CN103789312A - 玉米胚乳组织特异性启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一个玉米胚乳组织特异性启动子及其应用。其目的是提供一个玉米胚乳组织特异性启动子及其在调控筛选基因在植物中表达中的应用。该启动子是下述核苷酸序列之一：1）序列表中SEQIDNO:1的DNA序列；2）在高严谨条件下可与序列表中SEQIDNO:1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。该启动子能指导外源基因在植物发育过程中特定时空的表达，用该方法筛选转基因水稻具有阶段性强、灵敏度高的优点，而且由于筛选基因只会在胚乳阶段表达，在其他时期不会表达，他不仅能使目的基因的表达产物在一定空间积累，增加区域表达量，而且也避免了植物营养的不必要的浪费，提高产量，具有较大的实际应用价值。

Description

玉米胚乳组织特异性启动子及其应用

技术领域

本发明涉及植物学和基因工程技术领域，具体的说，涉及玉米胚乳组织特异性启动子的克隆、功能验证及其应用，尤其是在启动植物组织表达目的基因中的用途。 

背景技术

当今农业科学已能利用基因工程技术累改良甚至创造新的作物新品种。基因工程使人类从单纯地认识生物和利用生物的传统模式跳跃到改造生物和创造生物的新时代，所以可以调控基因在不同时空中进行表达的最主要的元件—启动子起到了很大的作用。启动子是RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列，是基因的一个组成部分，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度，启动子就像“开关”，决定基因的活动。

根据启动子的基因表达方式的不同可分为组成型、诱导型和组织特异性启动子三大类。在组成型启动子调控下，不同组织器官和发育阶段的基因表达没有明显差异，由于组成型启动子驱动的基因在植物各组织中均有不同程度表达，应用中会出现一些问题，比如会引起基因沉默，这种表达往往会导致细胞内代谢产物的积累，增加细胞负担和造成能量浪费。而组织特异性启动子最大的优点是它所启动的外源基因在受体中仅在需要的部位特异表达，从而克服了组成型启动子启动的外源基因在受体植物中非特异、持续、高效表达所造成的浪费，增加转基因的效果，因此人们对组织特异性启动子的研究和应用越来越重视。

发明内容

本发明的目的是提供一种在玉米胚乳组织中特异性表达的启动子及其表达载体，以及启动子和表达载体的用途。

本发明所提供的玉米胚乳组织特异性启动子，即DULL1基因启动子，该启动子被命名为PDU1，来源于玉米属玉米（Zea mays L.）。该启动子大小为1921bp,是下述核苷酸序列之一：

1）序列表中SEQ ID NO: 1的DNA序列；

2）在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO: 1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

本发明所涉及的设计方案为，一种玉米胚乳组织特异性启动子，通过生物信息学的方法初步确认，在玉米B73自交系中扩增该启动子，通过在水稻中验证在胚乳中是特异性表达的启动子。 

本发明提供了一种胚乳特异性表达的载体，其特征是转入了前述的玉米胚乳特异性表达的启动子，并在水稻中进行验证。利用前述的玉米胚乳特异性启动子取代植物表达载体pCAMBIA1301上的CaMV35S启动子，构建了一个新的植物表达载体，命名为PDU1-1301 (如图1所示)。

通过农杆菌介导法转入水稻，成功获得转基因植株。经过PCR和潮霉素的验证结果表明玉米胚乳特异性启动子已经整合到水稻基因组中；GUS组织的化学染色鉴定正式DULL1基因的启动子为胚乳特异性表达启动子，PDU1-1301为一种胚乳特异性表达的载体。

因此，在一实施方案中，本发明提供了一种玉米胚乳组织特异性启动子，其特征在于其核苷酸序列。本发明还提供了所述启动子用于在植物营养器官中特异性表达目的基因的用途。

在另一实施方案中，本发明提供了包含所述玉米胚乳组织特异性启动子的植物表达载体，载体是用所述玉米胚乳特异性启动子取代植物双元表达载体pCAMBIA1301上的CaMV35S启动子，从而构建得到的植物表达载体。该新型的植物表达载体调控目的基因在植物胚乳组织中特异性表达。在其他实施方案中，本发明还提供了所述启动子用于构建在植物营养器官中特异性表达目的基因的植物表达载体的用途。

本发明提供的一个胚乳特异性启动子PDU1在水稻的营养器官中特异表达，该启动子可以控制筛选标记基因在正常水稻营养器官中特异表达，能指导外源基因在植物发育过程中特定时空的表达，用该方法筛选转基因水稻具有阶段性强、灵敏度高的优点。而且由于该启动子只能驱动下游基因在水稻的各种营养器官中表达，生殖器官中不表达的特点，可以将其连接有益的目的基因，转入植物中，提高植物的各种生理功能，比如抗虫害、抗病害，提高营养物质吸收能力，增强抗逆境胁迫能力等，且在种子中不表达，不影响种子品质与性状。该启动子将会在玉米或其他种子类作物育种中有很好的应用价值。 

附图说明

图1 是构建的新型载体过程，将PDU1插入到农杆菌双元载体pCAMBIA 1301 ,构建成PDU1-1301载体。

图2 是转基因植株和未转化水稻中花11各组织的GUS染色结果，表达GUS的细胞经染色呈蓝色，A-G分别是转化PDU1-1301载体水稻的根、茎、叶、叶鞘、颖壳、花、胚乳的GUS染色结果。A1-G1分别是未转化水稻中花11的根、茎、叶、叶鞘、颖壳、花、胚乳的GUS染色结果。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明

实施列1  目的基因的克隆与转化

1.材料

植物材料粳稻中花11号由安徽农业大学生物物理学省重点实验室保存；所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成，测序是由Invitrogen 公司进行；PCR试剂盒、连接试剂盒和载体构建过程中的核酸内切酶均TaKaRa生物技术有限公司，质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒均购于全式金生物技术有限公司，具体操作方法均参照试剂盒说明书进行；DH5ɑ大肠杆菌感受态购于全式金生物技术有限公司；EHA105根瘤农杆菌感受态的制备属自己完成；pMD18-T Vector 和双元表达载体pCAMBIA1301购于TaKaRa生物技术有限公司；GUS化学检测所用试剂：Triton X-100、x-Gluc、DMF(N,N-二甲基酰胺)、EDTANa2均购于上海生物工程有限公司。

 LB液体培养基配方为：蛋白胨10 g，酵母提取液5 g，NaCl 10 g，pH 7.0 ，对应的固体培养基添加1.5%的琼脂；YEP液体培养基配方：牛肉膏 10 g，酵母提取液10 g，NaCl 5g，pH 7.0 ，对应的固体培养基添加1.5%的琼脂；愈伤诱导培养基、液体共培培养基、固体共培培养基、选择培养基、分化培养基、生根培养基均为水稻遗传转化常用培养基；

2.方法和结果

2.1 玉米DULL1基因及其启动子的获得

首先在NCBI网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中以关键词“DULL1”搜索基因，获得玉米DULL1基因表达的mRNA序列（GenBank: AF023159.1），并在玉米基因库中根据其基因名GRMZM2G141399搜到其基因序列和蛋白序列，再找到上游启动子序列（前2000bp），将这段基因序列命名为DULL1，命其启动子序列为PDU1。

玉米DULL1基因启动子的克隆

根据2000bp大小的玉米基因DULL1的启动子序列PDU1设计扩增该片段的引物，上游加Sac I (CGAGCTC)酶切位点，下游加Nco I (CATGCCATGG)酶切位点，使用Primer Premier 5.0软件设计引物如下：PDU1-S(SEQ ID NO: 2)序列为CGAGCTCTCACAAGTAGGAGGAGCG; PDU1-A(SEQ ID NO: 3)序列为CATGCCATGGAAGGGGAAGAAAAGAAGG。目的片段为1921bp。

提取玉米（Zea mays L.）B73基因组DNA，并以此为模板，在SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3的引导下进行PCR扩增，PCR反应体系为：

10×PCR buffer	5 μL
		dNTP(10mM)	4 μL
PDU1-A	2 μL
		PDU1-S	2 μL
玉米B73基因组DNA	1 μL
		Taq酶	0.5 μL
ddH2O	至50 μL

PCR反应条件：预变性：94℃,5分钟；变性：94℃，30秒；退火：58℃，30秒；延伸：72℃，一分30秒，变性至延伸总共循环30次；延伸完全：72℃，10分钟。

反应结束后，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化1921bp的目的片段，即启动子PDU1，将其克隆到载体pMD18-T Vector，得到重组质粒载体pMD18-PDU1，再将该重组质粒载体转化到大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中，涂在含有Amp的LB固体培养基上，37℃过夜培养，挑斑，37℃摇菌，拿菌液测序，测序结果表明启动子PDU1和NCBI上公布的完全一致。

基因启动子表达载体的构建

   将已连接到pMD18-T Vector上的PDU1片段与农杆菌双元载体pCAMBIA1301上的CaMV35S启动子用同种酶Sac I和Nco I 进行双酶切，于37℃水浴锅中，3h。再将上述2片段用T₄DNA连接酶连接，25℃连接2~12 h。构建表达载体PDU1-1301。

其中双酶切反应体系如下：

DNA	25 μL
		BSA	1.5μL
0.5×buffer K	1.5μL
		Sac I	1 μL
Nco I	1 μL

连接体系如下：

片段DNA	6μL
		载体DNA	2 μL
10×ligase buffer	1 μL
		T4DNA ligase	1 μL

   取3~5 μL的构建好的载体质粒轻轻打入到200 μL EHA105农杆菌感受态细胞中，冰浴5 min，液氮速冻1 min，37℃水浴5 min后，加入200μL YEP液体培养基，28℃，220 rpm预表达4~5 h；10000 rpm离心30s，弃上清，加入100 μL YEP液体培养基，重新悬浮细胞，涂布于含100 μg/mL Kan和50 μg/mL Rif的YEP固体平板上，28℃培养约24~48 h；挑取平板上长出的微黄色的单菌落，接种于含100 μg/mL Kan和50 μg/mL Rif的YEP液体培养液中，摇菌24~48 h；待菌液浑浊（橙黄色），提取质粒，用PCR验证。

农杆菌介导水稻遗传转化

    通过根癌农杆菌介导法将含构建好的表达载体PDU1-1301的农杆菌导入植物受体材料水稻中花11号中。

2.4.1水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养

    实验前，对实验所用的成熟种子在强太阳光下晒3~4 h后对其去壳处理。先用灭菌水洗4-5次，水至清，再用75%乙醇浸泡5 min，然后用灭菌水、次氯酸和吐温配制的杀菌水（具体比例 ：灭菌水 ：次氯酸=1 ：1，总体积：吐温=1 mL:1 μL）浸泡15 min，期间不停的摇晃，从而进行表面灭菌，之后用无菌水冲洗，直至水变澄清，再将成熟种子放在灭菌滤纸上吸干水分后，取其于愈伤诱导培养基上，28±1℃培养

2.4.2用于转化水稻的农杆菌菌液的准备

    将表达载体的农杆菌接种于YEP液体培养基（含有100 μg/mL卡那霉素和50 μg/mL 利福平）中，28℃振荡培养至OD600=0.6~1.0；室温下5000 rpm离心5 min收集菌体，随后将其悬浮于液体共培培养基中，调整菌体浓度至OD600=0.4，即为共培养转化水稻用的农杆菌悬浮液。

2.4.3农杆菌侵染水稻愈伤组织

    挑选色泽鲜嫩、呈乳黄的愈伤组织，集中放入100 mL无菌三角瓶中，加入上述制备好的农杆菌悬浮液（悬浮液以淹没愈伤为好）；28℃，220 rpm摇床上培养20~30 min；之后倒掉菌液，将侵染后的愈伤组织置于含无菌滤纸的培养皿上吸去多余菌液，随即转移到铺有1-2层无菌滤纸的固体共培养基上，22℃暗培养2~3 d。

2.4.4愈伤组织的选择培养

    将共培的愈伤组织，先用灭菌水清洗直至水变澄清，弃去清洗液，转入含有羧苄青霉素（100 mg/mL）的溶液中振荡清洗30 min以上，用无菌滤纸吸干，置于含无菌滤纸的培养皿中干燥处理；再将愈伤挑选到含有羧苄青霉素（500 mg/mL）和潮霉素（50 mg/L）筛选培养基上，28℃光照培养30 d左右，直至长出新的抗性愈伤。

2.4.5抗性愈伤组织的分化

    从筛选培养基上挑选长势较好呈乳黄色的潮霉素抗性愈伤于含有50 mg/L潮霉素的分化培养基上，先28℃暗培养3 d，然后转移到30℃条件下进行全光照条件下培养，一般15~30 d后，有绿点出现；30~40 d后会分化出幼苗。

2.4.6生根、壮苗和移栽

    待分化出的幼苗h≥3 cm时，可转移至生根培养基上，培养15~20 d；选择h≥15 cm、根系发达的幼苗，加灭菌水室温下炼苗2~3 d后，用温水洗去培养基，移入含水稻培养土的水桶中栽培，待苗生长健壮后移入水田中生长。

实施例2  转基因水稻的鉴定

一、转基因水稻的PCR检测

以提取的转基因水稻总DNA为模板，用上述PDU1-S(如SEQ ID NO: 2所示)、PDU1-A（如SEQ ID NO: 3）为上下游引物。扩增目的片段，初步鉴定转基因植株。PCR反应体系和反应条件如之前克隆目的片段的体系和条件一样。

二、转基因水稻的潮霉素检测

    以提取的转基因水稻总DNA为模板，用表达载体上所含的潮霉素基因为检测对象，设计引物，扩增片段，用于检测潮霉素抗性基因的上游引物如SEQ ID NO: 4所示（5’-TAGGAGGGCGTGGATATGGC-3’），下游引物如SEQ ID NO: 5所示（5’-TACACAGCCATCGGTCCAGA-3’）。

PCR反应体系参照PDU1的克隆，反应条件如下：PCR反应条件为：预变性：94℃ 6 min；变性：94℃ 45 s；退火：55℃ 45 s；延伸：72℃ 2 min，34个循环；总延伸：72℃ 10 min。

三、水稻各组织的GUS染色

分子检测结果且初步鉴定为转基因株后，分别对植株进行GUS组织化学染色。具体操作步骤如下：取转基因水稻不同的组织：愈伤、叶、茎、叶芽鞘、根、花、颖壳和种子，将各部位移入试管中，加入适量的GUS缓冲液浸没组织块，再加上GUS染色液，混匀后37℃下保存4-12小时，结束后，将染色组织先置于75%乙醇漂洗脱色2-3次，直到材料呈白色；肉眼或显微镜下观察，组织上有蓝色小点即为GUS表达部位。染色结果如图所示，GUS基因只在水稻的胚乳组织中表达，从而证明了DULL1启动子PDU1仅在水稻胚乳组织中特异性表达。

Claims (11)

1.玉米胚乳组织特异性启动子，是下述核苷酸序列之一：

1）序列表中SEQ ID NO: 1的DNA序列；

2）在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO: 1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的玉米胚乳组织特异性启动子，其特征在于：所述启动子具有序列表中SEQ ID NO: 1的DNA序列。

3.权利要求1或者2所述的启动子在水稻胚乳组织中特异性表达目的基因的用途。

4.包含如权利要求1或者2所述的玉米胚乳组织特异性启动子的表达载体。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于所述载体是用所述玉米胚乳组织特异性启动子取代植物双元表达载体pCAMBIA1301上的CaMV35S启动子，从而构建得到的植物表达载体。

6.权利要求5所述的表达载体用于在水稻胚乳组织中特异性表达目的基因的用途。

7.含有权利要求5所述的表达载体的根癌农杆菌，其特征为用如权利要求5所述的表达载体转染根癌农杆菌所得。

8.含有权利要求5所述的表达载体的水稻愈伤组织，其特征为用如权利要求7所述的根癌农杆菌侵染水稻愈伤组织所得。

9.一种培育在胚乳组织中特异性表达目的基因的水稻的方法，其特征为包括以下步骤：

   （1）用如权利要求5所述的表达载体转染根癌农杆菌；

   （2）用上述根癌农杆菌侵染水稻愈伤组织，然后利用载体上带的筛选基因筛选出已成功转入如权利要求5所述的表达载体的愈伤组织；

（3）对筛选出的愈伤组织进行分化，获得幼苗；将幼苗进行生根，然后壮苗，最后移入水田。

10.根据权利要求9所述的一种培育在胚乳组织中特异性表达目的基因的水稻的方法，其特征在于：所述筛选基因为在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因中的一种或者多种。

11.根据权利要求10所述的一种培育在胚乳组织中特异性表达目的基因的水稻的方法，其特征在于：所述筛选基因为GUS基因和潮霉素基因。

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