CN110387383B - 一种调控NtCBT基因在烟草组织中表达的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，尤其涉及一种调控NtCBT基因在烟草组织中表达的方法及其应用。本发明从栽培烟草K326基因组DNA中克隆获得NtCBT基因启动子，并在栽培烟草中验证NtCBT基因启动子三种类型的片段缺失后驱动GUS基因的表达模式；根据启动子顺式作用元件分析以及片段缺失实验，聚焦启动子中控制腺毛特异表达的核心区域。本发明研究发现启动子‑198bp～‑192bp片段(CAGTTA)的缺失能够使NtCBT基因由腺毛特异表达变为组成性表达，为解析烟草类西柏烷代谢途径的分子调控机制、腺毛特异启动子精准调控关键酶基因的表达提供新策略，为培育高类西柏烷烟草种质奠定研究基础。

Description

一种调控NtCBT基因在烟草组织中表达的方法及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，尤其涉及一种调控NtCBT基因在烟草组织中表达的方法及其应用。

背景技术

烟草是我国主要的经济作物之一，烟叶的香气品质是衡量烟叶价值的重要指标，现有研究认为，烟叶香气与烟草腺毛密度及腺毛分泌物关系密切，其中经类西柏烷代谢途径产生的西柏三烯二醇（Cembratrien-diol，CBT-diol）占分泌物总量60%，在烟叶生长和调制过程中，降解产生茄酮、茄醇、茄尼呋喃、降茄二酮等与人体感官关系密切的衍生物，除此之外，西柏三烯二醇的生物活性则使它们具有抗菌、抗虫，治疗肿瘤、阿尔茨海默病、帕金森病、中风以及其它神经退行性疾病的潜力。烟草中类西柏烷代谢途径大致分为二步：（1）GGPP为CBT-ol的形成提供西柏烷骨架结构，经西柏三烯一醇环化酶作用（由CBTS基因编码），GGPP发生环化反应，形成α-和β-CBT-ol；（2）在西柏三烯二醇羟化酶（由CYP71D16基因编码）作用下，CBT-ol的第6位碳发生羟化反应，形成α-和β-CBT-diol，研究表明，这一系列反应仅发生在烟草腺毛中。

当前，烟草类西柏烷代谢途径中的二个关键酶编码基因CBTS、CYP71D16已研究得较为清楚，除此之外，烟草类西柏烷的相关研究主要集中在它们的分离鉴定、化学结构、检测方法、生物合成等，有关类西柏烷代谢途径的分子调控机制鲜有报道。启动子是转录调控的中心，它位于转录起始位点5'端上游，与基因的转录起始点、转录频率、表达模式等密切相关，研究启动子的功能、结构、作用模式等对回答生物的分子调控机制具有重要意义。由此可见，对烟草类西柏烷代谢途径中关键酶基因的启动子进行分析及功能鉴定，可帮助我们在转录调控水平上认识烟草类西柏烷代谢途径的分子调控机制。

Hanane等（2010）对林烟草NsCBTS-2a基因的启动子缺失实验研究表明，NsCBTS-2a启动子能驱动靶标基因在烟草高分泌型腺毛中特异表达，而将NsCBTS-2a启动子分段缺失后驱动GUS基因，结果表明启动子-589bp ~ -479bp是组成性表达的转录激活区域，而-279bp ~ -119bp则是NsCBTS-2a基因控制腺毛表达的区域。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种调控NtCBT基因在烟草组织中表达的方法及其应用。

本发明是这样实现的，一种调控NtCBT基因在烟草组织中表达的方法，其特征在于：使用6bp-motif缺失后的pNtCBTa启动子驱动NtCBT基因的表达，所述6bp-motif序列见SEQ ID NO:5，位于所述pNtCBTa启动子-198bp ~ -192 bp处；所述pNtCBTa序列见SEQ IDNO:6。

进一步，将如权利要求1中所述6bp-motif缺失后的pNtCBTa启动子片段构建至遗传转化植物表达载体中，构建重组表达载体，将所述重组表达载体转化至遗传转化材料中进行表达。

进一步，所述遗传转化植物表达载体为pCAMBIA1301载体。

进一步，将如权利要求1中所述6bp-motif缺失后的pNtCBTa启动子片段替换pCAMBIA1301载体中的35S启动子，使启动子片段与载体中 GUS 报告基因相连。

进一步，所述烟草组织为异源四倍体栽培烟草组织。

进一步，所述表达表现为使NtCBT基因由腺毛特异表达变为组成性表达。

如权利要求1-6任一所述的一种调控NtCBT基因在烟草组织中表达的方法在调控NtCBT基因在烟草组织中表达的应用。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明根据林烟草NsCBTS-2a启动子序列，从栽培烟草K326基因组DNA中克隆获得NtCBT基因启动子，并进行以下三个方面的研究：（1）克隆NtCBT基因启动子并利用生物信息学分析网站预测该启动子的顺式作用元件类型；（2）在栽培烟草中验证NtCBT基因启动子-479~ -119、-279bp ~ -119bp、-198 bp ~ -192 bp缺失后其驱动GUS基因的表达模式；（3）根据启动子顺式作用元件分析以及（2）中的缺失实验，聚焦启动子中控制腺毛特异表达的核心区域。本发明研究发现-198 bp ~ -192 bp片段的缺失能够使NtCBT基因由腺毛特异表达变为组成性表达，为解析烟草类西柏烷代谢途径的分子调控机制、腺毛特异启动子精准调控关键酶基因的表达提供新策略，为培育高类西柏烷烟草种质奠定研究基础。

附图说明

图1是栽培烟草NtCBT基因启动子PCR扩增；

图2是栽培烟草及林烟草CBT基因启动子序列比对分析；

图3是pNtCBTa全长及缺失片段植物表达载体构建示意图；

图4是转基因植株PCR检测结果；

图5是转基因植株GUS染色分析。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明披露了一种调控NtCBT基因在烟草组织中表达的方法及其应用，具体如下各实施例所示。

实施例1 NtCBT基因启动子克隆

1.本发明所用植物材料为异源四倍体栽培烟草K326（Nicotiana tabacum L.）。取K326叶片提取基因组DNA用于NtCBT基因启动子克隆。

采用CTAB法提取烟草基因组DNA，方法及步骤如下：

1）剪取约100mg烟草叶片置于研钵，加入液氮，迅速研磨成粉

2）加入1 mL经65℃预热的CTAB提取缓冲液，65℃水浴1小时，每10-15分钟摇晃一次，使DNA充分释放出来

3）加入等体积氯仿：异戊醇（24：1）混合液，上下颠倒混匀（约15次），室温下静止3分钟，使水相和有机相分层，10000rpm离心10分钟

4）取上清至2.0ml Eppendorf 管中，加氯仿：异戊醇（24：1）混合液，上下颠倒混匀，10000rpm离心10分钟

5）转移上清至1.5ml Eppendorf 离心管中，加入等体积（-20度预冷）的异丙醇，轻轻颠倒混匀，-20度过夜，使DNA沉淀

6）10000rpm离心10分钟，弃上清

7）70%乙醇漂洗沉淀，上下轻混匀，静置1min左右，10000rpm离心10分钟，弃上清

8）100%乙醇漂洗沉淀，上下轻混匀，静置1min左右，10000rpm离心10分钟

9）弃上清，室温静止晾干

10）加入50-200 μL TE缓冲液或灭菌水，-20度保存。

2. 根据Hanane等2010年发表于Plant Molecular Biology期刊的Trichomespecific expression of the tobacco (Nicotiana sylvestris) cembratrien-olsynthase genes is controlled by both activating and repressingcis-regions的林烟草NsCBTS-2a启动子序列（NCBI登陆号：HM241147.1），设计引物并由上海捷瑞生物工程有限公司合成。采用高保真酶从K326叶片基因组DNA中克隆NtCBT基因启动子，引物序列为：

pNtCBTa-F1：aactatgaaaattttttaacaacta，见SEQ ID NO:1；

pNtCBTa-R1: ctctctctttctctcgccaaacg，见SEQ ID NO:2；

PCR反应体系为：10×PCR Buffer 2μL，dNTP 1μL，rTaq 0.2μL（5U/μL），DNA 2μL，引物各10 μmol/L，20μL反应体系。

PCR反应条件为 94℃ 5 min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 60s，35个循环；72℃ 15min。

3.PCR产物电泳结果如图1所示，结果显示成功在K326中扩增得到NtCBT基因5'端上游序列，长度为990bp，命名为pNtCBTa，序列见SEQ ID NO:6。通过NCBI中的BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）及DNAMAN软件对启动子序列进行比对分析，与已发表的林烟草NsCBT-2a启动子序列相比，序列相似性为：99.29%，共有7个碱基发生改变，启动子的基本元件未发生变化，比较结果见图2，其中一条下划线处表示360bp（-479~-119）缺失；两条下划线处表示160bp（-279~ -119）缺失；三条下划线处表示6bp（-198 ~ -192）缺失。

实施例2 pNtCBTa顺式作用元件分析

利用植物启动子分析网站PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）预测NtCBT基因启动子的顺式作用元件。

结果表明：NtCBT基因启动子5'端上游存多种顺式作用元件，见表1，分别是激素响应有关元件，如：ABRE（ABA响应元件）、CGTCA-motif、TGACG-motif（MeJA响应元件）；G-box、Box 4（光响应元件）；HD-Zip 1（栅栏叶肉细胞分化调控元件）；circadian（昼夜节律控制元件）；CAT-box（分生组织表达调控元件）；MYC转录因子结合元件；MYB转录因子结合元件，以及TATA-box、CAAT-box等真核生物基因启动子典型元件，以及ERE、WUN-motif等功能未知元件，这些作用元件的存在表明NtCBT基因的表达可能受激素、逆境、光信号诱导以及受MYC、MYB等转录因子的调控。

表1 启动子区调控元件分析

编号	顺式作用元件	数量	特征序列	生物学功能
					1	ABRE	1	ACGTG	ABA响应元件
2	Box 4	2	ATTAAT	光响应保守 DNA 的部分元件
					3	CAAT-box	29	CAAT/CAAAT/CCAAT	启动子、增强子区域常见顺式作用元件
4	CAT-box	1	GCCACT	分生组织表达相关顺式调控元件
					5	CGTCA-motif	1	CGTCA	MeJA响应元件
6	G-box	1	CACGTC	光响应元件
					7	HD-Zip 1	1	CAAT(A/T)ATTG	栅栏组织细胞分化调控元件
8	MYC	2	CATGTG/CATTTG	MYC转录因子结合位点
					9	MYB	2	TAACTG/CAGTTA	MYB转录因子结合位点
10	TATA-box	36	ATATAA/ATATAT/ATTATA/TACAAAA/TATA/TATAA/TATAAA/TATAAAA/TATATA	转录起始-30处启动子核心元件
					11	TGACG-motif	1	TGACG	MeJA响应元件
12	circadian	1	CAAAGATATC	昼夜节律调控有关的顺式调控元件

实施例3 载体构建及缺失片段分析

本实施例中用于烟草遗传转化的农杆菌菌株为GV3101（公知公用），遗传转化植物表达载体为pCAMBIA1301（公知公用），构建时将长度为990bp的pNtCBTa启动子以及360bp（-479~ -119）、160bp（-279~ -119）、6bp（-198 ~ -192）缺失后的片段分别替换pCAMBIA1301中的 35S启动子，使每个片段分别与载体中 GUS 报告基因相连，如图3所示。载体构建由武汉伯远生物科技有限公司完成。

将长度为990bp的pNtCBTa启动子以及缺失360bp（-479~ -119）、160bp（-279~ -119）、6bp（-198 ~ -192）的片段分别替换pCAMBIA1301中的 35S启动子，各构建好的载体分别命名为：pCBT、pCBT_△360、pCBT_△160、pCBT_△6。经PlantCARE分析，其中pCBT含有实施例2中的顺式作用元件；pCBT_△360缺失片段含有CAAT-box、ABRE、Box 4、CGTCA-motif、G-box、HD-Zip1、MYC、MYB、TGACG-motif、TATA-box 等元件；pCBT_△160缺失片段含有CAAT-box 、MYB、TATA-box元件；pCBT_△6缺失片段含有MYB元件。

实施例4转基因植株PCR检测

取K326种子于75%酒精表面消毒30S，10% H₂O₂浸泡10min，最后用无菌水冲洗5次，置于MS培养基中培养无菌苗作为遗传转化材料。

利用叶盘转化法，以烟草 K326 叶片作为转化受体进行遗传转化，转化方法参照赵丹等（2014）方法进行（赵丹，秦利军，孙洪荣等.烟草CYP82E4v1基因调控降烟碱的生物合成[J]. 烟草科技，2014(8):68-74）。培育得到T0代抗性植株。

提取T0代抗性植株基因组 DNA进行 PCR 扩增，用于检测转基因阳性植株，DNA提取方法参照实施例1，引物序列为：

pNtCBTa-F2:5'-gtggctatgtcattctatcataac-3'，见SEQ ID NO:3；

pNtCBTa-R2:5'- ataaaaagagaaaagggtcctaacc-3'，见SEQ ID NO:4；

PCR反应体系为：10×PCR Buffer 2μL，dNTP 1μL，rTaq 0.2μL（5U/μL），DNA 2μL，引物各10 μmol/L，20μL反应体系。

PCR反应条件为 94℃ 5 min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 60s，35个循环；72℃ 15min。

遗传转化的抗性苗经炼苗、移栽，挑选生长良好的植株，提取叶片基因组DNA后对其进行PCR检测，检测结果如图4所示，其中M: DL5000 Marker；1-2:pCBT(969bp)；3-4:pCBT_△360(609bp)；5-6:pCBT_△160(809bp)；7-8:pCBT_△6(963bp)；9:CK。pCBT、pCBT_△360、pCBT_△160、pCBT_△6四个载体遗传转化植株均扩增出大小为969bp、609bp、809bp、963bp的目标特异条带，而非转基因植株未扩增出任何片段，表明获得了长度为990bp的pNtCBTa全长及缺失启动子驱动GUS基因表达的转基因植株。

实施例5转基因植株GUS组织化学染色

为分析pNtCBTa全长及腺毛特异表达相关区域在栽培烟草中的表达特性，本发明将该启动子全长及3个片段缺失后与GUS基因融合，构建植物表达载体遗传转化K326，选取经实施例4中PCR检测呈阳性的植株进行GUS组织化学染色。染色方法参考 Jefferson 等于1987发表的《GUS fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile genefusion marker in higher plants》一文中的方法，取烟草组织浸泡于GUS染液中，37℃避光染色24h，吸出GUS染液，依次用 50%、75%和 100%酒精脱色，样品脱色后置于显微镜下观察、拍摄转基因烟草中GUS表达水平，从而确定NtCBT基因启动子在栽培烟草中的驱动特性。

结果如图5，其中A:对照植株叶片；B: pCBT植株叶片；C: pCBT_△360植株叶片；D:pCBT_△160植株叶片；E-I: 分别为pCBT_△6植株根、叶、茎、腺毛、叶脉。pCBT植株叶片腺毛中并未观察到蓝色信号，见图5B。鉴于此，发明人提取腺毛及去腺毛叶片的RNA反转录成cDNA，经real-time PCR实验证实，腺毛中的GUS基因在mRNA水平上的相对表达量为去腺毛叶片的数百倍。这表明GUS基因在mRNA转录水平上为腺毛特异表达，推测异源四倍体栽培烟草较其祖先种二倍体林烟草而言，有着更为复杂的表达调控模式。

而将启动子分别缺失360bp以及160bp后驱动GUS基因，pCBT_△360及pCBT_△160GUS染色结果显示，在植株非腺毛组织中观察到明显的蓝色信号，见图5的C-D。为进一步聚焦pNtCBTa启动子中控制腺毛表达的区域，结合pNtCBTa顺式作用元件的分析结果，选取6bp-motif（-198 ~ -192，CAGTTA，见SEQ ID NO:5）缺失后的pNtCBTa驱动GUS基因，pCBT_△6植株GUS染色结果如图5的E-I，植株根、茎、叶、叶脉及表皮毛组织中均观察到明显的蓝色信号。实验结果表明，位于pNtCBTa启动子中的-198 ~ -192是控制NtCBT基因在烟草腺毛中特异表达的关键区域之一，推测该片段的缺失可使NtCBT基因由腺毛特异表达变为组成性表达。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 贵州省烟草科学研究院

<120> 一种调控NtCBT基因在烟草组织中表达的方法及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(pNtCBTa-F1)

<400> 1

aactatgaaa attttttaac aacta 25

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(pNtCBTa-R1)

<400> 2

ctctctcttt ctctcgccaa acg 23

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(pNtCBTa-F2)

<400> 3

gtggctatgt cattctatca taac 24

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(pNtCBTa-R2)

<400> 4

ataaaaagag aaaagggtcc taacc 25

<210> 5

<211> 6

<212> DNA

<213> 6bp-motif(6bp-motif)

<400> 5

cagtta 6

<210> 6

<211> 990

<212> DNA

<213> pNtCBTa

<400> 6

aactatgaaa attttttaac aactaattta ttatggtaaa taatattgat atggtaactt 60

caagcacatg acaaaaatta taactaactg cagaagttta ctgtctctct gaatcttgtg 120

gctatgtcat tctatcataa caaatacttg tagctaatac gccaacgatg ttctcgattt 180

catataattt gaattttaaa atagctttta aatttaatat ttatttcaaa tcattattgt 240

gactaacatg ttataaccgc agtaatattt ggagatgcaa tacttatatt tagctacaaa 300

attttattgt atcataataa gtttgtagct attaagttag tttttgccac aaatttttat 360

aattgaagca aaaataccta ttcaactaca atattttgta tcgagtaata ttttgtgact 420

agaagattaa tattattaca gtaatttctg acgtgtggca aaaactcata attatctaca 480

aaatattgtc gtagcaataa ttttttatat ctattaatcc aattattgct acatgctttt 540

ataacttgag gcaaaaatat ctatttagct ataacatttt gttagaagta atttttgtga 600

ctataaagtt gttattgcta cagtaatttc aaatgcgtgg caaaaaaaat acgattagct 660

acgaaatttt attgtagcaa taaatttgta gctatttggg taatattgct acgacagtta 720

gcaattatag caaaaatgct aaatcagctt tgtcgattta attttgtagc taattttttt 780

atgaatttgt aaatagctat gaaattttaa tttttgtggc tattgttagg tattagccac 840

atatagctaa gaatttgtag ctatatatac ataatgttgt agtggcaaat tctaacattg 900

taagcttggc tgcctttttt tttttttttt gggctacaaa actctaaagt aaaggaacta 960

gaaaactcgt ttggcgagag aaagagagag 990

Claims (5)

1.一种调控烟草NtCBT基因在烟草组织中由腺毛特异表达变为组成性表达的方法，其特征在于：使用6bp-motif缺失后的pNtCBTa启动子驱动NtCBT基因的表达，所述6bp-motif序列见SEQ ID NO:5，位于所述pNtCBTa启动子715bp ~ 720bp位处；所述pNtCBTa序列见SEQID NO:6；所述烟草组织为异源四倍体栽培烟草K326。

2.根据权利要求1所述的一种调控NtCBT基因在烟草组织中由腺毛特异表达变为组成性表达的方法，其特征在于：将如权利要求1中所述6bp-motif缺失后的pNtCBTa启动子片段构建至遗传转化植物表达载体中，构建重组表达载体，将所述重组表达载体转化至遗传转化材料中进行表达，所述遗传转化材料为烟草K326无菌苗。

3.根据权利要求2所述的一种调控NtCBT基因在烟草组织中由腺毛特异表达变为组成性表达的方法，其特征在于：所述遗传转化植物表达载体为pCAMBIA1301载体。

4.根据权利要求3所述的一种调控NtCBT基因在烟草组织中由腺毛特异表达变为组成性表达的方法，其特征在于：将如权利要求1中所述6bp-motif缺失后的pNtCBTa启动子片段替换pCAMBIA1301载体中的35S启动子，使启动子片段与载体中 GUS 报告基因相连。

5.如权利要求1-4任一所述的方法在调控NtCBT基因在烟草组织K326中由腺毛特异表达变为组成性表达的应用。

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