CN103740720B - 一种水稻根特异强启动子POsRo2的鉴定和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种水稻根特异强启动子POsRo2的鉴定和应用，含有该启动子的表达盒、植物表达载体、宿主菌和转化子。本发明中启动子的应用主要是指上述启动子在植物转基因工程中的应用。本发明提供的启动子可以启动外源基因在植物根中特异性表达，适用于任何具有根的植物，特别是单子叶植物。利用根特异启动子可以进行土壤污染的生物修复，提高植物的抗旱能力和对盐、碱的耐受力，大量和微量元素的高效吸收以及增强对病原微生物的抵抗力等；同时，利用根特异启动子研究植物根的发育，根系的形态建成和根构型的重建并进行作物的遗传改良具有重要意义。

Description

一种水稻根特异强启动子POsRo2的鉴定和应用

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种水稻基因表达启动子及其应用，该启动子能够在水稻转基因调控体系中驱动目标基因在根中表达。

背景技术

启动子是基因表达调控因子中最重要的因子，基本决定一个基因是否表达、何时表达和何处表达。按作用方式和功能，启动子大体可以分为组成型启动子、特异性启动子和诱导型启动子三大类。由于组织特异性启动子使基因的表达往往只限于某些特定的器官和部位，不仅能使目的基因的表达产物在该器官和组织积累，增加区域表达量，同时可避免植物体内不必要的营养浪费，减少对植物生长的副作用。因此，利用此类启动子驱动外源基因在相应的组织特异表达，能更好地适应植物的自然生理规律，使外源基因在植物中定向、安全、高效地表达。

目前，大多数组织特异性启动子的研究主要集中在植物的地上部分，根特异启动子的研究及应用还很少。然而，根是植物的地下部分，它是植物进行营养、运输、储存等生理功能的重要器官，根特异表达系统可用于研究植物的高渗胁迫耐受、和根际分泌等。由于植物根与土壤的广泛接触，根特异启动子的研究具有广泛的应用价值。利用根特异启动子可以进行土壤污染的生物修复，提高植物的抗旱能力和对盐、碱的耐受力，大量和微量元素的高效吸收以及增强对病原微生物的抵抗力等；同时，利用根特异启动子研究植物根的发育，根系的形态建成和根构型的重建并进行作物的遗传改良具有重要意义。

在植物中，特别是水稻等禾谷类作物的基因工程遗传载体构建中能够选用的植物内源的根特异启动子仍然很少，因此，发展更多的水稻等禾谷类作物的根特异启动子对基础研究和生产应用具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种驱动外源基因在水稻根中特异性表达的启动子、获得含有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。其中，本文中所涉及的“植物”是指单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种植物根特异性表达启动子，所述启动子包含SEQ ID No:1所示的DNA序列。序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列为来源于日本晴水稻（Oryza sativa L cv.Nipponbare）的水稻根特异表达启动子，本文中称为POsRo2或启动子POsRo2。

优选地，本发明提供的启动子的DNA序列为SEQ ID No:1所示的序列，即POsRo2或启动子POsRo2。

另一方面，本发明提供另一种植物根特异性表达启动子，其DNA序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列有至少80%同源性；或者，所述植物根特异性表达启动子为在SEQ ID No:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突变体或等位基因或衍生物；或者，所述植物根特异性表达启动子为任何DNA序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列杂交的产物。这些启动子序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列具有相同或类似功能，即驱动目标基因在植物根中特异性表达。

另一方面，本发明还提供一种包含上述植物根特异性表达启动子的表达盒。

又一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明提供的上述植物根特异性表达启动子；优选地，在所述重组表达载体中，本发明提供的上述植物根特异性表达启动子连接于载体的待表达的基因序列的上游。

优选地，所述待表达的基因为Gus基因；所述重组表达载体为将SEQ IDNo:1所示的序列即POsRo2或启动子POsRo2构建于pCAMBIA1391中得到的重组表达载体，本文中称为pCAMBIA1391-POsRo2。

并且，本发明还提供一种宿主菌，所述宿主菌包含本发明提供的上述植物根特异性表达启动子、上述表达盒、或上述重组表达载体；优选地，所述宿主菌为根癌农杆菌。

另一方面，本发明提供一种转化子，所述转化子包含本发明提供的上述植物根特异性表达启动子、上述表达盒、上述重组表达载体、或上述宿主菌。其中，所述转化子优选为转基因细胞系、愈伤组织或植株。

再一方面，本发明提供上述植物根特异性表达启动子在培育转基因植物中的应用。其中所述应用包括将本发明提供的上述植物根特异性表达启动子连接于待表达的基因序列上游（例如，所述启动子与目标基因融合），从而重组表达载体，将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。待表达的基因即目标基因包括用于植物营养吸收等相关的基因。

优选地，所述应用用于改良植物根性状，所述植物为单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。

本发明中所提供的启动子的DNA序列为（与序列表中SEQ ID No：1中相同）：

CCCTCCTTCCCTTGCTACTCCCTCGCCGCCGCACCCTCCCTCCCTCACCGTTGCACTACCTCCTCCGCTCTGCTCGCTGCACCAGTCAGCCATGGCTGAGGATGCGAGCGAGTGGCAGCGGCGAGCACGGGCGAAGGATGCGAGCGGACGGCAGCGGTCGACGGCGCCGCGAACAAGGGGCAACGACGACAGAGGGGCGGCGCCGGCGCGAGCAATCTGGGAGGAGGGTGAGGGCGTGGAGAGAGAATATGGGAGGGGAGAGGGAGAGGGGAAAAGGCGTGGGGCCCATGATTGGCAAGTCAATTTTGGCTGGCCAAAGTTGGCCAGCGGGAGGAGTGGTTTGGCCAGCCGGATGGCTTGGAGAGGGAGATAGAGAGTCTGTTGGAGTGTGTTTTTGTCCAAAAATGTCAATTTTTAACTTGGAGAGGAAGATAGAGATGTTGTTGGAGATGCTCTTACACCAAGCTAACGAGCAACGACTGTCTTCTTTATCTTTAACTTATATAGAAACCAAATTTTAACTCCTTCTTTAACTTATATAAATCGAACTTGATTTTTTTTAACTTATAGGAATTGAATTTTAACCAACATGTTTCAGAGTGATATATCACATATTAACATATCTTGCCATTTTCTTTCATAATTATTTGGATGATTTGCAAACAACGAGGGAATATTTCCTCAACAGTTTAAAATCCATTCATGACTATTAGTACCATCGAAATTTACTTTAGAAAACAATCGACGCACCTACGGATCGGGTGCTCGATTTTTTTTAAAAAAAAACAAGACCACACATGGATATAATCCGATGAAAAAATATTTAGCTTATTATTGAATTATTTTTAAATGTTGCACGTTGTTCCACCAAGTAGATCGGAATTGTTTCACTAAATAGATCGAAAATGTTTCAATCGTTTAAAAAGCTGAAACACAACAAAATCACCTCATAAAACATTTTGCTACAACGTATGAAAACGGTTTTTTAAAAAATCAGGCGTTGTTTCACCTTATATAAAAATAATATTTCAGCAAATAGCGAAATAATGTTTTAATTCACTGCAACATTTGATCTATACATAGTGAAACATTATGAGTACACTTACTGAAACATTGTTGGTGGAACAAAAATTGAAACGGATTCTCTAAATAAAGCGTTTCCATAATATGTGGGTAATTTGTTGCAAAAGAATATTTCAATTCACTGCAACATTTCACATTTCATCCATACATAATTAACCATTATAAGTACACTAGTTGAGAAAAAAAATGAAACGTATTCTCTTAACAGAGAGTTTCCGTAATATGTGGGAGATTTGTTGCAACGGAGGGCATTGAGTGGTGGGGACGTGTGGGAGGCAGGCGGAGACGCGCGTGGAGGAGGGCGCCTTTTTTTCGCGGAGAGGCGCGCGTGGGGGAGAGGGCGTCCGATTTTTTTTCCCGCCGGATCGGGCGCCTGCCCTAGCATTTTCCGAAAAAACCGAAATATGGGCTGGAGTGGTGGTTGTCTGGAAAGCTCAAGCAAGTTAGCATGATATGATTCCTCCTGCTTTGATTCCAGTACATGTCGACGTCCCTTCCGTGATCTATCAACCGATCACGCCAAAAAACATTCCTAATTAATTCGGTTTTTCGCCATTGGTGCATGTTACGAGGTACAGTGCAGCCATGCCATACGCCAAGATTGTGTGCTAAACTATCATCAATCACCGAACAGAAACAAACGTCAGCATGTTCCTCAAATGCAGCATCTGGGTCACTATAATGTTCTACCAAAATATATTCAGGCCAATCCAGATCAACCAGCAAATCATCCTCACATGCAAGCTCACAGCTGCACCCACTAATCATCCAGCATTGCACCAAAATTTCTCCTATAAATACTCAAGCCACAAATGCCATCAAACCATCACAACCACACAGCAATCGAGCTAGTAATCAGGAGCTCCTGAAACTCCAGAGAGCTAATCGCTCGTCAGCTTAGTGCGCGTGATCCAGCGGCAGCAATGGCAGGCAAGGCCTCGATCGCGCTGTTCCTCGCCGTCAACCTGGTGGTGTTCTCG

需要说明的是：上述启动子的DNA序列中，序列开头以斜体并加粗表示的部分“CCCTCCTTCCCTTGCTACTCCC”为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列，共计22bp；序列末尾以斜体并加粗表示的部分“CGTCAACCTGGTGGTGTTCTCG”为获得启动子过程中使用的反向引物的留存序列（该留存序列与反向引物的相应序列互补），共计22bp；该DNA序列中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。

综上，本申请的发明人从日本晴水稻（Oryza sativa L cv.Nipponbare）中分离克隆得到结构包括转录起始位点在内的2063bp的DNA序列,并将其命名为POsRo2。将该序列经酶切后连接到植物双元表达载体pCAMBIA1391上，获得相应的重组质粒（即重组表达载体），利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行组织化学检测发现，转基因植株整体上的Gus基因表达水平相对较低，仅在根处显蓝色，从而证明该2063bp的序列具有驱动基因表达的活性，而且该启动子驱动的Gus基因在水稻根中特异性表达。

本发明所述的启动子序列可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因链接，构建重组植物表达载体，经转化后可驱动靶标基因在根中的特异性表达，从而提高外源靶标基因在植物根中的表达量，增加转基因的效果，减轻外源靶标基因由于过量表达而对作物性状的影响。

技术效果

本发明所克隆的水稻启动子POsRo2能够调控基因在根中集中表达，在实际应用中具有显著价值。通过该启动子对农作物品种进行基因改造，如通过该启动子调控目标基因在根中特异性表达，可以进行土壤污染的生物修复，提高植物的抗旱能力和对盐、碱的耐受力，大量和微量元素的高效吸收以及增强对病原微生物的抵抗力等；同时，利用根特异启动子研究植物根的发育，根系的形态建成和根构型的重建并进行作物的遗传改良具有重要意义。由于其具有在根中特异性表达的特征，可用其代替35S等组成型启动子，从而培育出理想的生物安全性高的转基因植物品种。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1A-1B为将POsRo2启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中图1A为pCAMBIA1391示意图，图1B为pCAMBIA1391-POsRo2示意图，其中示出了利用POsRo2启动子驱动位于其下游的Gus基因表达；

图2为利用POsRo2启动子驱动Gus基因表达的结果示意图，示出了水稻各部位Gus染色结果，其中图中a：根组织染色30分钟后，Gus在根组织中强表达；b：茎组织染色48小时后，没有检测到Gus活性；c：叶组织染色48小时后，没有检测到Gus活性；d：花器官染色48小时后，没有检测到Gus活性；e：叶鞘组织染色48小时后，没有检测到Gus活性；f：未脱壳的种子染色48小时后，没有检测到Gus活性；g：胚和胚乳染色48小时后，没有检测到Gus活性（标尺=20mm）；

图3为本发明的根特异性表达启动子进行酶切验证的结果示意图。

具体实施方式

以下参照附图对本发明具体的实施例进行说明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

含有酶切位点的POsRo2启动子的获得

步骤1、引物的设计

根据NCBI中提供的水稻品种日本晴（Oryza sativa L cv.Nipponbare）全基因组序列，依据水稻POsRo2基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。

本实施例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1391（图1A，来自于CAMBIA，公开使用载体，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存）为例，靶标基因为Gus基因，具体设计的引物为：正向引物（SEQ ID No:2）5’端带HindIII，酶切位点（AAGCTT），反向引物（SEQ ID No:3）5’端带E.coRI，酶切位点（GAATTC），引物序列如下：

正向引物：AAGCTTCCCTCCTTCCCTTGCTACTCCC  HindIII

反向引物：GAATTCCGAGAACACCACCAGGTTGACG E.coRI

由深圳华大基因公司合成。

步骤2、启动子POsRo2的获得

以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、正向引物扩增启动子POsRo2，按常规PCR体系，采用如下扩增程序：

95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，进行35个从95℃预变性到72℃延伸的循环；最后72℃延伸10min。

回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度2063bp，将其连接到PGEM-T-Easy载体（购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合）上，按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用HindIII和E.coRI进行双酶切验证，如图3所示。将经过鉴定的阳性克隆送交Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的启动子POsRo2，其核酸序列如SEQ ID No:1所示。

植物表达载体的构建和农杆菌的转化

从上面所述的“含有酶切位点的POsRo2启动子的获得”的过程中获得的阳性克隆中提取质粒，用HindIII和E.coRI双酶切，回收启动子POsRo2片段。同时利用HindIII和E.coRI对pCAMBIA1391载体进行线性化处理、回收pCAMBIA1391，将上述的POsRo2片段和pCAMBIA1391片段用T4连接酶（购于TaKaRa公司）进行连接，得到启动子POsRo2与Gus基因融合的植物表达载体pCAMBIA1391-POsRo2（图1B），利用冻融法将表达载体转入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105（安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存），提取阳性质粒，用HindIII和E.coRI进行酶切验证，结果如图3所示。

利用启动子POsRo2驱动Gus报告基因在水稻中表达

步骤1：农杆菌介导的水稻遗传转化

成熟种子去掉颖壳后，用70%酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween20的50%次氯酸钠（原液有效氯浓度大于4%）溶液浸泡种子40min（150r/min）。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀种子的沿糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11天后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌转化。

采用上面所述的“利用启动子POsRo2驱动Gus报告基因在水稻中表

达”过程中转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转

化，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan

（Yongbo Duan，Chenguang Zhai，et al.An efficient and high-throughputprotocol for Agrobacterium mediated transformation based onphosphomannose isomerase positive selection in Japonica rice(Oryza sativaL.)[J].Plant Cell Report，2012.DOI10.1007/s00299-012-1275-3.）等提出的方法。

共获得26株POsRo2-1391植株（POsRo2：：gus转基因水稻植株）。

步骤2、GUS组织化学染色

参照Jefferson(Jefferson RA等人.GUS fusion：β-Glucuronidase as asensitive and versatile gene fusion marker in higher plant[J].EMBO J.，1987，6:3901-3907)等提出的方法，将需要染色的组织抽真空，然后浸入染色液中，37℃染色24小时。脱色时在37℃条件下用95%乙醇处理，至阴性对照材料呈白色。

通过GUS组织染色，检测启动子POsRo2在水稻转基因植株中对Gus的启动活性。结果显示，POsRo2：：gus转基因水稻植株的根经GUS染色后呈现蓝色，且颜色非常明显，结果说明，启动子POsRo2能够驱动Gus基因在水稻根中特异性高水平的表达，而在植株的其它组织部位均无表达，结果见图2。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (8)

1.一种植物根特异性表达启动子，其特征在于，所述植物根特异性表达启动子的DNA序列为SEQ ID No:1所示的序列，所述植物根特异性表达启动子能够调控目标基因在根中集中表达。

2.一种包含权利要求1所述的植物根特异性表达启动子的表达盒。

3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求1或2所述的植物根特异性表达启动子。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，在所述重组表达载体中，所述植物根特异性表达启动子连接于载体的待表达的基因序列的上游，在构建重组表达载体时，所采用的引物为：正向引物：AAGCTTCCCTCCTTCCCTTGCTACTCCC，反向引物：GAATTCCGAGAACACCACCAGGTTGACG。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述待表达的基因为Gus基因；所述重组表达载体为pCAMBIA1391-POsRo2，其中，pCAMBIA1391为植物双元表达载体，POsRo2代表所述植物根特异性表达启动子。

6.一种宿主菌，其特征在于，所述宿主菌包含根据权利要求1所述的植物根特异性表达启动子、根据权利要求2所述的表达盒或根据权利要求3-5之一所述的重组表达载体，其中，所述宿主菌为根癌农杆菌。

7.一种根据权利要求1所述的植物根特异性表达启动子在培育转基因植物中的应用，其特征在于，所述应用包括将根据权利要求1所述的植物根特异性表达启动子连接于载体的待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用用于改良植物根性状，所述植物为单子叶植物：水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦；所述待表达的基因为Gus基因；所述重组表达载体为pCAMBIA1391-POsRo2，其中，pCAMBIA1391为植物双元表达载体，POsRo2代表所述植物根特异性表达启动子。