CN104087587A - 一种植物干旱胁迫诱导表达启动子及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种水稻干旱胁迫诱导表达启动子POsDro5及其应用。本发明还提供了含有该启动子的植物表达载体和转化子。具体而言，本发明将上述启动子应用在植物基因工程中。本发明提供的启动子可以在干旱胁迫的情况下特异性的启动外源基因在植物中表达，因此在植物基因工程中可以用于替代组成型启动子，既保证所驱动的功能抗旱基因在干旱胁迫时发挥功能，又避免水分充足时不必要表达造成的能量浪费，从而培育出理想的作物耐干旱品种。

Description

一种植物干旱胁迫诱导表达启动子及应用

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种植物干旱诱导基因表达启动子及利用该启动子所进行的作物抗旱基因工程改良。

背景技术

水稻是最主要的粮食作物之一，世界上三分之一以上的人口都以稻米为主食。随着经济的发展，全球范围内对稻米产量和品质提出了越来越高的要求。因而利用各种方法来提高水稻单产、改良稻米品质，有着积极重要的意义。

干旱、高盐、低温等非生物胁迫是自然界常见的不利环境因子，它们严重地制约了植物生长发育。对中国这样一个淡水资源短缺的国家，干旱对农业生产、甚至对社会生产造成了极其严重的影响。通过分子生物学以及基因工程的手段去研究和改良作物在农业生产中具有很好的应用前景。而外源基因在细胞中表达是基因工程研究的关键，并且外源基因的表达首先取决于其转录的启动。诱导特异性启动子不仅能使目的基因的表达产物在一定器官或组织部位积累，增加区域表达量，同时也可以避免植物营养的不必要浪费。作为基因工程中最富有前景的调控元件，诱导特异性启动子已成为近年研究的热点之一。

提高植物抗旱性一直以来都是一个长期而艰巨的任务，并且通过转基因途径改良植物抗逆性近年来正逐步得到可行性论证和普遍接受。已经有部分文献报道在基因工程中，利用干旱诱导型启动子驱动抗旱基因可以在提高作物抗旱性的同时，避免因抗旱基因超量表达造成的能量浪费和产量损失。因此，干旱诱导启动子对于培育实用化的抗旱作物品种有着重要的意义。水稻rab16A的启动子活性受ABA诱导。拟南芥rd29A和RAB18的启动子也属于非生物逆境诱导型启动子。大麦中的blt101.1基因的启动子受低温诱导。尽管已经有文献报道从植物中分离出受逆境应答的启动子，但是在重要粮食作物的干旱诱导型启动子数量仍明显不足，难以大规模开展植物基因工程的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种驱动外源基因在干旱诱导条件下表达的启动子、获得含有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。其中，本文中所涉及的“植物”是指单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种植物干旱诱导表达启动子，所述植物干旱诱导表达启动子包含序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列。序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列为来源于日本晴水稻(Oryzasativa L cv.Nipponbare)的水稻干旱诱导表达启动子，本文中称为POsDro5或启动子POsDro5。也就是说，本发明发现并鉴定了一个受干旱诱导的水稻转录因子基因的启动子，通过启动子活性定量分析表明，可以将该启动子用于抗旱性相关基因在水稻等作物中表达，从而有效地提高植株的抗旱性能。

优选地，本发明提供的植物干旱诱导表达启动子的DNA序列为SEQ IDNo:1所示的序列，即POsDro5或启动子POsDro5。

另一方面，本发明提供一种植物干旱诱导表达启动子，其DNA序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列有至少80％同源性；或者，所述植物干旱诱导表达启动子为在SEQ ID No:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突变体或等位基因或衍生物；或者所述植物干旱诱导表达启动子具有与SEQ ID No:1所示的DNA序列杂交的产物。这些植物干旱诱导表达启动子序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列具有相同功能，即驱动目标基因在植物中表达。

又一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述的植物干旱诱导表达启动子，在所述重组表达载体中，所述植物干旱诱导表达启动子连接于待表达的基因序列的上游；优选地，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-POsDro5，该重组表达载体为将SEQ ID No:1所示的序列即POsDro5或启动子POsDro5构建于pCAMBIA1391中得到的重组表达载体，本文中称为pCAMBIA1391-POsDro5。优选地，所述目标基因是耐旱基因。

另一方面，本发明提供一种转化子，所述转化子包含本发明提供的上述植物干旱诱导表达启动子、上述表达盒、上述重组表达载体、或上述宿主菌。其中，所述转化子优选为转基因细胞系、愈伤组织或植株。

再一方面，本发明提供上述植物干旱诱导表达启动子在培育转基因植物中的应用。所述应用包括将本发明提供的上述植物干旱诱导表达启动子连接于载体的待表达的基因序列上游(例如，将所述启动子序列置于目标基因之前)，从而构建重组表达载体，将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。

并且优选地，所述应用可以用于改良植物生长特性，所述植物为单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。

本发明中所提供的启动子的DNA序列为(与序列表中SEQ ID No：1中相同)：

CTCCGTCACCACCCGTTCCTCCCCCGTTTGCCACGTCAGCTTGCCGCCCCAGAGGTGGGCGGCAGGGGCTATTTCTGCAATTTTTTTGGTCGATAGATTATTTCTGTAAATATTTAAAAAAAATCTAAATCCGAAAAAAATTCTGCTACTGCGTCAGAACACGGCATTTGCTGGGCACAGCTAATCAGCGCGTACGCGTTGCTGGCGCAGACACCGCCAAGGCCCACCCACGGGCTAGCCCAGGTACGATGCCGCAAGGCCCACCCACGGGCTAGCCCAGGTACGATGCCGCAAGGCCCACGCACACGCAGACGCACTAAGCCCCGATAGTTTTTTCCTTTTTTCGCCTTTTTTCGGTTTTCGCTTTTTTTTCTTGAATCGCTTCCTTATTTTCTTCACGTGGTGGCGCGATTTTTTTTTCTGCTATATTTTATAAATTGAATTTTTCACCTTCAATTTCAGTTGAAAGTTTTTAAAATTTAAGTTGAATGCTTTGAAATTTGAGATGAAAGTTTTCAAATCTTGATTTGATTTTTTTTAAATTTGAGTTGAAAGTTTCAAATTTTCAACTGAAAATTTTCAAATCCGAGTTGAAAGTTTTTAAGTCTGAGTTGAAAGTTCGTTTTCAAATCTTGATTTGAAAGTTTTTCAAATCTAAGTTGAAAAATTAAAAAAATCTTGAGTTGAAAGTTTTTAAGTCTGAGTTGAAAGTTTCCAAATCTTGACTTGAAAGTTTTCAAGTTCGAGTTAAAAATTTTCAAATCTAAGTTGAAAAATTAAAAAAATCTTAAGTTGAAAGTTTTTAAGTCCGAGTTGAAAGTTTTCAAATCTTGACTTGAAAGTTTTCAAGTTCGAGTTAAAAGTTTTCAAATCTTGATTTGAAAGTTTTTCAAATCTAATTTGAAAAATTAAAAAAATTTCTTGAGGTGAAAGTTTTTAAGTCTGAGTTGAAAGTTTTCAAATCTTGACTTGAAAGTTTTCAAGCCCGAGTTAAAAGTTTTCAAATCTTGATTTGAAAGTTTACAAATCTAAGTTGAAAAATTTTAAAAATTCTTGAGTTGAAAGTTTTAAATCTTTATGCGTGCGGTAGTCAAATGCGAAAAAAAAAAGTGACAGCGTCGTGTAGTCCACGGCAAAAAAAAAAAATAAAAAAAGAAACGTCACAGCGCCAAAAAATGAAAAAAAAAAGAAAAAGAAACGTCGCGCTGCGTGTACCTCCGCGGGACATCACGTGGGCCTCGTGGGCCTGCCCTGCAGCAGCGCGCGACTTCGCTACCTCGCGCGTACGCGCCAACTAGTGTTTCTGGCATTTGCTACCGGTGTATAGGTTAGGTATAGATTCTCATTGTTGATTTTTTACTCTCCTAAGGGAAAAGTGAAAAGTGGTCAGTGGTAAAATGCATCACGCCGATCGACATTCACGGTACCGAGACGTGCCAGAAATGATATGCCTATGCAAGAGAGCATCGATCTCTTCTTCTTTTTTATGTATCTCATTAACAAGCTAGAGAATCGAATTAGAATCCAATGTTGTTGTCACGAATGCATCGATCGATAGACGGCCGGGAGGCTCCTGGAAGAATATTGCAATGGCGGCAGTGCAATGCAGGGCAGGTGTGCAGATTCGATCGGCCGACGTGGCCTCGCCGGAGACGGTTGATGCGAGACACGTCGAAGGCCGCCGGAGAGGCGAAAGACGCGGCCGCGCGGGTATAAATTGCGACGTCGCCACAGCTCGTAATGTACAGCACCGATCACACCGATACAT

需要说明的是：上述启动子的DNA序列中，序列开头以斜体并加粗表示的序列“CTCCGTCACCACCCGTTCCTCC”为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列，共计22bp；序列末尾以斜体并加粗表示的序列“AGCACCGATCACACCGATACAT”为获得启动子过程中使用的反向引物的留存序列(该留存序列与反向引物的相应序列互补)，共计22bp；该DNA序列中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。即便后续本领域技术人员基于本发明的描述通过其他引物，也提取出了上述启动子的核心部分，其也落入本发明的保护范围。

综上所述，本发明的发明人从日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)中分离克隆得到LOC_Os01g06310.1基因前包括转录起始位点在内的1768bp的DNA序列，并将其命名为POsDro5(序列表中的SEQ IDNo:1)。将该序列经酶切后连接到植物双元表达载体pCAMBIA1391上，获得相应的重组质粒(即重组表达载体)，利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行组织化学检测发现，转基因植株在干旱诱导处理后，整体上的Gus基因表达水平相对较高并显蓝色，从而证明该1768bp的序列具有驱动基因表达的活性，而且该启动子驱动的Gus基因在水稻干旱诱导处理后表达。

本发明所述的启动子序列可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因连接，构建重组植物表达载体，经转化后，在干旱诱导处理后可驱动靶标基因在植株中。

技术效果

本发明所克隆的水稻启动子POsDro5能够在干旱情况下调控基因在植株中集中表达，在实际应用中具有显著价值。在农作物品种基因工程改良中，利用该启动子替换传统使用的组成型启动子驱动抗旱基因，可以在提高作物抗旱性的同时，避免因抗旱基因超量表达造成的能量浪费和产量损失，从而培育出实用有效转基因作物。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为将POsDro5启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中图1中A为pCAMBIA1391示意图，B为pCAMBIA1391-POsDro5示意图，其中示出了利用POsDro5启动子驱动位于其下游的GUS基因表达；

图2为对本发明的启动子进行酶切验证的结果示意图。

图3为干旱诱导处理图片，图中所示为将萌发7天后的POsDro5：：gus转基因幼苗，在300mM甘露醇溶液中处理24小时，模拟干旱处理的结果，同时以水处理为对照。图中NT为对照，Drought是甘露醇处理24小时后的染色结果。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

含有酶切位点的POsDro5启动子的获得

步骤1、引物的设计

根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因组序列，依据水稻POsDro5基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。

本实施例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1391(图1A，来自于CAMBIA，公开使用载体，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)为例，靶标基因为Gus基因，具体设计的引物为：正向引物(SEQ ID No:2)5’端带SalI，酶切位点(GTCGAC)，反向引物(SEQID No:3)5’端带EcoRI，酶切位点(GAATTC)，引物序列如下：

正向引物：GTCGACCTCCGTCACCACCCGTTCCTCC   SalI

反向引物：GAATTCATGTATCGGTGTGATCGGTGCT   EcoRI

由深圳华大基因公司合成。

步骤2、启动子POsDro5的获得

以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子POsDro5，按常规PCR体系，采用如下扩增程序：

95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，循环35次；最后72℃延伸10min。

回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度1768bp，将其连接到PGEM-T-Easy载体(购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合)上，按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞中，然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用SalI和EcoRI进行双酶切验证，如图2所示。将经过鉴定的阳性克隆送交Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的启动子POsDro5，其核酸序列如SEQ ID No:1所示。

植物表达载体的构建和农杆菌的转化

从上面“启动子POsDro5的获得”过程中获得的阳性克隆中提取质粒，用SalI和EcoRI双酶切，回收启动子POsDro5片段。同时利用SalI和EcoRI对pCAMBIA1391进行线性化处理、回收pCAMBIA1391，将上述的POsDro5片段和pCAMBIA1391片段用T4连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，得到启动子POsDro5与Gus基因融合的植物表达载体pCAMBIA1391-POsDro5(图1B)，利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)。

利用启动子POsDro5驱动Gus报告基因在水稻中表达

步骤1：农杆菌介导的水稻遗传转化

成熟种子去掉颖壳后，用70％酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％)溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀沿种子的糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11天后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌转化。

采用上述“植物表达载体的构建和农杆菌的转化”过程中转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan(Yongbo Duan，Chenguang Zhai，et al.An efficient and high-throughput protocol for Agrobacterium mediatedtransformation based on phosphomannose isomerase positive selection inJaponica rice(Oryza sativa L.)[J].Plant Cell Report，2012.DOI10.1007/s00299-012-1275-3.)等提出的方法。

共获得16株POsDro5-pCAMBIA1391植株(POsDro5：：gus转基因水稻植株)。

步骤2、甘露醇模拟的干旱胁迫处理

以萌发7天后的POsDro5：：gus转基因水稻植株为材料，置于300mM甘露醇溶液中24小时干旱处理后，取根、茎、叶染色；同时将材料置于水中为对照。

步骤3、GUS组织化学染色

参照Jefferson(Jefferson RA等人.GUS fusion：β-Glucuronidase as asensitive and versatile gene fusion marker in higher plant[J].EMBO J.，1987，6:3901-3907)等提出的方法，将需要染色的组织抽真空，然后浸入染色液中，37℃染色24小时。脱色时在37℃条件下用95％乙醇处理，至阴性对照材料呈白色。

GUS组织染色结果显示，在干旱诱导条件处理24小时后，甘露醇处理的POsDro5：：gus转基因水稻植株经GUS染色后呈现蓝色，而未处理的对照植株无染色。结果说明，在干旱胁迫诱导条件下，启动子POsDro5能够驱动Gus基因在水稻植株中高水平表达，结果见图3。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (6)

1.一种植物干旱胁迫诱导表达启动子，其特征在于，所述植物干旱胁迫诱导表达启动子包含SEQ ID No:1所示的DNA序列。

2.根据权利要求1所述的植物干旱诱导表达启动子，其特征在于，所述植物干旱诱导表达启动子的DNA序列为SEQ ID No:1所示的序列。

3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求1-3中任意一项所述的植物干旱诱导表达启动子，在所述重组表达载体中，所述植物干旱诱导表达启动子连接于载体中待表达的基因序列的上游。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-POsDro5，其中pCAMBIA1391为植物双元表达载体。

5.一种转化子，其特征在于，所述转化子包含权利要求1-2中任意一项所述的植物干旱诱导表达启动子或根据权利要求3-4之一所述的重组表达载体。

6.一种根据权利要求1-2中任意一项所述的植物干旱诱导表达启动子在培育转基因植物中的应用，其特征在于，所述应用包括：将根据权利要求1-2中任意一项所述的植物干旱诱导表达启动子连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。