CN104073492B - 一种作物糊粉层特异表达启动子PosAL1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种作物糊粉层特异表达启动子PosAL1及其应用。本发明还提供了含有该启动子的表达盒、作物表达载体、宿主菌和转化子。具体而言，本发明将上述启动子应用在作物基因工程中。本发明提供的启动子可以特异地驱动外源基因在作物颖果糊粉层中表达，从而可有效用于种子品质和萌发特性的基因工程改良。用于改善作物颖果糊粉层的性状。

Description

一种作物糊粉层特异表达启动子PosAL1及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术和作物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种作物糊粉层特异表达启动子及其应用，该启动子能够在作物基因工程中驱动目标基因在颖果糊粉层中特异表达，从而可在不影响其他组织部位生理活动的情况下达到通过改变糊粉层结构特性改良种子品质或萌发能力的目的。

背景技术

启动子作为转录水平上一个重要的调控元件，通过和众多转录因子的结合进而决定了基因的表达模式与表达强度。深入研究启动子的结构、功能、作用模式等对于回答分子生物学中的一些基本理论问题具有重大意义。如何让外源基因在植物体内定向、高效、稳定的表达是植物基因工程研究的出发点和落脚点。用组织特异表达启动子来驱动目的基因表达可有效的避免用组成型表达启动子所带来的一些诸如代谢负担之类的负面效应。

主要的单子叶主粮作物如水稻和小麦的表层胚乳会形成糊粉层，在颖果发育过程中，糊粉层将灌浆物质转运到胚和胚乳细胞内部；籽粒萌发时，分泌水解酶水解胚乳细胞中贮藏的淀粉和蛋白从而发挥重要的水解功能，同时糊粉层细胞也是种子中主要积累脂类、蛋白、维生素、铁锌元素的部位，因此，糊粉层细胞是作物基因工程改良的主要靶点。要精确操纵糊粉层细胞的生理生化活性，糊粉层特异表达启动子将至关重要，但目前仅有少量的特异启动子的报道，如大麦LTP2启动子和玉米AL9启动子，远远无法满足分子设计育种的需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种驱动外源基因特异的在作物糊粉层特异表达的启动子、获得含有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。其中，本文中所涉及的“作物”是指单子叶作物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种作物糊粉层特异表达启动子，所述作物糊粉层特异表达启动子包含序列表中SEQIDNo:1所示的DNA序列。序列表中SEQIDNo:1所示的DNA序列为来源于日本晴水稻(OryzasativaLcv.Nipponbare)的序列，本文中称为PosAL1或启动子PosAL1。具体而言，本申请的发明人发现日本晴水稻(OryzasativaLcv.Nipponbare)中LOC_Os03g49190基因前包括转录起始位点在内的1960bp的DNA序列具有驱动目标基因在作物糊粉层特异表达的作用。并且分离克隆得到了序列表中SEQIDNo:1所示的DNA序列。

优选地，本发明提供的作物糊粉层特异表达启动子的DNA序列为SEQIDNo:1所示的序列，即PosAL1或启动子PosAL1。

另一方面，本发明提供一种作物糊粉层特异表达启动子，其DNA序列与SEQIDNo:1所示的DNA序列有至少80％同源性；或者，所述作物糊粉层特异表达启动子为在SEQIDNo:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突变体或等位基因或衍生物；或者所述作物糊粉层特异表达启动子具有与SEQIDNo:1所示的DNA序列杂交的产物。这些作物糊粉层特异表达启动子序列与SEQIDNo:1所示的DNA序列具有相同功能，即驱动目标基因在作物中表达。

另一方面，本发明还提供一种包含上述作物糊粉层特异表达启动子的表达盒。

又一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述的作物糊粉层特异表达启动子，在所述重组表达载体中，所述作物糊粉层特异表达启动子连接于待表达的基因序列的上游；优选地，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-PosAL1，该重组表达载体为将SEQIDNo:1所示的序列即PosAL1或启动子PosAL1构建于pCAMBIA1391中得到的重组表达载体，本文中称为pCAMBIA1391-POSAL1。

或者待表达基因可以为任何对作物的糊粉层性状具有改善能力的基因。通过本发明的启动子驱动该基因在糊粉层中特异性地集中表达，从而实现改善作物糊粉层相应性状的功能。

另一方面，本发明还提供一种宿主菌，所述宿主菌包含本发明提供的上述作物糊粉层特异表达启动子、上述表达盒、或上述重组表达载体；优选地，所述宿主菌为根癌农杆菌。

另一方面，本发明提供一种转化子，所述转化子包含本发明提供的上述作物糊粉层特异表达启动子、上述表达盒、上述重组表达载体、或上述宿主菌。其中，所述转化子优选为转基因细胞系、愈伤组织或植株。

再一方面，本发明提供上述作物糊粉层特异表达启动子在培育转基因作物中的应用。所述应用包括将本发明提供的上述作物糊粉层特异表达启动子连接于载体的待表达的基因序列上游(例如，将所述启动子序列置于/插入目标基因之前)，从而构建重组表达载体，将所述重组表达载体转化到作物细胞、组织或器官中进行培育。

并且优选地，所述应用可以用于改良作物生长特性，所述作物为单子叶作物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。

本发明中所提供的启动子的DNA序列为(与序列表中SEQIDNo：1中相同)：

需要说明的是：上述启动子的DNA序列中，序列开头以斜体并加粗表示的序列“aatcactacgcaatatgtttgt”为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列，共计22bp；序列末尾以斜体并加粗表示的序列“catcttgctagctagcttagca”为获得启动子过程中使用的反向引物的留存序列(该留存序列与反向引物的相应序列互补)，共计22bp；该DNA序列中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。即便本领域技术人员在本发明的基础上，采用其他引物获得了类似序列，其也落入本发明的保护范围之内。

综上所述，本发明的发明人发现、提取并鉴定了日本晴水稻(OryzasativaLcv.Nipponbare)中LOC_Os03g49190基因前包括转录起始位点在内的1960bp的DNA序列，并将其命名为PosAL1(序列表中的SEQIDNo:1)。具体而言，发明人发现该序列具有驱动基因在糊粉层中特异性表达的能力，提取出该序列并对上述能力进行了鉴定。发明人将该序列经酶切后连接到作物双元表达载体pCAMBIA1391上，获得相应的重组质粒(即重组表达载体)，利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行组织化学检测发现，转基因植株仅在糊粉层中有蓝色出现，在其他器官组织中均没有着色，从而证明该1960bp的序列具有驱动基因特异的在糊粉层中表达的活性。

本发明所述的启动子序列可与作物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因连接，构建重组作物表达载体，经转化后，可在糊粉层特异的驱动靶标基因在表达。

技术效果

本发明所克隆的水稻启动子PosAL1能够调控基因在植株中糊粉层部位集中表达，在实际应用中具有显著价值。通过该启动子代替35S等组成型启动子对农作物的糊粉层性状进行基因改造，如通过该启动子调控目标基因在糊粉层中表达，可以有效地改良谷物品质和/或调节种子萌发能力。该启动子可在不影响其他组织部位生理活动的情况下达到通过改变糊粉层结构特性改良种子品质或萌发能力的目的。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为将PosAL1启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中图1中A为pCAMBIA1391示意图，B为pCAMBIA1391-PosAL1示意图，其中示出了利用PosAL1启动子驱动位于其下游的GUS基因表达；

图2为对本发明的启动子进行酶切验证的结果示意图。

图3为利用PosAL1启动子驱动Gus基因表达的结果示意图，示出了水稻各部位Gus染色结果，其中示出了PosAL1：：gus转基因水稻植株，其中A表示根，B表示茎，C表示叶，D表示叶鞘，E表示花，F表示胚乳横切面；从图中可以看出，GUS染色出现的蓝色仅在图F中的种皮和胚乳之间的糊粉层中出现。图中标尺＝1cm。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的生化试剂，载体耗材等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

含有酶切位点的PosAL1启动子的获得

步骤1、引物的设计

根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(OryzasativaLcv.Nipponbare)全基因组序列，依据水稻PosAL1基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。

本实施例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1391(图1中A部分，来自于CAMBIA，公开使用载体，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)为例，靶标基因为Gus基因，具体设计的引物为：正向引物(SEQIDNo:2)5’端带SalI，酶切位点(GTCGAC)，反向引物(SEQIDNo:3)5’端带EcoRI，酶切位点(GAATTC)，引物序列如下：

正向引物：GTCGACAATCACTACGCAATATGTTTGTSalI

反向引物：GAATTCTGCTAAGCTAGCTAGCAAGATGEcoRI

由深圳华大基因公司合成。

步骤2、启动子PosAL1的获得

以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子PosAL1，按常规PCR体系，采用如下扩增程序：

95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，35个从95℃预变性到72℃延伸的循环；最后72℃延伸10min。

回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度1960bp，将其连接到PGEM-T-Easy载体(购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合)上，按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞中，然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用SalI和EcoRI进行双酶切验证，如图2所示。将经过鉴定的阳性克隆送交Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的启动子PosAL1，其核酸序列如SEQIDNo:1所示。

作物表达载体的构建和农杆菌的转化

从上面“启动子PosAL1的获得”过程中获得的阳性克隆中提取质粒，用SalI和EcoRI双酶切，回收启动子POSAL1片段。同时利用SalI和EcoRI对pCAMBIA1391进行线性化处理、回收pCAMBIA1391，将上述的PosAL1片段和pCAMBIA1391片段用T4连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，得到启动子POSAL1与Gus基因融合的作物表达载体pCAMBIA1391-PosAL1(图1B)，利用冻融法将作物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)。

利用启动子PosAL1驱动Gus报告基因在水稻中表达

步骤1：农杆菌介导的水稻遗传转化

成熟种子去掉颖壳后，用70％酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％)溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀沿种子的糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11天后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌转化。

采用上述“作物表达载体的构建和农杆菌的转化”过程中转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照YongboDuan(YongboDuan，ChenguangZhai，etal.Anefficientandhigh-throughputprotocolforAgrobacteriummediatedtransformationbasedonphosphomannoseisomerasepositiveselectioninJaponicarice(OryzasativaL.)[J].PlantCellReport，2012.DOI10.1007/s00299-012-1275-3.)等提出的方法。

共获得28株PosAL1-pCAMBIA1391植株(PosAL1：：gus转基因水稻植株)。

步骤2、GUS组织化学染色

参照Jefferson(JeffersonRA等人.GUSfusion：β-Glucuronidaseasasensitiveandversatilegenefusionmarkerinhigherplant[J].EMBOJ.，1987，6:3901-3907)等提出的方法，将需要染色的组织抽真空，然后浸入染色液中，37℃染色24小时。脱色时在37℃条件下用95％乙醇处理，至阴性对照材料呈白色，结果见图3，蓝色仅在种皮和胚乳之间的糊粉层中出现(由于专利附图中体现不出彩色，图3的F中种皮和胚乳之间的深色部分就表示发生染色)。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (5)

1.一种作物糊粉层特异表达启动子PosAL1，其特征在于，所述作物糊粉层特异表达启动子PosAL1由SEQIDNo:1所示的DNA序列构成。

2.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含权利要求1所述的作物糊粉层特异表达启动子PosAL1。

3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求1所述的作物糊粉层特异表达启动子，在所述重组表达载体中，所述作物糊粉层特异表达启动子连PosAL1接于载体中待表达的基因序列的上游。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-PosAL1，其中pCAMBIA1391为作物双元表达载体；或者所述待表达基因是具有改善糊粉层性状功能的基因。

5.一种根据权利要求1所述的作物糊粉层特异表达启动子PosAL1在培育转基因水稻中的应用，其特征在于，所述应用包括：将权利要求1所述的作物糊粉层特异表达启动子连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到水稻细胞、组织或器官中进行培育。