또한, 건조 및 고염 처리를 한 경우, 정상 상태에서의 CaAINR1 전사물과 비교하여, 발현이 상향 조절되었다 (도 5b 및 5c 참조). 상기 결과로부터, CaAINR1이 비생물적 스트레스에 대한 반응에 관여한다는 것을 알 수 있었다.

실시예 5. Ca AINR1 단백질의 E3 리가아제 활성 확인

종래, Ring 모티프를 포함하는 다양한 단백질들은 E3 리가아제와 같은 역할을 수행할 수 있다고 밝혀진바 있다. 상기 실시예 3에서 확인한 바와 같이, CaAINR1 단백질은 C3H2C3-type Ring fiber 모티프를 포함하고 있는바, CaAINR1의 Ring fiber 단백질이 역시 E3 리가아제 활성을 나타내는지를 확인하기 위하여 실시예 1-8에 따른 in vitro ubiquitination을 실시하였다.

구체적으로, CaAINR1을 CaAINR1-MBP (maltose-binding protein) 재조합 단백질의 형태로 E. coli에서 발현시키고, 이를 정제하였다. 이후, 수득한 재조합 단백질을 Ub, 인간 E1, 애기장대 E2와 함께 3시간 동안 배양시키고, anti-MBP 항체 및 anti-Ub 항체를 이용한 면역 블롯법을 통해 유비퀴틴화 여부를 확인하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, Ub, E1, 및 E2가 모두 존재하는 조건하에서, CaAINR1 단백질은 E3 리가아제 활성을 보였다.

실시예 6. Ca AINR1 - 침묵된 (silenced) 고추 식물의 건조 스트레스에 대한 감수성 증가 확인

건조 스트레스에 대한 반응에서 CaAINR1 유전자의 역할을 알아보기 위하여, 실시예 1-4에 따른 TRV (tobacco rattle virus) vector를 이용한 VIGS (virus-induced gene silencing) 기반 유전자 기능 분석을 실시하였다.

먼저, CaAINR1-침묵된 고추 식물 (TRV:CaAINR1)과 공벡터 (empty vector)를 접종한 대조군 식물 (TRV:00)을 사용하여 건조 표현형을 비교하였다. 그 결과, 도 7a 내지 도 7c에 나타낸 바와 같이, 정상 조건에서, 두 식물간 표현형의 차이가 거의 발견되지 않았다. 그러나, 대조군 식물과 CaAINR1-침묵된 고추 식물을 10일 동안 탈수시켜 건조 스트레스를 겪도록 하면, CaAINR1-침묵된 고추 식물이 대조군 식물에 비해 더 시들었다 (도 7b 참조). 또한, 회복을 위해 물을 준 후, 각각의 생존율을 측정한 결과, CaAINR1-침묵된 고추 식물은 단지 50%만이 성장을 재개하였던 반면, 대조군 식물은 83%가 성장을 재개하였다 (도 7c 참조). 상기 결과로부터, CaAINR1 유전자의 발현 억제가 건조 스트레스에 대한 감수성을 매우 증가시켰음을 알 수 있었다.

다음으로, 건조-민감성 표현형과 수분 보유량 간의 상관관계를 확인하기 위해, 다시 말해 CaAINR1-침묵된 고추 식물의 건조-민감성 표현형이 감소한 수분 보유량 때문인지 알아보기 위하여, 공벡터 (empty vector)를 접종한 대조군 식물과 CaAINR1-침묵된 고추 식물에서 떼어낸 로제트 잎(rosette leaves)의 생중량 (fresh weight)을 측정하여 증산 수분손실률 (transpiration water loss)을 비교하였다. 그 결과, 도 7d에 나타낸 바와 같이, 잎 조직의 수분 손실은 대조군 식물보다 CaAINR1-침묵된 고추 식물에서 비교적 높게 나타남을 확인할 수 있었다.

다음으로, 건조-민감성 표현형을 확인하기 위해, 대조군 식물과 CaAINR1-침묵된 고추 식물의 잎 온도를 측정하여 비교하였다. 그 결과, 도 7e에 나타낸 바와 같이, ABA 처리 후, CaAINR1-침묵된 고추 식물은 높은 증산률로 인해 대조군 식물보다 상당히 낮은 잎 온도를 나타냄을 확인할 수 있었다.

한편, 증발하는 수분 손실량은 기공 운동 (stomatal movement)에 의해 조절되고, 또한, ABA에 대한 높은 민감도는 기공 크기를 감소시킨다. 이에, CaAINR1-침묵된 고추 식물의 높은 증산률이 기공개도(stomatal aperture) 증가에 의한 것인지 확인하기 위해, ABA (20μM)를 처리한 후 기공차단 (stomatal closure)에서 중요한 역할을 하는 기공 운동을 측정하였다. 이때, 기공개도란, 식물체에 있어서 기공이 열리는 정도를 뜻한다. 도 7f에 나타낸 바와 같이, ABA를 처리하지 않은 경우, CaAINR1-침묵된 고추 식물과 대조군 식물 간에 별다른 기공 운동의 차이는 관찰되지 않았다. 그러나 ABA를 처리하는 경우, 두 식물 모두, 기공 크기가 감소하되, CaAINR1-침묵된 고추 식물의 경우가 대조군 식물보다 더 큰 기공을 가짐을 확인하였다. 상기 결과로부터, CaAINR1-침묵된 고추 식물에서의 높은 증산률은 ABA-유도 기공 차단의 감소에 의한 것임을 알 수 있었다.

실시예 7. Ca AINR1 과발현( Ca AINR1 -OX) 식물의 삼투 스트레스에 대한 저항성 증가 확인

CaAINR1 유전자의 생리적 역할을 조사하기 위해, 우선, 실시예 1-3에 따라 강력한 항시발현 CMV 35S 프로모터의 조절하에 CaAINR1 유전자가 과발현된 형질전환 애기장대를 제조하고, CaAINR1 유전자가 고발현된 두 개의 독립된 T₃ 동형 라인 (CaAINR1-OX)을 얻었으며 (도 8a 참조), 이를 표현형 분석에 이용하였다.

먼저, CaAINR1 과발현 식물과 야생형 식물에 다양한 농도 (300 μM, 및 400 μM)의 만니톨을 처리하여 삼투 스트레스를 가한 후, 이들의 발아율을 비교하였다. 그 결과, 도 8b에 나타낸 바와 같이, 300μM 또는 400μM의 만니톨을 처리한 경우, 야생형 식물보다 CaAINR1 과발현 식물의 종자는 더욱 빨리 발아되었으며, 높은 발아율을 나타내었다.

다음으로, 삼투 스트레스를 가한 경우, CaAINR1 발현이 뿌리 성장에 미치는 영향을 확인하기 위해 다양한 농도 (300 μM, 및 400 μM)의 만니톨이 첨가된 배지에서 CaAINR1 과발현 식물과 야생형 식물을 8일 동안 재배시키고, 이들의 뿌리 길이를 비교하였다. 그 결과, 도 8c 및 도 8d에 나타낸 바와 같이, 만니톨을 처리하지 않은 경우, CaAINR1 과발현 식물과 야생형 식물의 뿌리 길이는 큰 차이를 보이지 않는 반면, 만니톨을 처리한 경우, 두 식물 모두 뿌리 길이가 감소하였으나, CaAINR1 과발현 식물의 뿌리 길이가 야생형 식물보다 더 길었다.

다음으로, 삼투 스트레스를 가한 경우, CaAINR1 발현이 녹색 자엽 (cotyledon) 비율에 미치는 영향을 확인하기 위해, 다양한 농도 (300 μM, 및 400 μM)의 만니톨이 첨가된 배지에서 CaAINR1 과발현 식물과 야생형 식물의 종자를 5일 동안 성장시켰다. 그 결과, 도 8e 및 도 8f에 나타낸 바와 같이, 만니톨을 처리하지 않은 경우, CaAINR1 과발현 식물과 야생형 식물의 녹색 자엽 비율은 큰 차이를 보이지 않는 반면, 만니톨을 처리한 경우, 두 식물 모두에서 녹색 자엽 비율이 감소하였으나, CaAINR1 과발현 식물의 녹색 자엽 비율이 야생형 식물에 비해 높게 관찰되었다. 상기 결과로부터, 발아기 및 유모기 단계에서, CaAINR1은 삼투 스트레스 저항성에 대한 양성 조절자임을 알 수 있었다.

실시예 8. Ca AINR1 과발현( Ca AINR1 -OX) 식물의 고염 스트레스에 대한 저항성 증가 확인

상기 실시예 7과 마찬가지로, CaAINR1 유전자가 고발현된 두 개의 독립된 T₃ 동형 라인 (CaAINR1-OX)을 이용하였으며, CaAINR1 과발현 식물과 야생형 식물에 다양한 농도 (100 mM, 및 150 mM)의 NaCl을 처리하여 고염 스트레스를 가하고 8일 동안, 이들의 발아율, 뿌리의 길이, 및 녹색 자엽 비율을 각각 비교하였다.

그 결과, 도 9a에 나타낸 바와 같이, 100 nM, 또는 150 nM의 NaCl이 첨가된 배지에 종자를 심고 7일이 경과한 후, CaAINR1 과발현 식물에서는 발아율이 모두 100%에 가까웠던 반면, 야생형 식물에서는 각각 69%, 22%에 불과하였다.

또한, 도 9b 내지 도 9e에 나타낸 바와 같이, NaCl을 처리하지 않은 경우, CaAINR1 과발현 식물과 대조군 식물의 뿌리 길이 및 녹색 자엽 비율은 큰 차이를 보이지 않았다. 그러나 NaCl을 처리한 경우, 두 식물 모두 뿌리 길이와 녹색 자엽 비율이 감소하였으며, 야생형 식물과 비교하여 CaAINR1 과발현 식물의 뿌리 길이가 더 길었으며 (도 9b 및 도 9c 참조), 녹색 자엽 비율이 높게 관찰되었다 (도 9d 및 도 9e 참조). 상기 결과로부터, 발아기 및 유모기 단계에서, CaAINR1은 고염에 대한 식물체의 방어 반응에 관여함을 알 수 있었다.

실시예 9. Ca AINR1 과발현( Ca AINR 1 -OX) 식물의 ABA에 대한 감수성 증가 확인

식물의 가스 교환에 있어서, 기공의 개폐는 ABA의 축적에 의해 조절된다. 이에, CaAINR1이 ABA에 대한 반응에 관여하는지를 알아보기 위해, CaAINR1 과발현 식물과 야생형 식물간 ABA-유도 기공 운동 (stomatal movement), 및 잎 온도를 측정하였다.

그 결과, 도 10a 및 도 10b에 나타낸 바와 같이, ABA를 처리하지 않은 경우, CaAINR1 과발현 식물과 야생형 식물간 별다른 기공 운동의 차이는 관찰되지 않았다. 그러나 20 μM의 ABA를 처리한 경우, CaAINR1 과발현 식물은 16.4~20.2%, 야생형 식물은 8.7% 씩 기공의 크기가 감소하였는바, CaAINR1 과발현 식물의 기공의 크기가 야생형 식물에 비해 더 크게 감소하였고 (도 10a 참조), CaAINR1 과발현 식물의 잎 온도는 야생형 식물에 비해 비교하여 현저하게 높았다 (도 10b 참조).

실시예 10. Ca AINR1 과발현( Ca AINR1 -OX) 식물에서 건조 스트레스에 대한 저항성 증가 확인

상기 실시예 6에서, CaAINR1-침묵된 고추 식물의 건조-민감성 표현형, 실시예 9에서, CaAINR1 과발현 식물의 ABA에 대한 증가된 감수성을 확인하였다. 이에, CaAINR1 과발현 (CaAINR1-OX) 식물의 건조 스트레스에 대한 저항성을 조사하기 위해, CaAINR1 과발현 식물과 야생형 식물에 탈수 처리를 한 후, 로제트 잎의 생중량을 비교하였으며, 이에 다시 물을 준 후, 각각의 생존율을 평가하였다.

그 결과, 도 11a 및 도 11b에 나타낸 바와 같이, CaAINR1 과발현 식물은 야생형 식물에 비해 잎 조직에서의 생중량 손실이 적었으며, 이를 통해 CaAINR1 과발현 식물의 건조 저항성은 낮은 수분 손실에 기인한 것임을 확인하였다.

또한, 도 11c 및 도 11d에 나타낸 바와 같이, 정상 조건에서는 두 식물간 표현형의 차이가 거의 발견되지 않았던 반면, 10일 동안 탈수시켜 건조 스트레스를 겪도록 하면, 야생형 식물이 CaAINR1 과발현 식물에 비해 더 시들었다. 또한, 회복을 위해 2일 동안 물을 준 경우, 야생형 식물은 단지 25%만이 성장을 재개한 반면, CaAINR1 과발현 식물은 62~65%가 성장을 재개하였다. 상기 결과로부터, CaAINR1의 과발현은 건조 스트레스에 대한 저항성을 증진시킴을 알 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Method for improving the resistance to the abiotic stresses using CaAINR1 in plants <130> P20150260_MP15-143 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 702 <212> DNA <213> Capsicum annuum ABA-Induced RING Protein 1_CaAINR1 <400> 1 atgcctggat tttggaatgc tggtcttggg ctattcgttg aggctgagca cctggtgtca 60 ggatcgtctg agaagaaaca tttgcagagt tgcattagtc aggcgcgaga gcagttaact 120 gaagtacaga atgaatctca gaatacaaca tcaacagaaa atggctcaaa tagaaggttc 180 ctttttgagg ggcatcttac tgttgaccct gagcctgagc agcctgcttg gctcgagctg 240 tcttctcagg gtgatccagc caatgttaac actacggaag gtgctcgcag ggtacttgag 300 gagctggttg ctagactaga tgatataata ccagagatgc tggatgacgg tcctgctgcc 360 ccgagagcac cacctgccag taaacaagtt gtggcaaacc tcccagttat tactgtcaca 420 gatgagttct tgatgaagct tgttgcagat gcagagtgtg cgatttgcag ggaggtgtta 480 gttgtagatg acaagatgca agagttgccg tgcaagcata tgtttcaccc tccttgcttg 540 aagccatggc tggatgagca caactcttgt ccaatttgtc ggcatgagtt gctcacagat 600 gatcatcact atgagaactg gaaggagcgg gaaaaggaag cggaggagga aagaaaaggg 660 gctgctaatg cagttcgtga gggtgaatac atgtatgtat aa 702 <210> 2 <211> 233 <212> PRT <213> Capsicum annuum ABA-Induced RING Protein 1_CaAINR1 <400> 2 Met Pro Gly Phe Trp Asn Ala Gly Leu Gly Leu Phe Val Glu Ala Glu 1 5 10 15 His Leu Val Ser Gly Ser Ser Glu Lys Lys His Leu Gln Ser Cys Ile 20 25 30 Ser Gln Ala Arg Glu Gln Leu Thr Glu Val Gln Asn Glu Ser Gln Asn 35 40 45 Thr Thr Ser Thr Glu Asn Gly Ser Asn Arg Arg Phe Leu Phe Glu Gly 50 55 60 His Leu Thr Val Asp Pro Glu Pro Glu Gln Pro Ala Trp Leu Glu Leu 65 70 75 80 Ser Ser Gln Gly Asp Pro Ala Asn Val Asn Thr Thr Glu Gly Ala Arg 85 90 95 Arg Val Leu Glu Glu Leu Val Ala Arg Leu Asp Asp Ile Ile Pro Glu 100 105 110 Met Leu Asp Asp Gly Pro Ala Ala Pro Arg Ala Pro Pro Ala Ser Lys 115 120 125 Gln Val Val Ala Asn Leu Pro Val Ile Thr Val Thr Asp Glu Phe Leu 130 135 140 Met Lys Leu Val Ala Asp Ala Glu Cys Ala Ile Cys Arg Glu Val Leu 145 150 155 160 Val Val Asp Asp Lys Met Gln Glu Leu Pro Cys Lys His Met Phe His 165 170 175 Pro Pro Cys Leu Lys Pro Trp Leu Asp Glu His Asn Ser Cys Pro Ile 180 185 190 Cys Arg His Glu Leu Leu Thr Asp Asp His His Tyr Glu Asn Trp Lys 195 200 205 Glu Arg Glu Lys Glu Ala Glu Glu Glu Arg Lys Gly Ala Ala Asn Ala 210 215 220 Val Arg Glu Gly Glu Tyr Met Tyr Val 225 230

Claims (6)

1. 건조 또는 염 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 단백질을 암호화하며, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 CaAINR1 (Capsicum annuum ABA-Induced RING Protein 1) 유전자.
   
2. 제1항의 유전자 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 CaAINR1 (Capsicum annuum ABA-Induced RING Protein 1) 단백질을 유효성분으로 포함하는, 식물체의 건조 또는 염 스트레스 저항성 증진용 조성물.
   
3. 하기의 단계를 포함하는, 식물체의 건조 또는 염 스트레스 저항성 증진방법:
   (a) CaAINR1 (Capsicum annuum ABA-Induced RING Protein 1) 단백질을 암호화하는 서열번호 1의 유전자를 식물체에 형질전환하는 단계; 및
   (b) 상기 형질전환된 식물체에서 CaAINR1 단백질을 과발현시키는 단계.
   
4. 제3항에 있어서,
   상기 CaAINR1 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 방법.
   
5. 제3항의 방법에 의해 건조 또는 염 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 형질전환 식물체는 애기장대 (Arabidopsis)인 것을 특징으로 하는, 식물체.

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