CN108070594B - 烟草腺毛ttr1启动子、其表达载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种烟草腺毛特异表达的TTR1启动子、其表达载体及其应用，该TTR1启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO.1；设计用于植物遗传转化的真核表达载体，该载体具有TTR1启动子序列；TTR1启动子在启动目的基因表达、烟草腺毛组织发育调控机制、腺毛中香气物质形成、烟草品质的改良中的应用；设计TTR1启动子启动GUS基因表达的方法：将启动子插入含GUS基因的表达载体，以替换表达载体中已有的启动子，得重组质粒；将重组质粒导入受体植物并培育。本发明的烟草腺毛TTR1基因启动子可驱动GUS基因在烟草腺毛中特异性表达，能作为植物遗传转化表达外源基因及烟草生物反应器的表达元件，对烟草腺毛组织发育调控、腺毛中香气物质形成、烟草品质改良具重要价值。

Description

烟草腺毛TTR1启动子、其表达载体及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种烟草腺毛TTR1启动子、其表达载体及其应用。

背景技术

植物表皮毛分为单细胞和多细胞两种形态，它覆盖于大部分植物地面表皮组织，对驱避蚜虫、防御病毒侵袭，以及应对干旱、紫外照射等逆境胁迫有着重要作用。拟南芥表皮毛为单细胞结构，而烟草、金鱼草、番茄等表皮毛为多细胞结构的腺毛。

烟草叶面腺毛分泌物构成了叶面化学的重要组成部分，其中，烟草腺毛主要分泌物-西柏烷类化合物是烟叶重要的香气前体物质。因此，烟草腺毛不仅影响到烟草的抗逆能力，同时还对烟叶的品质起到重要作用。同时，因为烟草腺毛能够分泌很多化学物质，因此烟草腺毛也被比喻为烟草叶面化学物质合成的工厂。

长期以来，关于腺毛的研究大多集中在农艺栽培措施、环境因子对腺毛密度及叶面化学成分的影响上，对腺毛发生分子机制的研究进展缓慢，使得针对烟草腺毛密度及叶面化学成分改良的品种选育和栽培措施优化缺乏理论支撑和物质基础。

目前，在烟草中表达目的基因普遍使用组成型启动子，如烟草花叶病毒启动子35S启动子（CaMV35），这类启动子虽然能够引导目的基因在植物的大部分组织和器官中表达，但是易对植物的正常生长发育造成负面影响。而能够在烟草腺毛中特异表达的启动子相对较少。

因此，开发烟草腺毛特异表达启动子，对于烟草腺毛组织发育调控机制和腺毛中香气物质形成的研究以及烟草品质的改良方面都具有重要的运用价值。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种烟草腺毛TTR1启动子、其表达载体及其应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

克隆一种烟草腺毛TTR1启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

设计一种用于植物遗传转化的真核表达载体，该载体具有所述的烟草腺毛TTR1启动子序列。

所述烟草腺毛TTR1启动子在启动目的基因表达中的应用。

所述烟草腺毛TTR1启动子在烟草腺毛组织发育调控机制中的应用。

所述烟草腺毛TTR1启动子在烟草腺毛中香气物质形成中的应用。

所述烟草腺毛TTR1启动子在烟草品质的改良中的应用。

设计一种所述烟草腺毛TTR1启动子启动GUS基因表达的方法，包括以下步骤：

（1）将所述烟草腺毛TTR1启动子插入含GUS基因的表达载体，以替换所述表达载体中已有的启动子，得到重组质粒；

（2）将所得重组质粒导入受体植物并进行培育，在所述受体植物中由所述烟草腺毛TTR1启动子启动所述重组质粒中的GUS基因表达。

优选的，所述受体植物为烟草。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：

1.本发明分离出了一种烟草腺毛TTR1基因的启动子序列，提供的启动子序列可驱动GUS基因在烟草中表达，能作为植物遗传转化表达外源基因及烟草生物反应器所用的表达元件。

2.本发明中提供的启动子为烟草内源性的，是能够特异在烟草腺毛中表达的启动子，该启动子能够克服组成型启动子非特异、持续、高效表达所造成的浪费，减少目的基因对烟草其它组织正常生长的影响，同时增加目的基因在烟草腺毛中表达的效果。

3.本发明中提供的启动子能够在烟草中特异表达目的基因，这有利于对烟草腺毛发育调控机制的研究。

4.本发明中提供的启动子能够特异调控抗逆或者香气基因在烟草腺毛中表达，该启动子的运用对于改良烟草品质具有重要意义。

附图说明

图1为PTTR1-GUS-PH7GW2载体图谱图；

图2为PTTR1-GUS-PH7GW2转基因烟草叶片GUS染色图；

图3为PTTR1-GUS-PH7GW2转基因烟草叶片边缘GUS染色图；

图4为野生型烟草叶片边缘GUS染色图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例一：烟草培育

将烟草种子用75%酒精消毒后，均匀撒在MS固体培养基上进行培养，培养条件为25℃，每天光照14小时，培养4～7周，备用。

实施例二：PTTR1-PH7GW2载体构建

烟草腺毛TTR1启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，表达载体采用pH7WG2载体。

（1）酶切位点分析：对TTR1启动子序进行酶切位点分析发现其序列中不具有SacI和SpeI两个酶切位点，因此，选用这两个位点为连接酶位点；

（2）酶切：用内切酶SacI和SpeI将pH7WG2载体中的P35s启动子切除，酶切反应体系为：25 μl pH7WG2 质粒（200 ng/μl）；1 μl 限制性内切酶1（15 U/μl）；1ul 限制性内切酶2（15 U/μl）；5 μl 限制性内切酶反应10× Buffer；18 μl 水；总体积为50 μl；37℃水浴 3小时；

（3）切胶回收载体骨架：跑凝胶电泳，进行切胶回收质粒骨架片段，再用DNA回收试剂盒对DNA片段进行回收，备用；

（4）PCR扩增TTR1启动子序列：使用CTAB法提取烟草叶片基因组总DNA，再进行TTR1启动子序列PCR扩增；

PCR 反应体系为：2 μl 基因组DNA（100 ng/μl）；1 μl Primer Star DNA 聚合酶；2 μl 引物1（10 μM）；2 μl 引物2（10 μM）；10 μl 5× PCR反应 Buffer；4 μl dNTPs（2.5mM）；29 μl 水；总体积为50 μl；

反应程序为：94℃预变性 3 min ；94℃ 20 s，65℃ 20 s，72℃ 3 min，35个循环；72℃延伸 10 min；16℃保温；

用于扩增TTR1启动子序列的引物序列如表1中所示：

表1 引物序列及用途

；

（5）电泳检测：PCR扩增结束后，进行凝胶电泳检测是否扩增到TTR1启动子序列，结果显示在2889bp的位置会有一个明显条带；

（6）切胶回收启动子DNA：电泳结束后，将TTR1启动子DNA从凝胶中切下，并用DNA回收试剂盒进行DNA片段回收；

（7）酶切和灭活：用SacI和SpeI两个内切酶酶切回收后的TTR1启动子DNA片段；

酶切反应体系为：7 ul TTR1启动子DNA片段（50 ng/μl）；1 ul 限制性内切酶1（15U/μl）；1 ul 限制性内切酶 2（15 U/μl）；1 ul 限制性内切酶反应10× Buffer；总体积为10 μl；37℃水浴3小时后，80℃灭活5分钟，使内切酶彻底失去活性；

（8）载体连接：将回收后的载体骨架和酶切后的TTR1启动子DNA片段进行连接；

连接反应体系：1 μl 载体骨架；3 μl TTR1启动子DNA片段；1 μl T4连接酶；1 μl10×T4连接酶Buffer；4 μl 水；总体积为10 μl；22℃连接2小时；

（9）筛选：热激转化DB3.1菌株，并用壮观霉素抗性的LB平板进行筛选，提取阳性克隆中的重组载体，获得改造后的PTTR1-PH7GW2载体，备用。

实施例三：PTTR1-GUS-PH7GW2载体构建

采用Gateway方法将GUS基因插入到PTTR1-PH7GW2载体中TTR1启动子序列下游。所用具体引物序列如表1中所示。

Gateway方法导入GUS基因的具体步骤如下：

（1）用GUS-F/GUS-R引物进行GUS基因第一轮PCR扩增，具体反应体系如实施例二中扩增TTR1启动子序列，得到GUS基因第一轮PCR产物；

（2）以GUS基因第一轮PCR产物为模板，用GUS基因第二轮PCR引物进行第二轮PCR扩增；

（3）PCR反应结束后，切胶回收GUS基因DNA片段，备用；

（4）进行BP反应，具体反应体系为：1.5 μl GUS基因DNA片段回收产物；0.5 μlpDONR 201；1.0 μl BP clonase Ⅱenzyme Mix；2.0 μl水；25℃反应3～4 h后，加入0.5 μlProteinase K solution，37℃反应10 min；

（5）将反应产物热激转导进入DH5α感受态细胞，再通过卡那抗性平板进行筛选，获得阳性GUS-pDONOR 201质粒后，进行测序分析，以保证GUS基因序列完全正确；

（6）进行LR反应：将上述获得GUS-pDONOR 201质粒与之前获得的PTTR1-PH7GW2载体进行LR反应，将GUS基因导入PTTR1-PH7GW2载体中；25℃反应3～4 h后，加入0.5 μlProteinase K solution，37℃反应10 min；

具体反应体系如下：3 μl GUS-pDONOR201质粒；1 μl PTTR1-PH7GW2质粒；1 μl BPclonase Ⅱenzyme Mix；总体积为5 μl；

（7）将反应产物热激转导进入DH5α感受态细胞，再通过壮观抗性平板进行筛选，获得最终载体质粒PTTR1-GUS-PH7GW2后，再进行测序分析，以保证GUS基因序列完全正确。

（8）提取PTTR1-GUS-PH7GW2，备用，其载体图谱如图1所示。

实施例四：重组载体的验证

1．热激转化将载体PTTR1-GUS-PH7GW2转入GV3101农杆菌

具体操作如下：

（1）将5 μl PTTR1-GUS-PH7GW2质粒（约 500 ng）与GV3101农杆菌感受态细胞在冰上静置30分钟后，转入液氮中冻8分钟，再转入37℃水浴锅中热激5分钟；

（2）热激结束后迅速将装感受态细胞置于冰上3～5分钟后，在28℃摇床中160rmp/min活化2小时；

（3）将转化后的菌液涂布抗性平板中筛选，获得阳性GV3101菌株。

2．农杆菌介导的烟草的转化

农杆菌介导的烟草的转化方法，具体步骤如下：

（1）挑取阳性GV3101菌株接种于含有100 μg/ml壮观霉素霉素、50 μg/ml利福平的YEP培养基中，28℃，250 rpm，振荡培养约48 h，至对数生长后期（OD值0.6左右）；

（2）取20 ml菌液4000 rmp，4℃离心5分钟，倒掉上清，将菌体沉淀用20 ml MS培养液从新悬浮，待用；

（3）取烟草叶片（无菌苗），用打孔器打成大小一致的小圆饼，并置于含1 mg/L的6-BA MS分化培养基中，26℃，光照时间16 h/天，预培养两天；

（4）将预培养后的烟草叶片侵入步骤（2）悬浮后的农杆菌菌液5～10 min，然后用灭菌的滤纸吸干多余菌液，接入含100 μmol/L AS的1/2MS培养基，黑暗或者弱光下，26℃共培养两天；

（5）将共培养后的外植体用灭菌水清洗后转入含0.5 mg/L 6-BA、0.05 mg/L NAA、20 mg/L潮霉素和500 mg/L Carb的筛选培养基上，26℃恒温培养，光照时间16 h/天，每15天更换一次培养基；

（6）待芽长至1 cm左右时，切下，移入生根培养基（含125 mg/L Carb，20 μg/L潮霉素的1/2 MS）中，促其生根；

（7）将获得的阳性转基因苗从生根培养基中移栽到泥炭土中培养；

（8）待幼苗长大些后，将其部分叶片剪下用于GUS染色，以观察TTR1启动子的表达位置。

结果如图2所示，只有PTTR1-GUS-PH7GW2阳性转基因植株叶片的能够被染上颜色，且染色部位只在烟草腺毛上（如图3所示），说明TTR1启动子能够特异性启动GUS基因在烟草腺毛中特异表达，而野生型烟草叶片则没有染色颜色（如图4所示）。

上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南农业大学

<120> 烟草腺毛TTR1启动子、其表达载体及其应用

<130> 2017

<160> 7

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 2889

<212> DNA

<213> Nicotiana benthamiana

<400> 1

atgacaaatg ctcaggtgca cgacatttaa tatttcaatg atctttcatt ccacaacagt 60

agcagtaatc acttttgcct cttgaaggat tattttgaga acctatattg ttcgctcgtt 120

ttccatgatc accacaatga tatttattat accctctctt actatttaca tgccgatgta 180

catttatatg gccatgataa ttattttatt tttttccaga cttatcatgt ctaactacca 240

tattcgcttc aggaagcaga gctgaccctg tgggacggac ttcatgattt tttagcaaaa 300

ggttattata tttctcagca accagaaggc atgagatcaa ttcagaatac tttttaaaac 360

tccttttacg atattgctat tgtaatacca cattttaggc ataaaaagtc gtaagagttt 420

tttccaacaa atcctcatta ttcataacat cgcacataat tttaattggg aaattatttg 480

aaatacaaca gagttctact cacttacggt cataaaatct tgcaaacgta agtgcatcca 540

ctcatatcga gcccctgaca atatcgtaac cttaaggtga ttatacattt cgttcaagtg 600

agtccacaat tcaagtggat ctttcactga caaatattca acctttaaac tttcatccaa 660

atgataacga aggaaaatcg tggccttcac tttgtcctgg cttgatgcct cattaccctg 720

agtaattgtg tcaccaaggc ttttagcggc taagtgaatc tcaacatcga gaaaaacaag 780

ataggtaact ttttccagaa acgtcaggtg ccacaaacta aagctttgac aaatttgact 840

tagtaaaaat tatcaaagaa gataactaat tagaaataat taggataata gcgtaaagaa 900

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agaaaagaat actatttttt ctttagtttg ttagtatatc tttgatgtta actacaacaa 1020

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ttaaaataaa gaaacataaa attctttatt tttacatata tgcagagata tgtgaaatta 1200

taaaactaca tattaagata ctaatcatga aatcaaaata tacaacgaag aaaatagaac 1260

gaacaaatat acctaaaaaa caaaaatagc tcaactttgt ggtgatagcg tattaacaaa 1320

tgtagctcaa agtaacaata taaaacaaga agataagtag aataagaaaa gaaaagataa 1380

ctttctaatt ttatcaagtg ttcaagtgtg ttccatatca tatttcatgc ctctatttat 1440

actattacat agaaggttat aaatagattg tcttaaacgt gatattaaca attgatatca 1500

tggaggaaaa taatggggag ggttgtgaag atgggagagt tgcaattata atagtgatgg 1560

acaatggggt gttatttaca ttatgatgaa aatagtaaaa gtattgaata tccacattta 1620

ttaatagttt tacaacattt atatttaaaa gaaatacttc tgtgaagatt tatttataca 1680

tatatataac caaatcacat tttgattgga attaatagtg agtagttgtt gttataaaga 1740

aaattcaaaa ggaaggaaaa gatgtgttca acacttattc atttcacatt aactaattaa 1800

caagtccatc atgatacgca actctagaat ttattaaata tggatagcta ttgaaaatta 1860

ataagagtga ggttgaattt gttagaaaat ttagttggcg ctttaaaggc ttctatggct 1920

tttcttgtgt ttgtatttgt tctatatgta tatctttatc aagaaacaca cacaaacaca 1980

cagtggcaat ggtatttaca cctttcattg accataatga attacctccc tctaccagcc 2040

cctttaattt ccctcctcta catgcactta ttagttttaa ttacttgcaa atatttactc 2100

caattttcca ttttgagcaa actatcttgg gattttctcc taccattaat acatttccct 2160

gcccctcaat ttactcctct ctcttctttc tacccttcct ctttcaattc attcaattga 2220

tttcctatta actctctctc tctctctctc ttccaactcc tcctcctatt atttaattaa 2280

gcttttaaag caatcccatc tctccactct atagttccca ttatataata tggcttcaca 2340

agtccaagat catcaactag gaccacaaca agttcatctt agtagtttgg ccgtgctgcc 2400

ggtggttccg gttacttcca ttggtgcgcc gccgatctcc gccgtaacct tccggctacc 2460

accgtcccga ccacccttac tccacctttg aattagaaga gctagccttt attcacttcc 2520

tttagggtgc aaaaattcct caatcttaag gtactacagg tttttctcat gatcacccta 2580

aaactaccaa tcatttttta tatcattttt acacactatc ggtgtagttt tacctgtttt 2640

aattaattat ttaccgtagt ttatcggtta ccaatccatg cttggtatat aagaagttaa 2700

cacctaatag tgtaaaatat tctgattagt gtaaaatttc tttgcgctca catattagtt 2760

gaactccttt tttttgtcat gttatttatt gtttatttat tgggtttttt ctttatagac 2820

aggggagatt gattatttat tcaaaagaaa gtttaaagga aatcatattc attacaagta 2880

caattagcc 2889

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tacgagctca tgacaaatgc tcaggtgcac ga 32

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ggactagtgg ctaattgtac ttgtaatgaa tatg 34

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

caaaaaagca ggctatgtta cgtcctgtag aaaccccaa 39

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

caagaaagct gggttcattg tttgcctccc tgctgcggt 39

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggct 29

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggt 29

Claims (6)

1.一种烟草腺毛TTR1启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种用于植物遗传转化的真核表达载体，其特征在于，该载体具有权利要求1所述的烟草腺毛TTR1启动子序列。

3.权利要求1所述烟草腺毛TTR1启动子在启动目的基因表达中的应用。

4.权利要求1所述烟草腺毛TTR1启动子在烟草腺毛组织发育调控机制中的应用。

5.权利要求1所述烟草腺毛TTR1启动子启动GUS基因表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将权利要求1所述烟草腺毛TTR1启动子插入含GUS基因的表达载体，以替换所述表达载体中已有的启动子，得到重组质粒；

（2）将所得重组质粒导入受体植物并进行培育，在所述受体植物中由所述烟草腺毛TTR1启动子启动所述重组质粒中的GUS基因表达。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述受体植物为烟草。

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