CN116814678B

CN116814678B - CrUGT72B3基因或其相关生物材料在改良植物抗逆性中的应用

Info

Publication number: CN116814678B
Application number: CN202310846274.1A
Authority: CN
Inventors: 张昆; 米鑫丰; 翟晨元; 李岩; 李永龙
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2023-07-11
Filing date: 2023-07-11
Publication date: 2024-02-23
Anticipated expiration: 2043-07-11
Also published as: CN116814678A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及CrUGT72B3基因或其相关生物材料在改良植物抗逆性中的应用。所述生物材料为含有所述CrUGT72B3基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系，所述CrUGT72B3基因的序列如SEQ ID NO.1所示。在本发明中我们通过对过表达CrUGT72B3基因的拟南芥种子和幼苗进行耐盐性评价，发现CrUGT72B3基因提高了拟南芥的盐敏感性。同时，在盐胁迫过表达CrUGT72B3基因拟南芥中发现，胁迫响应相关基因和苯丙烷代谢通路相关基因的表达均显著低于野生型，推测CrUGT72B3基因可以通过调节盐胁迫响应基因和苯丙烷代谢途径来影响拟南芥的耐盐性。该结果表明CrUGT72B3基因参与了白颖苔草盐胁迫响应的分子调控机制进程，这为CrUGT72B3基因后续功能的深入研究奠定了重要基础。

Description

CrUGT72B3基因或其相关生物材料在改良植物抗逆性中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及CrUGT72B3基因或其相关生物材料在改良植物抗逆性中的应用。

背景技术

土壤盐渍化是制约全球农业生产的重要原因，是植物最典型的非生物胁迫之一。盐胁迫对草坪草生长发育具有多方面的影响，例如抑制种子萌发，降低草坪草的株高，使叶片发黄并出现卷曲，导致草坪草的枯萎和死亡。盐胁迫下草坪草可以通过增强膜质稳定性，改变离子含量、提高渗透调节能力以及其他生理生化途径降低盐胁迫带来的影响。掌握草坪草耐盐的分子机制对提高草坪草耐盐性和培育耐盐新品种具有重要意义。

糖基转移酶(Glycosyltransferases,GT,EC 2.4.x.y)是一类以活化的糖基供体为底物，通过催化糖基化反应，将活化的糖基从供体分子转移到受体分子，这一重要代谢进程影响机体的次生代谢。根据序列相似性和底物特异性识别，可以把糖基转移酶分为110个不同的家族，其中尿苷二磷酸糖基转移酶(UDP-glycosyltransferases,UGTs)又称糖基转移酶1号家族，是基因成员数量最多，功能最重要的一类。近年来在大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、玉米(Zea mays)等植物中均有关于UGT基因功能的报道，但研究最多且深入的还是在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中。Caroline Loutre等发现拟南芥中的UGT72B1可以在根部与持久性污染物3,4-二氯苯胺结合，使3,4-二氯苯胺糖基化以起到解毒作用，从而减少或消除除草剂造成的伤害。Chen等人研究发现，AtUGT76F1可以糖基化生长素的合成前体吲哚-3-丙酮酸(indole-3-pyruvic acid,IPyA)，生成IPyA葡萄糖缀合物，通过光信号调节拟南芥体内生长素稳态。N-羟基哌啶酸(N-hydroxypipecolic acid,NHP)是植物系统获得性抗性的一种调节因子，拟南芥ugt76b1突变体中没有NHP-糖苷积累对丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)防御反应增强，有助于增加植物抗病性。此外，水稻(Oryza sativa)GSA1对类黄酮和木质素醇单体具有糖基转移酶活性，过表达OsGSA1可以通过增强类黄酮物质的代谢来提高水稻对非生物胁迫的耐受性。以上研究表明UGT基因在植物的脱毒、激素平衡、防御反应、次生代谢等多个生物进程中发挥着重要作用。

近些年，研究表明UGT家族基因也参与了植物盐胁迫响应和耐盐性调节。研究发现分别过表达拟南芥中的UGT74D1、UGT79B2/B3和UGT76E11基因均可以提高植株对盐胁迫的耐受性。Tognetti等发现拟南芥UGT74E2基因可以与植物体中的吲哚-3-丁酸(indole-3-butyric acid,IBA)结合，IBA作为一种重要的调节因子，使植物中的过氧化氢和生长素处于稳态，从而增强转基因植物在水分和盐胁迫下的存活率。Dong等发现，AtUGT71B6可以将ABA转化成ABA-GE，从而提高拟南芥突变体atbg1在盐胁迫下的发芽率。除拟南芥外，在其他物种中也有少量关于UGT家族基因耐盐性功能的报道。例如，在木豆(Cajanus cajan)中发现CcUGT69基因在盐胁迫和渗透胁迫下表达显著上调。玉米中对突变体Mu689和Mu943进行盐胁迫处理，发现缺失UGT78D2基因导致种子发芽率和根茎的生长均受到显著抑制。Hu等研究发现，在拟南芥中过表达大豆GmUGT73F4基因，可以上调胁迫相关基因的表达和清除活性氧(ROS)，从而增强种子活力以及对盐等非生物胁迫的耐受能力。此外，Zhang等发现在拟南芥中过表达白颖苔草(Carex rigescens)CrUGT87A1基因可以调节类黄酮代谢，显著提高拟南芥的耐盐性。这些研究为后面挖掘UGT家族基因参与盐胁迫响应的分子机制提供重要理论基础。

白颖苔草(Carex rigescens)又名小羊胡子草，是莎草科苔草属植物，主要分布在我国河北、北京、山东等地方，因其返青早、绿期长、耐践踏和营养繁殖能力强，被广泛应用于城市绿化和固土护坡。先前对白颖苔草研究主要集中在种质资源评价和药用价值方面。通过对河北黄骅地区盐碱地的白颖苔草种质资源收集，发现该地区生长的植株在盐含量高(>0.3％)的土壤中较其他植物具有明显的耐盐性，但是具体如何调控植物的耐盐性还未知晓。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的之一，提供CrUGT72B3基因或其相关生物材料在改良植物抗逆性中的应用，所述生物材料为含有所述CrUGT72B3基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系，所述CrUGT72B3基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，所述抗逆性包括耐盐性。

更进一步的，所述植物包括白颖苔草和拟南芥。

更进一步的，所述CrUGT72B3基因在植物中的活性和/或表达量提高，所述植物的耐盐性提高。

本发明的目的之二，提供一种改良植物耐盐性的方法，包括上调CrUGT72B3基因的表达，从而使植物耐盐性提高，所述CrUGT72B3基因的序列如SEQ ID NO.1所示；

所述植物包括白颖苔草和拟南芥。

进一步的，上调CrUGT72B3基因的表达包括：将所述CrUGT72B3基因或含有该基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系转入植物中。

本发明的目的之三，提供一种定向选择或鉴定高耐盐性植物的方法，所述方法包括：鉴定测试植物中CrUGT72B3基因的表达，所述CrUGT72B3基因的序列如SEQ ID NO.1所示；

若是该测试植物的CrUGT72B3基因表达显著高于该类植物的平均表达值，则为高耐盐性植物；

所述植物包括白颖苔草和拟南芥。

进一步的，通过荧光定量PCR法鉴定测试植物中CrUGT72B3基因的表达。

更进一步的，荧光定量PCR法鉴定所用引物的序列如SEQ ID NO.10-11所示。

本发明具有如下有益效果：

本发明利用已获得的白颖苔草转录组数据库，克隆了该UGT差异蛋白基因CrUGT72B3的基因全长，通过生物信息学分析该基因的三级结构及蛋白理化性质，构建表达载体，并利用模式植物拟南芥对该基因在盐胁迫下的功能和调控机制进行了分析和验证，表达模式分析表明CrUGT72B3基因在盐胁迫处理下有较强的响应表达。对过表达CrUGT72B3基因的拟南芥种子和幼苗进行耐盐性评价，均发现CrUGT72B3基因提高了拟南芥的盐敏感性。同时，在盐胁迫过表达CrUGT72B3基因拟南芥中发现，胁迫响应相关基因和苯丙烷代谢通路相关基因的表达均显著低于野生型，推测CrUGT72B3基因可以通过调节盐胁迫响应基因和苯丙烷代谢途径来影响拟南芥的耐盐性。根据以上实验初步判定CrUGT72B3基因参与了白颖苔草盐胁迫响应的分子调控机制进程，这为CrUGT72B3基因后续功能的深入研究奠定了重要基础。

附图说明

图1为CrUGT72B3基因的克隆，其中，A：总RNA(28S，18S)；B：3’RACE(750bp)；C：5’RACE(400bp)；D：CrUGT72B3全长(1669bp)。

图2为CrUGT72B3蛋白信号肽(A，B)、疏水性(C)、跨膜结构(D)、蛋白质三级结构(E)的预测和保守结构域(F)。

图3为CrUGT72B3进化树分析。

图4为CrUGT72B3基因在不同胁迫下的表达量变化分析，其中，A：200mM NaCl处理；B：30％ PEG处理；C：4℃处理；D：100μM ABA处理；数据代表三次生物学重复的平均值±标准误差，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01。

图5为过表达CrUGT72B3基因拟南芥相对表达。

图6为过表达CrUGT72B3基因拟南芥在不同浓度NaCl处理下的发芽率，其中，A：0MmNaCl处理；B：100mM NaCl处理；C：150mM NaCl处理。WT:野生型拟南芥，OE8，OE24：过表达拟南芥株系；数据代表三次生物学重复的平均值±标准误差，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01。

图7为过表达CrUGT72B3基因拟南芥幼苗在盐胁迫下生长及生理指标，其中，WT：野生型拟南芥，OE8，OE24：过表达拟南芥株系，A：0mM NaCl处理；B：125mM NaCl处理；C：鲜重统计；D：根长统计；E：侧根数统计；数据代表三次生物学重复的平均值±标准误差，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01。

图8为盐胁迫下过表达CrUGT72B3基因拟南芥中胁迫相关基因和苯丙烷代谢相关基因的表达，其中，A：AtCOR47；B：AtDREB2；C：AtKIN1；D：AtP5CS；E：AtCOMT2；F：AtPAL1；WT:野生型拟南芥，OE8，OE24：过表达拟南芥；数据代表三次生物学重复的平均值±标准误差，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中涉及的供试材料、主要试剂、载体及菌株：

1供试材料

供试白颖苔草取自河北省黄骅市中捷农场，在青岛农业大学温室中培养。培养基质为营养土：蛭石：生土＝1:1:1。培养条件为温度(23±5)℃，光照强度7000～8000Lx，日照时间约为12h/d。供试拟南芥为′Columbia-0′型，由青岛农业大学草业学院保存。拟南芥培养箱培养条件为16/8h，相对湿度50％～60％，温度22/20℃，光照强度12000Lx。

2主要试剂、载体及菌株

RNA提取试剂盒购于普洛麦格(北京)生物技术有限公司；反转录试剂盒(PrimeScriptTM RT reagent kit with gDNA Eraser)、ExTaq DNA聚合酶、QuickCut核酸内切酶和荧光定量试剂盒(SYBR Premix Ex Taq Tli RNase H Plus)均购于TaKaRa公司；Plasmid Mini Kit I型试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司；Quick GelExtraction Kit纯化回收试剂盒、大肠杆菌感受态Trans1-T1 Phage Resistant购于北京全式金生物技术有限公司；克隆载体：pEASY-T5 Zero Cloning Kit和表达载体pBI121于青岛农业大学草业学院保存。

实施例1：白颖苔草CrUGT72B3基因的克隆

1总RNA的提取

用Trizol法对白颖苔草叶片中的总RNA进行提取，并用RNase Free DNase I对提取的RNA进行基因组DNA去除。采用超微量分光光度计(IMPLEN，德国)检测RNA纯度和浓度，A_260/280＝1.8～2.2，A_260/230>2.0，同时经1％琼脂糖凝胶电泳检测合格后即为可用RNA样品(图1A)，之后将RNA样品保存在-80℃冰箱中。

2基因的克隆

以总RNA为模板，进行反转录反应得到cDNA第一条链。反转录条件为37℃15min，85℃5s，4℃10min，获得白颖苔草cDNA序列。根据前期获得的转录本序列，利用Primer 5.0软件设计3′RACE和5′RACE引物(P1、P2)并参照RACE试剂盒说明书进行3′端和5′端的扩增。3′RACE的反应条件为94℃2min；98℃10s，55℃30s，72℃1min，35个循环；72℃5min，4℃保温。5′RACE的反应条件为94℃2min；98℃10s，55℃30s，72℃1min，35个循环；72℃5min，4℃保温。用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，之后纯化回收PCR产物并连接pEASY-T5载体转化Trans-T1大肠杆菌感受态，37℃培养12h左右，挑选单克隆菌落，经PCR鉴定为阳性后送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。利用DNAMAN和Primer 5.0软件对CrUGT72B3基因3′RACE和5′RACE测序后的序列进行拼接并设计引物(P3、P4)获得该基因的开放阅读框。根据获得的转录组数据库([SRA]accession No.SRX2755644)转录本序列(Contig511-2)，利用RACE技术分别获得了目的基因的3′序列长度约为750bp(图1B)，5′端序列长度约为400bp(图1C)。利用DNAMAN拼接获得序列长为1669bp(图1D)，提交NCBI数据库获得编号MT522031.1，序列如SEQ ID NO.1所示。该基因开放阅读框1434bp(序列如SEQ ID NO.1第146-1579位)，编码477个氨基酸。

表1引物及其用途

实施例2：白颖苔草CrUGT72B3基因生物信息学分析

通过ProtParam(https://web.expasy.org/protscale/)推测蛋白的分子量、等电点及氨基酸组成；通过在线网站Predictprotein(https://www.predictprotein.org/)预测蛋白质的二级结构及其在细胞中的定位，对该蛋白的定位进行初步预测；用SWISS-MODEL网站(https://www.swissmodel.expasy.org/)预测该蛋白的三级结构；用软件SignalP4.1Server(https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)预测蛋白信号肽；用TMHMM v.Server2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)预测蛋白跨膜结构；用NCBI网站BLAST功能对该序列进行同源比对，并通过Conserved Domain Database(CDD)软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)对CrUGT72B3基因所编码氨基酸序列的保守结构域进行分析；通过MEGA7.0软件构建进化树。

结果：rotParam分析表明CrUGT72B3基因编码的蛋白分子式为C₂₃₃₈H₃₆₈₁N₆₁₉O₆₉₆S₂₃，分子量为52.34kDa，理论等电点为5.56。SignalP 4.1Server初步预测CrUGT72B3氨基酸残基平均信号肽最大得分值为0.154，表明CrUGT72B3编码的蛋白不存在信号肽(图2A、2B)。对该蛋白疏水性预测分析GRAVY值为-0.145，表明该蛋白是亲水性蛋白(图2C)。TMHMMv.Server2.0分析表明CrUGT72B3编码的蛋白不存在跨膜区(图2D)。运用ConservedDomains Database(CDD)软件对CrUGT72B3基因所编码氨基酸序列的保守结构域进行分析，发现在7～466位氨基酸之间有一个保守结构域，表明该基因属于GT-B超级家族(图2F)。而GT-B型折叠由两个独立的Rossmann结构域组成，这两个结构域之间有连接位点和催化位点。GT-B家族的蛋白结构同时具有高度的保守性，特别是结合核苷酸的C末端区域。通过SWISS-MODEL网站同源建模发现模板蛋白的可信度及其与目标蛋白的匹配程度均较高(图2E)。

将CrUGT72B3基因氨基酸序列通过BLAST进行同源比对，通过MEGA7.0构建系统进化树发现该基因与刺子莞(Raphanus sativus)、康藏嵩草(Carex littledalei)、灯芯草(Juncus effuses)等的亲缘关系较近(图3)，刺子莞和康蔵嵩草与白颖苔草都同属于莎草科植物。

实施例3：CrUGT72B3基因在白颖苔草中的表达分析

将黄骅白颖苔草水培两个月，取生长情况大致相同的健康单株移至200mM NaCl、30％PEG、100μM ABA和4℃进行不同逆境的处理，并于处理后0、3和6h取根部样品，迅速放入液氮速冻后再放入-80℃冰箱保存，根据RNA试剂盒操作说明提取各样品总RNA，并反转录成cDNA，利用Primer 5.0软件设计PCR引物。CrUGT72B3基因定量引物和内参引物：

qCrHH-72B3-F:GCCAAAAGCCAGTTCATCCA(SEQ ID NO.10)；

qCrHH-72B3-R:GCGGGATGGAGTGTCTTGAT(SEQ ID NO.11)；

qCreIF-4α-F:CTCACGGGTTGGAGCGAGAA(SEQ ID NO.12)；

qCreIF-4α-R:CAGCAGAGAGGCATAGTCCCC(SEQ ID NO.13)。

利用CFX Connect荧光定量PCR仪(BIO-RAD，美国)进行qRT-PCR分析。反应体系：共20μl，cDNA 2μl、正反引物各0.8μl、TB Green Premix Ex TaqⅡ10μl、Rox Reference Pye0.4μl、ddH₂O 6μl；反应程序为95℃30s，95℃5s，60℃30s，40个循环。采用2^–ΔΔCT法计算CrUGT72B3基因在不同逆境处理下的相对表达量，实验设置3个技术重复。

结果：在多种非生物胁迫下均能诱导白颖苔草CrUGT72B3基因的表达，使其表达量增加。在NaCl胁迫下CrUGT72B3的表达量在3h时迅速增加，并在6h表达量到达高峰，为对照的16.6倍(P＜0.01)(图4A)；30％ PEG胁迫下CrUGT72B3的表达量随受胁迫时间增加而增加，在6h表达量到达高峰，此时表达量为对照的1.6倍(P＜0.01)(图4B)；4℃下CrUGT72B3的表达量呈先上升后下降的趋势，在3h达到顶峰，在6h迅速下降，3h时CrUGT72B3的表达量是对照组的0.4倍(P＜0.05)(图4C)；100μM ABA处理后，CrUGT72B3的表达量迅速上升，在6h到达顶峰，3h时是对照组的4.4倍，6h时对照组的32倍(P＜0.01)(图4D)；这些结果表明，CrUGT72B3的表达受多种胁迫的影响。

实施例4：pBI121-CrUGT72B3表达载体的构建及拟南芥的转化

选取pBI121载体上的BamHI、XbaI作为酶切位点，设计带酶切位点的引物，扩增CrUGT72B3基因全长序列。

CrUGT72B3-in-F：GAGAACACGGGGGACTCTAGAATGGAGAACGGTACGGAAGCA(SEQ IDNO.14)；

CrUGT72B3-in-R：GGACTGACCACCCGGGGATCCTCAGAATCCATTACAGCAACCACC(SEQ IDNO.15)；下划线为酶切位点。

利用BamHI与XbaI限制性内切酶酶切CrUGT72B3基因片段与pBI121载体质粒，反应结束后经1％琼脂糖凝胶电泳、纯化回收目的片段，用T4连接酶连接目的条带之后转化大肠杆菌，挑选单克隆菌落，将阳性克隆送去测序(生工生物工程(上海)股份有限公司)，经测序分析选择pBI121-CrUGT72B3序列正确的菌液，提取重组质粒转入农杆菌GV3101，利用花序侵染法转化拟南芥(参见Feng X,Xu Y,Peng L,et al.TaEXPB7-B,a β-expansin geneinvolved in low-temperature stress and abscisic acid responses,promotesgrowth and cold resistance in Arabidopsis thaliana[J].Journal of plantphysiology,2019,240:153004)。

将侵染后收获的拟南芥种子种在含卡那霉素(浓度为50mg/L)的1/2MS固体培养基中，筛选阳性过表达拟南芥。将阳性过表达拟南芥幼苗移栽到土中，取生长两周左右拟南芥叶片提取DNA，使用引物CrUGT72B3-F：ATGGAGAACGGTACGGAAGC(SEQ ID NO.16)和CrUGT72B3-R：AATCCATTACAGCAACCACC(SEQ ID NO.17)进行PCR鉴定过表达拟南芥阳性植株。同时提取过表达南芥阳性植株RNA，反转录成cDNA。反转录条件为37℃15min，85℃5s，4℃10min。以不同过表达拟南芥cDNA为模板，进行qRT-PCR反应。qRT-PCR反应体系：共20μl，cDNA 2μl、正反引物各0.8μl、TB Green Premix Ex TaqⅡ10μl、Rox Reference Pye 0.4μl、ddH₂O 6μl；反应程序为95℃30s，95℃5s，60℃30s，40个循环。采用2^–ΔΔCT法确定不同阳性株系的CrUGT72B3基因的相对表达量。CrUGT72B3基因定量引物为qCrHH-72B3-F和qCrHH-72B3-R。拟南芥内参基因为AtActin-F：AGCTAGAGACAGCCAAGAGC(SEQ ID NO.18)和AtActin-R：GCTTCCATTCCGATGAGCGA(SEQ ID NO.19)。

结果：构建表达载体pBI121-CrUGT72B3并利用农杆菌介导转化拟南芥，经卡那霉素筛选获得了11株过表达阳性拟南芥，经PCR检测得到的片段长度均与预期大小一致。利用qRT-PCR对阳性植株不同株系进行CrUGT72B3表达量分析，以野生型为对照组，发现过表达株系OE8的表达量最高为16.35，过表达株系OE24的表达量次之为9.12(图5)。选取过表达株系OE8和OE24进行盐胁迫分析。

实施例5：过表达CrUGT72B3基因拟南芥发芽试验

选择表达量较高的两个过表达拟南芥株系，纯化至T₃代。将转基因和野生型拟南芥种子灭菌清洗，均匀点种于含不同NaCl浓度(0，100和125mM)的1/2MS固体培养基中。每个浓度设置三个重复，每个重复含50粒拟南芥种子。点种后将培养皿避光4℃处理2d。2d后取出放于拟南芥培养箱中培养，同时开始统计9d内拟南芥不同株系的发芽率情况。

结果：统计了不同浓度NaCl的培养皿中处理9d过表达和野生型拟南芥种子发芽情况(图6)。结果表明在含0mM NaCl的培养皿中过表达和野生型拟南芥的种子发芽数没有明显区别，发芽率均接近100％(图6A)。而在含不同浓度NaCl的培养皿中处理第五天开始过表达拟南芥发芽率均低于野生型。处理第九天时，在含100mM NaCl的培养皿中，野生型拟南芥的发芽率为68.67％，过表达拟南芥OE8的发芽率为52.67％，过表达拟南芥OE24的发芽率为48.67％(图6B)，显著低于野生型拟南芥(P＜0.05)；在含150mM NaCl的培养皿中野生型拟南芥的发芽率为55.33％，过表达拟南芥OE8的发芽率为23.33％，过表达拟南芥OE24的发芽率为18.00％(图6C)，极显著低于野生型拟南芥(P＜0.01)。这表明过表达CrUGT72B3基因对盐处理下拟南芥种子的发芽有抑制作用。

实施例6：表达CrUGT72B3基因拟南芥盐处理试验

将过表达拟南芥OE24，OE8株系和野生型拟南芥幼苗移入含0mM NaCl和125mMNaCl的培养皿中，一周后对其生长情况进行统计分析(图7A、B)。结果表明在含0mM NaCl的培养皿中过表达拟南芥OE8，OE24与野生型拟南芥在鲜重、根长及侧根数方面没有显著差异(P＞0.05)。在含125mM NaCl培养皿中过表达拟南芥OE8和OE24的鲜重极显著低于野生型拟南芥(P＜0.01)，分别降下降18.84％和25.60％(图7C)；过表达拟南芥OE8和OE24的根长极显著短于野生型拟南芥(P＜0.01)，分别降低了24.31％和27.66％(图7D)；过表达拟南芥OE8和OE24侧根数与野生型拟南芥侧根数相比没有明显差异(P＞0.05)(图7E)。以上结果表明过表达CrUGT72B3基因降低了拟南芥幼苗对盐胁迫的适应能力。

实施例7：过表达CrUGT72B3基因拟南芥胁迫响应基因表达分析

将灭菌清洗后的转基因和野生型拟南芥种子点种于1/2MS固体培养基上，4℃避光处理2d后转移至拟南芥培养箱中培养，7d后将长势一致的转基因和野生型拟南芥幼苗移至装有蛭石和营养土(蛭石：营养土＝6:1)的花盆中培养。将生长三周后的拟南芥幼苗进行盐处理，盐浓度设置为200mM NaCl，处理14d后剪取叶片提取RNA，反转录cDNA后进行qRT-PCR分析。引物为：

qAtCOR47-F:GGAGTACAAGAACAACGTTCCCGA(SEQ ID NO.20)；

qAtCOR47-R:TGTCGTCGCTGGTGATTCCTCT(SEQ ID NO.21)；

qAtDREB1-F:GATCATGGCTTCGACATGGAG(SEQ ID NO.22)；

qAtDREB1-R:AGCCAACAAACTCGGCATCT(SEQ ID NO.23)；

qAtKIN1-F:AACAAGAATGCCTTCCAAGC(SEQ ID NO.24)；

qAtKIN1-R:CGCATCCGATACACTCTTTCC(SEQ ID NO.25)；

qAtP5CS-F:CAGCAAGCCGGGTATGAGAA(SEQ ID NO.26)；

qAtP5CS-R:AACACGACGAGAAGAACCCC(SEQ ID NO.27)；

qAtPAL1-F:CAACGTACCCGTTGATTCAG(SEQ ID NO.28)；

qAtPAL1-R:TCCTCGAAAGCTCCAATCTT(SEQ ID NO.29)；

qAtCOMT2-F:CGGTCAACGGTTCAACTCCAC(SEQ ID NO.30)；

qAtCOMT2-R:CCATCGTAGTCACGCCATCAA(SEQ ID NO.31)。

结果：分析盐胁迫响应基因的表达可以部分解释CrUGT72B3基因的耐盐分子机制。试验中测定了盐处理前后CrUGT72B3转基因和野生型拟南芥中盐响应基因COR47、DREB1、KIN1、P5CS的表达量(图8A～D)，qRT-PCR结果表明过表达拟南芥盐处理14d后COR47、DREB1、KIN1和P5CS基因表达水平均显著低于野生型拟南芥(P＜0.05或P＜0.01)，OE8较野生型拟南芥盐响应基因的表达量分别降低了48.93％、52.03％、43.57％和17.84％；OE24较野生型拟南芥盐响应基因的表达量分别降低了47.16％、49.59％、39.28％和16.68％。上述结果表明，过表达CrUGT72B3基因可能通过调控胁迫响应基因的表达降低拟南芥对盐胁迫的耐受性。

COMT2和PAL1基因与苯丙烷代谢途径相关，在过表达株系中其表达水平在盐处理前显著高于野生型拟南芥(P<0.01)，OE8分别升高了3.29倍和0.91倍；OE24升高了3.42倍和1.05倍，盐处理14d后过表达拟南芥COMT2和PAL1的基因表达水平显著低于野生型拟南芥(P<0.01)，OE8较野生型拟南芥降低了37.30％和33.53％；OE24较野生型拟南芥降低了35.11％和31.14％(图8E、F)。以上结果说明过表达CrUGT72B3基因可能通过调控苯丙烷代谢途径相关基因的表达降低拟南芥对盐胁迫的耐受能力。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims

1.CrUGT72B3基因或其相关生物材料在降低拟南芥耐盐性中的应用，其特征在于，所述生物材料为含有所述CrUGT72B3基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系，所述CrUGT72B3基因的序列如SEQ ID NO.1所示；所述CrUGT72B3基因在拟南芥中的表达量提高，所述拟南芥的耐盐性降低。

2.一种调控拟南芥耐盐性的方法，其特征在于，包括上调CrUGT72B3基因的表达，从而使拟南芥耐盐性降低，所述CrUGT72B3基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，上调CrUGT72B3基因的表达包括：将所述CrUGT72B3基因或含有该基因的表达盒、重组载体或重组菌转入拟南芥中。