CN116042698A - 一种快速高效的紫花苜蓿毛状根转化体系的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速高效的紫花苜蓿毛状根转化体系的建立方法，所述方法，包括以下步骤：1)含有marker基因发根农杆菌Ar.1193菌液的制备；2)用步骤1的菌株对苜蓿幼苗进行浸染，并培养；3)对步骤2培养得到的苜蓿幼苗进行毛状根测定。
Description
技术领域
本发明涉及紫花苜蓿生物技术领域，具体涉及一种快速高效的紫花苜蓿毛状根转化体系的建立方法。
背景技术
紫花苜蓿(Medicago sativa L.)因产量高、品质优、适口性好、适应性广，被誉为“牧草之王”，已成为全球最重要的饲料作物之一。因紫花苜蓿传统育种周期长、时间成本和经济成本大，所以近些年对紫花苜蓿的基因功能研究、基因编辑等生物育种研究开展的如火如荼。同时，紫花苜蓿也是研究根瘤和根部病害的理想植物，这就对苜蓿相关研究的技术手段提出了更多需求，特别是亟需高效快捷的各类遗传转化体系。
近年来，紫花苜蓿根癌农杆菌介导的叶盘转化体系已成功建立，但因周期长、效率不稳定等因素，对研究根部相关基因功能和评价基因编辑编辑体系具有耗时长风险大等缺点，应用受限。而近些年研究较多的毛状根体系是一种高效、快速的研究手段，尤其是对于一些对于根癌农杆菌转化不亲和与转化效率低的植物而言，是一种十分重要的研究技术手段，可以弥补根癌农杆菌介导的遗传转化的周期长不稳定等缺陷。
毛状根转化体系的建立借助发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)来实现，发根农杆菌是根瘤菌科(Rhizobiaceae)农杆菌属(Agrobasterium)的一种革兰氏阴性土壤细菌，它能够感染大多数双子叶植物和少数单子叶植物以及个别裸子植物。早在1907年就被发现可以诱导某些植物产生毛状根。发根农杆菌感染植物时，所携带的Ri质粒中的T-DNA片段进入植物细胞并整合到植物基因组中，利用植物的酶系统进行转录和表达，刺激植物产生毛状根。近年来，发根农杆菌介导的毛状根体系已成功应用于蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)、大豆(Glycine max)、花生(Arachis hypogaea L.)。赵恩华等通过侵染苜蓿叶片获得转化率为59.7％-67.9％的毛状根，但获得的毛状根因没有完整的茎叶结构无法独立存活，必须将这些毛状根进行愈伤培养直至成苗，整个周期约6-8个月，周期较长。所以，本发明拟开发了一套紫花苜蓿高效快捷毛状根转化体系，2-3周可获得毛状根，4周可获得毛状根转化的健壮植株。该方法为研究紫花苜蓿基因功能提供一个强有力的技术手段。同时，高效紫花苜蓿CRISPR/Cas基因编辑体系还在建立和完善中，建立的毛状根体系可快速评价基因编辑效率，加速CRISPR/Cas基因编辑体系的建立，以期紫花苜蓿在分子水平进行更深层次的研究，在深入挖掘基因功能、遗传育种等领域取得了突破性的进展。
发明内容
本发明的目的是针对紫花苜蓿现有遗传转化周期长、转化效率不稳定等问题，提供一种原创的转化率高，转化周期短的毛状根转化方法，为紫花苜蓿基因功能研究提供转化方法，同时也为基因编辑体系的建立提供快捷的评价方法，及分子水平研究提供重要扩繁技术。
本发明提供一种紫花苜蓿毛状根转化率的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)含有marker基因发根农杆菌Ar.1193菌液的制备；
2)用步骤1的菌株对苜蓿幼苗进行浸染，并培养；
3)对步骤2培养得到的苜蓿幼苗进行毛状根测定。
本发明所述的方法，其中，步骤1所述的菌液的制备，方法如下：将marker基因转入到pCAMBIA3301超表达载体后，转到发根农杆菌Ar.1193菌株中，阳性单克隆转接于3-5mL含有相应抗生素(Rif 10mg/mL+Kan 50mg/mL)的TY液体培养基中，28-30℃摇床培养16-24h，将活化好的菌液4000r/min离心10min后，用500μL不含抗生素的TY液体培养基重悬备用。取200μL活化菌液，正常涂板至相应抗性的TY固体培养基中，28-30℃培养10-16h，得到菌液。
其中，所述的TY培养基(1L)配方：胰蛋白胨(Tryptone)5g，酵母提取物(Yeastextract)3g，氯化钙(CaCl2)0.6g，灭菌备用。
本发明所述的方法，步骤2所述的浸染，方法如下：
将胚根约1-1.5cm的苜蓿幼苗切掉根尖3-5mm后，用镊子夹住幼苗子叶，切口处轻轻蘸取TY平板上的步骤1得到的菌株后，转入改良的Fahraeus培养基的方皿中进行培养。
或者，本发明所述的方法，步骤2所述的浸染，方法如下：
将胚根约1-1.5cm的苜蓿幼苗切掉根尖3-5mm后，用镊子夹住幼苗子叶，切口处轻轻蘸取TY平板上的步骤1得到的菌株后，将侵染后的幼苗在Fa培养基中22℃竖直培养7d，16h光照/8h黑暗，一周后，将胚根附近长出的根完全切掉，防止假阳性的出现，但是胚根底部膨大部分不可切掉，将植株转入改良的Fahraeus培养基的方皿中，22℃竖直培养7-10d，16h光照/8h黑暗，1-2周后，将幼苗根上的琼脂在流水下小心并且彻底的洗除，通过水培或土培培养7-10d，幼苗健壮不萎蔫，即可用于检测。
其中，所述改良的Fahraeus培养基的配制方法如下：配方(1L)：MgSO4·7H2O(0.5mM)、KH2PO4(0.7mM)、Na2HPO4·7H2O(0.8mM)、NH4NO3(0.5mM)、MnCl2(0.1ug/L)、CuSO4(0.1ug/L)、ZnCl2(0.1ug/L)、H3BO3(0.1ug/L)、Na2MoO4(0.1ug/L)、Ferric Citrate(0.02mM)、CaCl2·2H2O(0.9mM)，以上溶液按照终浓度加量后定容于1L蒸馏水中，pH调至6.8后加入琼脂8g，灭菌。本发明所述的方法，其中，步骤3所述的测定，方法如下：
转入的载体中含有荧光标记的，将植株置于荧光体式显微镜下进行测定，转入的载体中不含有荧光标记的，进行PCR测定。
其中所述PCR测定，方法如下：根据pCAMBIA3301超表达载体和基因序列，设计扩增引物，上游取自于pCAMBIA3301超表达载体，下游取自于甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(F：GACGTAAGGGATGACGCACA，R：
GATCACGGTGGCTAGCATCA)。提取毛状根DNA，PCR扩增后，统计阳性率。具体方法见本发明实施例。
本发明所述的方法，其中所述的苜蓿幼苗，制备方法如下：将苜蓿种子放到15-50mL离心管中，首先用ddH2O清洗3次，每次间隔2min用涡旋振荡器轻轻震荡，接着用75％的酒精消毒5min，再用ddH2O清洗3次，最后转移至30％次氯酸钠清洗20min后，用ddH2O清洗3次后放置于MSO固体培养基中，保鲜膜封口后用锡箔纸包裹置于4℃冰箱1-2天，接着转入25℃光照培养箱中(16h光/8h暗)2-3天，其中，所述MSO固体培养基(1L)配制如下：MS培养基2.22g，蔗糖8.0g，琼脂7.0g，pH调至5.8，灭菌。
本发明所述的方法，其中marker基因的克隆，方法如下：为了验证毛状根转化效率，克隆参与苜蓿根腐病抗性调控的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(MSgene72216)基因作为验证体系的marker基因。通过已完成测序的新疆大叶序列，获得甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(MSgene72216)基因的CDS区，设计引物，PCR扩增后构建到T载体中备用。
本发明所述的方法，其中用到菌板，可采用如下方法制备：将marker基因通过酶切连接转入到pCAMBIA3301超表达载体后，转到发根农杆菌Ar.1193菌株中，阳性单克隆转接于3-5mL含有相应抗生素(Rif 10mg/mL+Kan 50mg/mL)的TY液体培养基中，28-30℃摇床培养12-3h，将活化好的菌液4000r/min离心10min后，用500μL不含抗生素的TY液体培养基重悬备用。取200μL活化菌液，正常涂板至相应抗性的TY固体培养基中，28-30℃培养10-16h。其中TY培养基(1L)配制：胰蛋白胨(Tryptone)5g，酵母提取物(Yeast extract)3g，氯化钙(CaCl2)0.6g，灭菌备用。(固体培养基加15g琼脂灭菌倒板备用)。
本发明所述的方法，其中改良的Fahraeus培养基配制方法见表1。
表1改良的Fahraeus培养基配制
注：配置培养基时，分别加入100mL大量、1mL微量、4mL柠檬酸铁、1mL CaCl2母液定容于1L蒸馏水中，pH调至6.8后加入琼脂8g，高压灭菌后倒板备用。本发明所述改良的Fahraeus营养液，是根据Fahraeus营养液进行调整，特别是增加了CaCl2浓度，钙元素对于生根起着重要的作用，侵染后打通钙离子通道，在根尖部位促进分生组织的再生，促进根尖、根系快速生长，稳固细胞壁，加强木质结构，提高毛状根转化后根系再生率和转化率，因根系发达，可促进植株营养吸收达到壮苗效果。形成改良的Fahraeus营养液，具体以本发明的配方为准。
本发明所述的方法，步骤2所述的浸染后需要对浸染的幼苗进行培养，培养可以采用以下方法：
共培养：将侵染后的幼苗在改良的Fahraeus培养基22℃竖直培养7d，16h光照/8h黑暗。(注：培养前3天可将培养皿稍倾斜，待有根长出后再完全竖直培养)一周后，将胚根附近长出的根完全切掉，防止假阳性的出现，但是胚根底部膨大部分不可切掉。
或者选择培养：将二次切根后的植株转入含相应抗生素(植物载体抗生素)的改良的Fahraeus培养基的方皿中。22℃竖直培养7-10d，16h光照/8h黑暗。培养前3天可将培养皿稍倾斜，待有根长出后再完全竖直培养。1-2周后，将幼苗根上的琼脂在流水下小心并且彻底的洗除，通过水培或沙培培养，用于后续鉴定和研究。以下为本发明名称术语的说明以及来源
marker基因：指为了验证毛状根转化效率，选用的作为标记的基因，可为任一拟转入的基因，本实施例中选用的是甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(MSgene72216)基因。
引物F(ATGGCTTCGGCTACTTTCT CTGTAG)：为扩增甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(MSgene72216)设计的上游引物引物R(TCACTTCCAGTTATTGGCAACAATG)：为扩增甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(MSgene72216)设计的下游引物。
高保真酶：一种用于基因克隆的DNA聚合酶，PCR时错配率比普通聚合酶低，保真性好。
限制性内切酶NcoI和BstEII：是限制性核酸内切酶，可将双链DNA切开，用于载体和目的基因的连接。
表达载体pCAMBIA3301：是植物常用的基因表达载体，用于植物转基因。胶回收试剂盒(诺唯赞生物公司)：用于琼脂糖凝胶DNA回收，购自诺唯赞生物公司。
无缝克隆试剂盒(诺唯赞生物公司)：是一种新型的基于插入片段和线性化载体的末端进行同源重组的基因克隆试剂盒。本试剂盒利用包含了DNA5′外切酶(5′Exonuclease)、DNA聚合酶(DNAPolymerase)和DNA连接酶(DNALigase)活性的重组酶(assembly enzyme)，通过同源重组的方法可以将一个或多个DNA片段按照预定方向、快速、高效地插入到线性化载体中。
大肠杆菌感受态细胞DH5α：采用大肠杆菌DH5α菌株经特殊工艺制备得到，可用于DNA的化学转化。
LB固体培养基(50mg/mL Kan)：含有50mg/mL的卡那霉素筛选剂的LB固体培养基，LB固体培养基配制(1L)：酵母提取物5g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂15g，高压灭菌备用。
质粒抽提试剂盒(诺唯赞生物公司)：用于质粒DNA的提取，购自诺唯赞生物公司。
MS(Murashige&Skoog Basal Medium With Vitamins)：组织培养常用的基础培养基。
发根农杆菌Ar.1193菌株：是发根农杆菌的一种菌株，还有pRi119农杆碱型Ri质粒，适合豆科、茄科植物毛状根的诱导，购自上海唯地生物技术有限公司。抗生素(Rif10mg/mL+Kan 50mg/mL)：还有10mg/mL利福平和50mg/mL卡那霉素筛选剂
TY液体培养基：胰蛋白胨(Tryptone)5g，酵母提取物(Yeast extract)3g，氯化钙(CaCl2)0.6g，用ddH2O定容至1L，高压灭菌后用于发根农杆菌Ar.1193菌株的培养。
TY固体培养基：胰蛋白胨(Tryptone)5g，酵母提取物(Yeast extract)3g，氯化钙(CaCl2)0.6g，15g琼脂，ddH2O定容至1L，高压灭菌倒板用于发根农杆菌Ar.1193菌株的培养。
改良Fahraeus培养基：根据Fahraeus营养液进行调整，特别是增加了CaCl2浓度，钙元素对于生根起着重要的作用，侵染后打通钙离子通道，在根尖部位促进分生组织的再生，促进根尖、根系快速生长，稳固细胞壁，加强木质结构，提高毛状根转化后根系再生率和转化率，因根系发达，可促进植株营养吸收达到壮苗效果。形成改良的Fahraeus营养液，具体以本发明的配方为准。
选择培养：为了提高毛状根转化的效率和抑制发根农杆菌Ar.1193菌株的生长，在毛状根培养时在培养基加入相应抗生素来提高转化效率。
本发明具有的优点及有益效果如下：
1.本发明建立的紫花苜蓿毛状根转化体系，可在3-4周获得毛状根，转化效率和根再生率可达98.6％，大大缩短了转化周期。且具有方便快捷和省时省力的优点，而且获得的毛状根植株生长一致性较好，苗健壮，可用于分子育种研究中。
2.本发明中毛状根转化过程中，采用改良的Fahraeus营养液，该营养液低营养但钙离子浓度高，促进根尖分生组织的生长，根系健壮发达、生根率高且稳定。
3.本发明中建立的毛状根评价体系即可作为基因研究的转化体系又可作为基因编辑效率的评价体系。目前，紫花苜蓿基因编辑体系还在优化和完善过程中，在T0很难获得纯合突变植株，所以在优化基因编辑体系时，急需周期短高效的评价体系，本发明侵染后2-3周就可获得毛状根用于基因编辑效率评价，大大缩短评价的时间。
4.本发明立足实际，具有重要的创新和应用价值，其实用性和可操作性强，成本低廉，可广泛应用于紫花苜蓿基因功能研究和分子育种中，亦可对其他植物毛状根转化体系的建立提供参考，具有广阔的应用前景和技术成果转化潜力。
附图说明
图1为marker基因的克隆电泳图。
图2为紫花苜蓿毛状根转化流程图。
图3为毛状根转化植株的阳性率验证图。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：
1)marker基因的克隆：为了验证毛状根转化效率，克隆参与紫花苜蓿根腐病抗性调控的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(MSgene72216)基因作为验证体系的marker基因。通过转录组数据，获得参考基因组新疆大叶的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(MSgene72216)基因的CDS区，设计克隆引物(F：ATGGCTTCGGCTACTTTCT CTGTAG，R：TCACTTCCAGTTATTGGCAACAATG)，使用高保真酶2×
Flash Master Mix(Dye Plus)(Vazyme#P520，对(MSgene72216)基因片段进行PCR扩增，使用限制性内切酶NcoI和BstEII对表达载体pCAMBIA3301进行双酶切，将扩增产物和酶切产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，使用胶回收试剂盒(诺唯赞生物公司)进行切胶回收。用ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit无缝克隆试剂盒(诺唯赞生物公司)将载体和(MSgene72216)基因的回收产物连接，连接产物转入大肠杆菌感受态细胞DH5α后在LB固体培养基(50mg/mL Kan)上涂板，37℃培养箱培养至过夜，挑选阳性单克隆后测序，测序正确后用质粒抽提试剂盒(诺唯赞生物公司)提取质粒备用。
2)种子处理与萌发：将无棣紫花苜蓿种子放到15mL离心管中，首先用ddH2O清洗3次，每次间隔2min用涡旋振荡器轻轻震荡。接着用75％的酒精消毒5min，再用ddH2O清洗3次。最后转移至30％次氯酸钠清洗20min后，用ddH2O清洗3次后放置在灭好菌的滤纸上吸取多余的水分于MSO固体培养基中，保鲜膜封口后用锡箔纸包裹置于4℃冰箱2天。接着转入25℃光照培养箱中(16h光/8h暗)2天，此时幼苗长出两片子叶，下胚轴约1-1.5cm左右进行侵染。其中，MSO固体培养基(1L)配制如下：MS(Murashige&Skoog Basal Medium WithVitamins)2.22g，蔗糖8.0g，琼脂7.0g，pH调至5.8，灭菌倒板备用；
3)菌板准备：将marker基因构建到pCAMBIA3301超表达载体后，阳性克隆转到发根农杆菌Ar.1193菌株中，阳性单克隆转接于5mL含有相应抗生素(Rif 10mg/mL+Kan 50mg/mL)的TY液体培养基中，28℃摇床培养12h，将活化好的菌液4000r/min离心10min后，用500μL不含抗生素的TY液体培养基重悬备用。取200μL活化菌液，正常涂板至相应抗性(Rif10mg/mL+Kan 50mg/mL)的TY固体培养基中，28℃培养14h。其中TY培养基(1L)配制：胰蛋白胨(Tryptone)5g，酵母提取物(Yeast extract)3g，氯化钙(CaCl2)0.6g，灭菌备用。(固体培养基加15g琼脂灭菌倒板备用)。
4)侵染：将胚根约1-1.5cm的苜蓿幼苗切掉根尖3-5mm(根据种子幼苗的长短，可略有变化)后，用镊子夹住幼苗子叶，切口处轻轻蘸取TY平板上的菌后，转入改良的Fahraeus培养基的方皿(10*10cm)中进行共培养。其中改良的Fahraeus培养基配制方法见表1。
表1改良的Fahraeus培养基配制
注：配置培养基时，分别加入100mL大量、1mL微量、4mL柠檬酸铁、1mL CaCl2母液定容于1L蒸馏水中，pH调至6.8后加入琼脂8g，高压灭菌后倒板备用。5)共培养：将侵染后的幼苗在Fahraeus培养基22℃竖直培养7d，16h光照/8h黑暗。培养前3天可将培养皿稍倾斜，待有根长出后再完全竖直培养。一周后，将胚根附近长出的根完全切掉，防止假阳性的出现，但是胚根底部膨大部分不可切掉。
6)选择培养：将二次切根后的植株转入含相应植物抗生素(Kan 50mg/mL)的改良的Fahraeus培养基的方皿中。22℃竖直培养10d，16h光照/8h黑暗。切根后前3-5天可稍倾斜培养，待有根长出后再完全竖直培养，10d后，将幼苗根上的琼脂在流水下小心并且彻底的洗除，通过水培或土培培养，用于后续鉴定和研究；
7)毛状根转化植株的验证：通过PCR扩增进行验证，根据pCAMBIA3301超表达载体和基因序列，设计扩增引物，上游取自于pCAMBIA3301超表达载体，下游取自于甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(F:GACGTAAGGGATGACGCACA，R:GATCACGGTGGCTAGCATCA)。以提取毛状根DNA为模板，选用擎科高保真酶I5进行PCR扩增，扩增体系和扩增条件如下：
表2PCR扩增反应体系
表3基因扩增反应条件
PCR结束后，在PCR产物中加4μL的10×Loading Buffer混匀，在1％的琼脂糖上进行电泳(120V，20min)，电泳结束后在凝胶成像仪观察结果，若有目的条带，证明载体和基因已经转入到毛状根中，是阳性苗，根据条带统计阳性率。
荧光检测方法：如转入载体含GFP等荧光报告基因，目的基因和GFP等荧光报告基因形成融合表达蛋白，可将转化的毛状根通过荧光显微镜进行观察，如载体和目的基因转入，荧光报告基因被表达，可在根部显示荧光，如没有转入根部，根部不显示荧光，以此来鉴定阳性率。
按照上述实施例的方法，通过统计毛状根70株，发现其中70株小苗在切口处都有毛状根生长出，即毛状根发生率为100％。根据PCR验证，阳性毛状根转化率为98.6％。
本发明通过以下具体操作：
1)marker基因的过表达载体构建；
2)通过建立的毛状根转化方法将构建载体转入紫花苜蓿；
3)毛状根植株的培养；
4)毛状根转化效率的鉴定。
主要用于解决紫花苜蓿快速高效毛状根体系的缺失，为紫花苜蓿根部相关基因的功能研究提供高效的转化方法，同时也为基因编辑载体编辑效率的评价提供快速的评价手段。本方法可在15-20天获得健康的阳性毛状根植株用于后续的研究，且阳性转化率可达98.6％，极大的缩短了研究时间成本和经济成本。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种紫花苜蓿毛状根转化率的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)含有marker基因发根农杆菌Ar.1193菌液的制备；
2)用步骤1的菌株对苜蓿幼苗进行浸染，并培养；
3)对步骤2培养得到的苜蓿幼苗进行毛状根测定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1所述的菌液的制备，方法如下：将marker基因转入到pCAMBIA3301超表达载体后，转到发根农杆菌Ar.1193菌株中，阳性单克隆转接于3-5mL含有相应抗生素(Rif 10mg/mL+Kan50mg/mL)的TY液体培养基中，28-30℃摇床培养16-24h，将活化好的菌液4000r/min离心10min后，用500μL不含抗生素的TY液体培养基重悬备用。取200μL活化菌液，正常涂板至相应抗性的TY固体培养基中，28-30℃培养10-16h，得到菌液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的TY培养基(1L)配方：胰蛋白胨(Tryptone)5g，酵母提取物(Yeast extract)3g，氯化钙(CaCl2)0.6g，灭菌备用。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2所述的浸染，方法如下：将胚根约1-1.5cm的苜蓿幼苗切掉根尖3-5mm后，用镊子夹住幼苗子叶，切口处轻轻蘸取TY平板上的步骤1得到的菌株后，转入改良的Fahraeus培养基的方皿中进行培养。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2所述的浸染，方法如下：将胚根约1-1.5cm的苜蓿幼苗切掉根尖3-5mm后，用镊子夹住幼苗子叶，切口处轻轻蘸取TY平板上的步骤1得到的菌株后，将侵染后的幼苗在Fa培养基中22℃竖直培养7d，16h光照/8h黑暗，一周后，将胚根附近长出的根完全切掉，防止假阳性的出现，但是胚根底部膨大部分不可切掉，将植株转入改良的Fahraeus培养基的方皿中，22℃竖直培养7-10d，16h光照/8h黑暗，1-2周后，将幼苗根上的琼脂在流水下小心并且彻底的洗除，通过水培或土培培养7-10d，幼苗健壮不萎蔫，即可用于检测。
6.根据权利要求4或5任意一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述改良的Fahraeus培养基的配制方法如下：配方(1L)：MgSO4·7H2O(0.5mM)、KH2PO4(0.7mM)、Na2HPO4·7H2O(0.8mM)、NH4NO3(0.5mM)、MnCl2(0.1ug/L)、CuSO4(0.1ug/L)、ZnCl2(0.1ug/L)、H3BO3(0.1ug/L)、Na2MoO4(0.1ug/L)、Ferric Citrate(0.02mM)、CaCl2·2H2O(0.9mM)，以上溶液按照终浓度加量后定容于1L蒸馏水中，pH调至6.8后加入琼脂8g，灭菌。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3所述的测定，方法如下：转入的载体中含有荧光标记的，将植株置于荧光体式显微镜下进行测定，转入的载体中不含有荧光标记的，进行PCR测定。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的苜蓿幼苗，制备方法如下：将苜蓿种子放到15-50mL离心管中，首先用ddH2O清洗3次，每次间隔2min用涡旋振荡器轻轻震荡，接着用75％的酒精消毒5min，再用ddH2O清洗3次，最后转移至30％次氯酸钠清洗20min后，用ddH2O清洗3次后放置于MSO固体培养基中，保鲜膜封口后用锡箔纸包裹置于4℃冰箱1-2天，接着转入25℃光照培养箱中(16h光/8h暗)2-3天，其中，所述MSO固体培养基(1L)配制如下：MS2.22g，蔗糖8.0g，琼脂7.0g，pH调至5.8，灭菌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310023292.XA CN116042698A (zh) | 2023-01-09 | 2023-01-09 | 一种快速高效的紫花苜蓿毛状根转化体系的建立方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310023292.XA CN116042698A (zh) | 2023-01-09 | 2023-01-09 | 一种快速高效的紫花苜蓿毛状根转化体系的建立方法 |
Publications (1)
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|---|---|
| CN116042698A true CN116042698A (zh) | 2023-05-02 |
Family
ID=86125138
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310023292.XA Withdrawn CN116042698A (zh) | 2023-01-09 | 2023-01-09 | 一种快速高效的紫花苜蓿毛状根转化体系的建立方法 |
Country Status (1)
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| CN (1) | CN116042698A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116814678A (zh) * | 2023-07-11 | 2023-09-29 | 青岛农业大学 | CrUGT72B3基因或其相关生物材料在改良植物抗逆性中的应用 |
-
2023
- 2023-01-09 CN CN202310023292.XA patent/CN116042698A/zh not_active Withdrawn
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116814678A (zh) * | 2023-07-11 | 2023-09-29 | 青岛农业大学 | CrUGT72B3基因或其相关生物材料在改良植物抗逆性中的应用 |
| CN116814678B (zh) * | 2023-07-11 | 2024-02-23 | 青岛农业大学 | CrUGT72B3基因或其相关生物材料在改良植物抗逆性中的应用 |
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