CN102864167A

CN102864167A - 一种植物表达载体及培育低植酸水稻的方法

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Publication number: CN102864167A
Application number: CN201210364073XA
Authority: CN
Inventors: 舒庆尧; 李文旭; 赵海军
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2012-09-26
Filing date: 2012-09-26
Publication date: 2013-01-09
Anticipated expiration: 2032-09-26
Also published as: CN102864167B

Abstract

本发明公开了一种植物表达载体及培育低植酸水稻的方法，该植物表达载体包括插入原始载体的发夹结构单元和特异性启动子，所述特异性启动子为启动子Oleosin 18，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。该方法包括：(1)构建所述植物表达载体；(2)将所述植物表达载体通过农杆菌介导转化水稻愈伤组织；(3)将水稻愈伤组织转移到选择性培养基上继续培养，待分化成苗，移栽大田，筛选获得低植酸水稻植株。本发明利用种子特异性启动子Oleosin 18控制基因表达，使基因沉默仅发生在种子胚和糊粉层，能够有效避免水稻其他组织部位植酸合成受到影响。

Description

一种植物表达载体及培育低植酸水稻的方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，尤其涉及一种植物表达载体及培育低植酸水稻的方法。

背景技术

植酸(PA，phytic acid)，又名肌醇六磷酸(myo-inositol-1，2，3，4，5，6-hexakisphosphate，简写InsP6或IP6)，广泛存在于禾谷类、豆类、坚果、油料作物的种子中，是植物磷的主要储存形式。在植物体内，植酸及其衍生物承担着多种生理功能，如在种子发育过程中储藏磷、能量等，在种子萌发时向种子提供无机磷。此外，植酸及其衍生物也参与细胞内的信号转导、能量转换、ATP代谢及抗逆性等过程。然而，由于人和非反刍动物(猪、鸡、鱼等)肠胃内缺乏消化植酸及植酸盐的相关酶，因此以禾谷类、豆类等为主食的人类和饲用动物的排泄物中磷的含量很高，极易造成环境水体富营养化；同时植酸与Zn²⁺、Ca²⁺、Fe³⁺等形成的植酸盐不能被人和非反刍动物所吸收利用，造成这些微营养的生物有效性下降。因此，通过遗传育种或者基因工程技术获得植酸含量适当下降、其他农艺性状没有显著变异的作物，不仅能够提高食物的营养价值，同时对于保护生态环境有重要的社会意义。

V.Raboy等(1996)采用化学诱变剂处理玉米，培育了两类低植酸突变体lpa1和lpa2，植酸含量分别下降66％和30％。随后应用γ射线和化学诱变剂在大麦、水稻、小麦、大豆等作物获得了多种植酸突变体和品种，这些突变体和品种的种子植酸含量下降幅度从30到90％不等。然而研究发现，伴随着种子中植酸含量下降，作物的其他农艺性状也会发生改变，如作物减产、种子活力下降、植株形态改变，甚至会影响植物对病原菌的抗性，严重的还会导致致死突变。因此，获得作物种子植酸含量下降而其他农艺性状没有显著变异的低植酸品种成为摆在育种家面前的难题。

到目前为止，植物植酸代谢途径已经了解比较清楚，参与植酸代谢的多个功能基因已经被报道。包括：将光合作物产物葡萄糖-6-磷酸转化成1D-肌醇-3-磷酸的MIPS基因；负责肌醇和3-磷酸肌醇之间转化的MIK和IMP基因；参与肌醇磷酸化的IPK1和IPK2基因；承担运输植酸到贮藏小泡的MRP5(水稻)基因；将植酸水解为肌醇和无机磷的植酸酶基因。目前功能研究最为详细的是MIPS基因，并通过基因沉默技术在多种作物中获得了相应的低植酸突变体。Ruth Keller等(1998)应用组成型启动子和反义RNA技术，获得了MIPS基因表达水平下降的转基因土豆，分析发现转基因土豆叶片中肌醇的含量下降；Aline C.S.Nunes等(2005)通过RNAi技术沉默MIPS基因使大豆中的植酸含量下降了94.5％；Mio Kuwano等(2008)通过反义RNA技术在种子特异性启动子的驱动下，获得了植酸含量下降、其他农业性状没有显著变异的转基因水稻。此外，Shi等(2007)应用RNAi技术，在玉米种子特异性启动子Ole16和Glb驱动下，通过沉默MRP4基因获得种子植酸含量下降的玉米和大豆。目前还没有通过RNAi技术沉默其他植酸代谢相关基因，培育低植酸水稻或其他作物的报道。

发明内容

本发明提供了一种植物表达载体，利用该植物表达载体能特异性地抑制水稻种子中相应植酸代谢相关基因MIK的表达，从而获得性状稳定的低植酸水稻植株。

一种RNAi抑制水稻MIK基因表达的植物表达载体，包括插入原始载体的发夹结构单元和特异性启动子，所述特异性启动子为启动子Oleosin18，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。MIK基因来自于水稻，其基因序列号；LOC Os03g52760，其序列如SEQ ID No.8所示。

本发明植物表达载体使用种子特异性启动子Oleosin18，可以使基因沉默事件仅发生在种子胚和糊粉层，能够有效地避免其他组织部位植酸合成受到影响。

所述发夹结构单元包括中间的内含子及两端的目的基因片段和目的基因片段的反向互补片段，所述目的基因片段为MIK基因cDNA序列的部分序列，MIK基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。内含子在本发明中没有特异性的要求，它可以来自菜豆亚硝酸还原酶基因(基因序列号：U10419.1)，碱基序列如SEQ ID NO.3所示。扩增所述目的基因片段的引物为引物MIKRNAi-F和MIKRNAi-R如下：

MIKRNAi-F：5’-TACTTGAGAAGGCAGTAAAACGAC-3’；

MIKRNAi-R：5’-AGAGCACATAATTCAACAGAGAGC-3’；

所述原始载体可以是pCAMBIA1301-35SN或其他可用于农杆菌转化的双元载体。

本发明还提供了一种培育低植酸水稻的方法，包括：

(1)构建所述的植物表达载体；

(2)将所述植物表达载体通过农杆菌介导转化水稻愈伤组织；

(3)将水稻愈伤组织转移到选择性培养基上继续培养，待分化成苗，移栽大田，筛选获得低植酸水稻植株。

其中，所述植物表达载体的构建方法为：

(1)构建发夹结构单元；

(2)将启动子Oleosin 18替换原始载体的启动子；

(3)将发夹结构单元插入启动子Oleosin 18的下游。

所述农杆菌可以选择为EHA105根瘤农杆菌。

为了获得性状稳定的转基因低植酸植株，可以对获得低植酸水稻植株多代种植。

其中发夹结构单元构建过程为：

(1)提取水稻幼胚总RNA，反转录合成cDNA；

(2)以所述cDNA为模板，利用引物MIKRNAi-F和MIKRNAi-R进行PCR扩增；

(3)将pSSK-IN载体和扩增产物经两次双酶切，然后连接获得带发夹结构单元的载体。

所述启动子Oleosin 18的制备方法为：

(1)提取水稻种子总DNA；

(2)以所述总DNA为模板，利用引物Ole18-F和Ole18-R进行PCR扩增。

所述引物Ole18-F和Ole18-R如下：

Ole18-F：5’-AAGCTTATGTCTGCCAGCATTGTGAAG-3’；

Ole18-R：5’-GGTACCTGCTAAGCTAGCTAGCA AGATGA-3’。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供的方法利用种子特异性启动子Oleosin 18控制水稻种子中MIK基因表达，使基因沉默事件仅发生在种子胚和糊粉层，能够有效避免水稻其他组织部位植酸合成受到影响。

(2)利用本发明提供的方法能够获得稳定的转基因低植酸水稻品系，并且与其他非转化阴性系在株高、穗长、千粒重等其他农艺方面无显著差异，保证了转基因低植酸水稻的整体品质。

附图说明

图1A为Oleosin18-T载体的菌落PCR扩增验证结果图。

图1B为MIK-T载体的菌落PCR验证结果图。

图2为pSi-MIK载体结构示意图。

图3为转化水稻愈伤组织的GUS显色图。其中，“+”表示转基因阳性，“-”表示非转基因阴性。

图4为转基因水稻叶片GUS显色图。其中，“+”表示转基因阳性，“-”表示非转基因阴性。

图5为种子无机磷显色反应结果图。其中，“+”表示转基因阳性，“-”表示非转基因阴性。

具体实施方式

1、MIK基因片段的扩增

(1)总RNA提取

采用QIAGEN RNeasy Plant Mini试剂盒提取日本晴开花后14天幼胚总RNA，具体步骤为：

①用液氮把样品磨成粉末，转移至自备的1.5mL离心管中，可直接做下面的步骤或者存于-70℃冰箱中。

②称取重量小于100mg的样品到离心管中，加入450μL RLT或RLC缓冲液(使用前加4.5μLβ-巯基乙醇)，剧烈振荡，56℃下温浴3min，涡旋混匀样品。

③将溶解的样品转移到紫色回收柱中，14000rpm离心2min，将上清液转移至一新的1.5mL离心管中(自备)，不要搅动管底沉淀。

④上清液中加入0.5倍体积的无水乙醇，混匀。

⑤将样品转移到粉红色的离心柱中，10,000rpm离心15s。

⑥弃去收集管中的液体，在回收柱中加入700μL缓冲液RW1，10000rpm离心15s。

⑦将回收柱转到一新的2mL收集管中，加入500μL缓冲液RPE，10000rpm离心15s。

⑧再加一次500μL RPE缓冲液，14000rpm离心2min，之后倒出液体，再空管离心1min。

⑨将回收柱置于一新的1.5mL离心管中，加入30-50μL RNase-free水至膜上，12000rpm离心1min。加RNase-free水可分为两步，例如先加30μL洗一次，再加20μL洗一次。

(2)反转录

采用M-MLV RTase cDNA Synthesis试剂盒反转录生成cDNA。具体步骤为：

①RNA预变性：10μL RNA(200ng/μL)+2μL Oligo(dT)，65℃，5min，冰上冷却2min；

②反转录：利用预变性后的RNA进行反转录反应。反应完成后，将获得的cDNA在42℃下保温1h，冰上冷却，备用。

反转录体系如下：

(3)MIK基因片段的扩增

根据Gramene网站日本晴的MIK基因序列，设计引物MIKRNAi，以上述cDNA(SEQ ID NO.1)为模板，用高保真酶KOD-Plus进行扩增。

MIKRNAi-F：5’-TACTTGAGAAGGCAGTAAAACGAC-3’；

MIKRNAi-R：5’-AGAGCACATAATTCAACAGAGAGC-3’；

PCR反应体系为：

PCR反应程序为：预变性94℃ 2min

延伸 68℃ 7min

保温 16℃

2、Ole18启动子的扩增

(1)水稻基因组DNA提取

采用博日植物基因组小量提取试剂盒提取水稻日本晴花期叶片基因组DNA。具体步骤为：

①在液氮或者冰浴中将植物组织研磨粉碎。

②取不多于100mg经研磨的组织，放入1.5或2.0mL微量离心管中。

③加450μL LP Buffer，并混合均匀。(可选：加入4μL的100mg/mLRNase A)。

④于65℃环境中温浴15min(温浴过程中可间或振荡离心管2-3次)，然后移出。

⑤加150μL DA Buffer，混合均匀后于冰浴中放置5min。

⑥将混合物全部转移到Shredder spin column，于14,000g离心3min(也可先于14,000g离心3min，再将上清液转移到Shredder spincolumn，12,000g离心1min)。

⑦将滤液转移到一个新的1.5mL离心管。

⑧加750μL或滤液体积1.5倍的P Binding Buffer，并混合均匀。

⑨将混合液体转移到spin column。于6,000g离心1min，并弃去接液管中的液体。由于混合液体体积大于750μL，分2次离心过柱。

⑩向spin column中加入500μL的G Binding Buffer。于10,000g离心30s，并弃去接液管中液体。

向spin column中加入600μL的Wash Buffer。于10,000g离心30s，并弃去接液管中液体。

重复步骤

一次。

再次将spin column于10,000g离心1min，并将spin column转移至一个新的1.5mL离心管上。

向spin column中加入100μL-200μL的Elution Buffer，并于室温温育1min。

于12,000g离心1min，并弃去spin column。1.5mL离心管中所接的液体中含有DNA。

提取的DNA可直接用于各种下游试验，如果不立即使用，保存于-20℃。

(2)Oleosin18启动子的扩增

根据Gramene网站有关日本晴Oleosin18 KDa基因上游序列设计引物Ole18-F和Ole18-F，以总DNA为模板，用高保真酶KOD-Plus，扩增得到Oleosin18启动子片段，具体操作如下：

PCR反应体系为：

PCR反应程序为：预变性 94℃ 2min

延伸 68℃ 7min

保温 16℃

Ole18-F：5’-AAGCTTATGTCTGCCAGCATTGTGAAG-3’；

Ole18-R：5’-GGTACCTGCTAAGCTAGCTAGCAAGATGA-3’。

3、目的基因片段克隆到T-vector和测序验证

(1)连接

目的基因片段纯化末端加A后连入pUcm-T载体或者pMD-18T载体，16℃过夜连接。连接体系为：

(2)大肠杆菌感受态细胞的转化

①将购自TaKaRa公司的装有DH5α感受态细胞的离心管置于冰上10min左右，待其全部融化后加入10μL上述连接产物，用枪头轻轻混匀。

②冰浴30min后，将装有感受态细胞的离心管转入42℃水浴中，热击1min，迅速将装有感受态细胞的离心管冰浴5min。

③每管加入800μL LB液体培养基，37℃，180rpm摇床中培养45min。

④将转化好的大肠杆菌于5000rpm离心5min，弃去上清，保留100-200μL的LB培养基，枪头反复吸打重悬细胞后涂布到加有相应抗性的筛选平板上37℃过夜培养。

(3)阳性克隆鉴定

在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上筛选12-14个小时后，挑取菌落PCR验证阳性的克隆送到南京金斯瑞生物科技有限公司测序，验证结果如图1A和图1B所示。测序结果表明已经将Oleosin18启动子片段、MIK基因片段分别成功克隆到T载体，表明连接成功。

(4)RNAi中间载体的构建

将测序验证的MIK基因片段，分别经过NotI+BamHI和KpnI+XhoI酶切后连入同样处理的pSSK-IN载体形成“目的基因片段、内含子、目的基因片段(反向)”的RNAi发夹结构。

①NotI+BamHI酶切体系如下：

酶切温度为37℃，酶切时间不少于4hr，之后加入10×loading Buffer终止反应，回收纯化后连接。

②KpnI+XhoI酶切体系如下：

(5)pCAMBIA1301-OleN载体的构建

通过HindIII+KpnI酶切将Ole18启动子连入到pCAMBIA1301-35SN载体，置换掉其原有的35S启动子获得pCAMBIA1301-OleN载体的构建。

HindIII+KpnI酶切体系如下：

(6)pSi-MIK植物表达载体构建

通过KpnI+SalI酶切将RNAi中间载体中的RNAi发夹结构转移到pCAMBIA1301-OleN载体，最终获得pSi-MIK植物表达载体(图2)。

SalI+KpnI酶切体系如下：

(7)转化农杆菌

①取10μL pSi-MIK质粒与EHA105根瘤农杆菌感受态细胞均匀混合，冰上放置30min。

②将装有感受态细胞的离心管浸入液氮5min，37℃水浴5min，重复一次。

③向离心管中加入800μL YEB培养基，28℃180r/min培养1h后，涂布到含有卡那霉素和利福平的YEP培养基上培养2天，菌落PCR鉴定。

(8)根瘤农杆菌介导的水稻成熟胚遗传转化法

1)转化农杆的菌富集培养

①挑取含有转化载体的农杆菌菌液，划线到YEB培养基(含50mg/LKan和30mg/L Rif)上，28℃培养2天。

②挑取单克隆或吸取所保藏的农杆菌菌液100μL于4mL YEP(含50mg/L Kan和30mg/L Rif)培养液中，28℃，250rpm振荡过夜培养。

③次日，从含有农杆菌的YEP培养液中吸取1-2mL，转入25-50mLAB(含30μmol/L Rif+50μmol/L Kan+100μmol/L As)液体培养基中培养，28℃，250rpm，培养约4小时左右，直到OD600达到0.5左右。

2)侵染-水稻愈伤组织与农杆菌共培养

①用含100μmol/L As的等体积AAM重悬上一步骤中获得的菌液。

②挑取圆形的、米黄色的、质地致密的已经在NBD培养基继代培养3-7天的水稻日本晴愈伤组织到100mL无菌锥形瓶。

③将①步中的活化菌液加入已经准备好的愈伤组织，28℃，150rpm侵染30min后，将愈伤组织转到滤纸上干燥30min。

④将已经干燥的愈伤组织转移到表层覆盖一层滤纸的NBD培养基(含100μmol/LAs，pH 5.2)共培养3天。

3)筛选培养

①将培养3天的水稻愈伤组织转移到100mL无菌锥形瓶，加入约50mL无菌水，振荡清洗，每次3-5min，洗5-6次，直到清洗液变得清澈透明。

②再用含有Carb(500mg/mL)的无菌水清洗愈伤组织三次，每次3-5min。

③将愈伤组织转到滤纸上干燥30min后，将愈伤组织转移到NBD培养基(含25mg/L Hyg和500mg/L Carb)上28℃暗培养2周，之后继代培养到新的NBD培养基(含50mg/L Hyg和500mg/LCarb)28℃暗培养2-3周。

4)分化成苗

①挑取直径为0.5-1.0mm水稻抗性愈伤组织继代到分化培养基(NB培养基，含1mg/L NAA和2mg/L 6-BA)，28℃光照(5000lx)培养2-3周。

②待愈伤组织的不定芽长成高约2-4cm的小苗后，将其转移到含有0.5mg/L NAA的1/2MS生根培养基中，28℃光照(5000lx)培养。小苗生根后，将其根部培养基洗净移栽到大田。

(9)转基因水稻的检测和筛选

第一阶段，组培阶段：水稻愈伤组织在转入分化培养基前，挑取每个转化系的部分愈伤组织进行GUS显色反应(图3)，检测为阳性的愈伤组织继代到分化培养基上。

第二阶段，炼苗阶段：取少量水稻叶片，进行GUS显色反应(图4)并详细记录，检测为阳性的水稻小苗种于田间。

第三阶段，收获后：单株收获水稻种子，每个株系取8-12粒种子，采用半粒种子无机磷显色反应(图5)，分析种子中无机磷含量，筛选出转基因阳性株系。对所筛选出的阳性株系，多代种植，对各世代的种子进行半粒种子无机磷显色反应，筛选出稳定的转基因低植酸水稻。

根据GUS显色技术筛选到14个转基因阳性系，其中10个系在半粒种子无机磷检测反应中显示阳性，最终得到3个稳定转基因阳性系。(10)转基因低植酸水稻农艺形状调查和植酸含量测定

获得稳定的转基因低植酸水稻后，比较分析其与非转基因阴性系水稻在株高、穗长、千粒重等农艺性状上是否存在差异；并通过HPIC技术检测水稻种子糙米植酸含量。检测分析结果如表1所示。

表1转基因阳性系和非转基因阴性系水稻种子糙米植酸含量及其他农艺性状调查

(注：“+”表示转基因阳性系，“-”表示非转基因阴性系。)

可见，转基因阳性系水稻与非转基因阴性系水稻在植酸含量上存在差异，如WXR002种子植酸含量比WXR003低50％；而在株高、穗长、千粒重等其他农艺性状上则无显著差异。

Claims

1.一种RNAi抑制水稻MIK基因表达的植物表达载体，包括插入原始载体的发夹结构单元和特异性启动子，其特征在于，所述特异性启动子为启动子Oleosin 18，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.如权利要求1所述的植物表达载体，其特征在于，所述原始载体为pCAMBIA1301-35SN。

3.如权利要求1所述的植物表达载体，其特征在于，所述发夹结构单元包括中间的内含子及两端的目的基因片段和目的基因片段的反向互补片段，所述内含子的碱基序列如SEQ ID No.3所示。

4.如权利要求3所述的植物表达载体，其特征在于，所述MIK基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

5.一种培育低植酸水稻的方法，其特征在于，包括：

(1)构建如权利要求1～4任一所述的植物表达载体；

(2)将所述植物表达载体通过农杆菌介导转化水稻愈伤组织；

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述植物表达载体的构建方法为：

(1)构建发夹结构单元；

(2)将启动子Oleosin 18替换原始载体的启动子；

(3)将发夹结构单元插入启动子Oleosin 18的下游。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述农杆菌为根瘤农杆菌EHA105。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，将低植酸水稻植株种植多代，获得性状稳定植株。