CN105063047B - 植物种子特异表达启动子OsSee1 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种植物种子特异表达启动子OsSee1的克隆及应用。本发明还提供了含有该启动子的表达盒、植物表达载体并将其应用于植物基因工程中。本申请的发明人通过对水稻品种日本晴的特定基因组进行扩增、分离、分析、利用以及实验验证，从而获得并验证了具有特殊功能的一段DNA序列——水稻种子特异性表达启动子OsSee1。本发明提供的启动子能够特异地驱动外源基因在水稻种子中表达，因此在基因工程中用该启动子替代组成型启动子驱动目标基因，既可以特异性的表达目的基因，又将避免其它基因的无效表达，从而达到改良水稻品质的作用。

Description

植物种子特异表达启动子OsSee1

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种水稻种子特异表达启动子OsSee1及其应用，该启动子能够在水稻转基因调控体系中特异性的驱动目标基因的在种子中的表达。

背景技术

植物基因表达受生物体内各种理化因素的调节控制，植物能够根据自身需要及环境的改变，定时、定位及定量地表达所需要的基因产物。基因表达在DNA水平、转录水平、转录后水平、翻译水平、翻译后加工、运输及定位等各个层次都进行着精细的调控。基因转录水平表达调控是基因表达调控中最主要的调控方式，在这一系列过程中涉及到启动子、终止子、UTR序列等调控元件，在这些调控元件中，启动子决定转录起始点和转录频率，作用尤为重要。

启动子是RNA聚合酶能够识别并与之结合，从而起始基因转录的一段DNA序列，通常位于基因上游，其长度因生物种类而异。基因的启动子区基本上是由两部分组成：一部分是形成普通性转录结构所需要的，通常称为核心启动区，包括转录起始点及邻近的TATA框；另一部分是决定基因转录特异性和活性的区域。两部分都参与基因转录的调控，但后一部分起主要的控制作用。核心启动子决定转录的准确起始，而启动子上游顺式调控元件则决定时空差异表达的有序进行。经序列分析研究发现，组织特异启动子的顺式调控元件有一定的保守性，而这些特异序列元件也正是基因特异表达所必须的。

种子特异性启动子具有基本启动子、起始子和上游元件。其中，基本启动子和起始子是行使转录所必要的。基因表达时间、表达部位需要启动子上的顺式调控元件与相应的转录因子的协同作用。种子特异性启动子区别于其它类型启动子的显著特点是启动子上游存在一些特异的调控元件，这些调控元件与调控种子特异性基因的特异表达有关。

在组成型启动子的控制下，外源基因在转基因植物的所有部位和所有发育阶段表达，不但造成植物能量和养分的消耗，可能导致宿主植物性状的改变，影响植物的生长发育。而种子特异性启动子可以控制外源基因在植物种子中高效表达，避免外源基因在植物的其它部位表达所造成的能量、营养浪费，减少对植物的不利影响。

此外，我们的主要粮食作物和油料作物例如小麦、水稻、玉米和油菜等，其主要的食用部位均为种子。因此，种子特异性启动子的研究对植物基因工程的发展和人们生产生活水平的提高具有十分重要的意义。但是，很明显目前人们对种子特异启动子方面的研究并不够，目前所公开的种子特异启动子并不能满足研究和生产的需要。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种分离鉴定本底信号低、特异性高的新型启动子，这种启动子对作物基因工程将有着重要的意义。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种水稻种子特异表达启动子OsSee1，该水稻种子特异表达启动子OsSee1包含：

1)序列表中SEQ No：1所示的DNA分子；或者

2)在严格条件下与1)中的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；或者

3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上的同源性，且具有启动子功能的DNA分子；或

4)在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列中添加、缺失或取代一个或多个核苷酸后所获得的具有启动子功能的核苷酸序列。

2)、3)和4)中水稻种子特异表达启动子序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列具有相同的功能，即驱动目标基因在植物中表达。

序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列为来源于日本晴水稻(Oryza sativa Lcv.Nipponbare)的水稻种子特异表达启动子，本文中称为OsSee1或启动子OsSee1。具体而言，本申请的发明人发现日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)基因上游包括转录起始位点在内的1960bp的DNA序列，具有驱动目标基因水稻种子中特异性表达的功能，并且分离克隆、并鉴定了该DNA序列的功能。

另一方面，本发明提供一组扩增所述DNA片段或其部分片段的引物对。

另一方面，本发明提供一种含有所述DNA片段的重组载体或表达盒。

另一方面，本发明提供一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为在植物表达载体pCAMBIA1391的多克隆位点插入所述的DNA片段得到的重组质粒，在所述重组表达载体中，所述水稻种子特异表达启动子OsSee1连接于载体中待表达的基因序列的上游

优选地，所述待表达基因为具有改善水稻种子性状功能的基因。

另一方面，本发明提供一种宿主菌或转化子，其特征在于，所述宿主菌或转化子包含所述的水稻种子特异表达启动子OsSee1、所述的重组表达载体、或所述的表达盒。

另一方面，本发明提供一种所述水稻种子特异表达启动子OsSee1在培育转基因植物中的应用，其特征在于，所述应用包括：将所述的水稻种子特异表达启动子OsSee1连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到水稻细胞、组织或器官中进行培育，优选地，所述待表达基因为具有改善水稻种子性状功能的基因。

在一种实现方式中，在所述重组表达载体中，所述水稻种子特异表达启动子OsSee1连接于待表达的基因序列的上游；所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-OsSee1，该重组表达载体为将SEQ ID No:1所示的序列即OsSee1或启动子OsSee1构建于pCAMBIA1391中得到的重组表达载体，本文中称为pCAMBIA1391-OsSee1。

另一方面，本发明提供一种所述水稻种子特异表达启动子OsSee1在培育高产水稻中的应用，其特征在于，所述应用包括：将所述的水稻种子特异表达启动子OsSee1与目标基因相连，并构建于载体中获得重组表达载体，然后，将所述重组表达载体转化到水稻细胞、组织或器官中进行培育。

本发明中所提供的启动子的DNA序列为(与序列表中SEQ ID No:1中相同)：

AGCCCAATTTCAAGACTTACCGATCATTTGTGCAGGAGGGTGTGAAACATGGGATCTCTTGCTTGTCTCAAGACTCGTATGGTGCCTATATTGCTGCGTCATGCATGGATAACAGGTATAACCGCAATCAACCACACTGCCTCAGACTTAATATGCCATTTGTGAAGGCTGCCTTTGACTTTATAAGCCTTTCAGGATCTATTTGTACAGTGCTCTTCATATGGATAAAGGCCCAATTAAGGCTTACACTGGCAGCAAAATTGAATCTTTTTTTGTCAAGGTCAGTGAGTGAACAAGCTGAGTTGATTTCCATTTTTCAAACCGCATGCCTGCTTGTTCTTAGGTAGTTTTATCTGCTATGTTTTATAACACCTGATATGTTGGTCAAATGCAGTCTGCTATCAGCCCTGATGGAACTCACATTCTTGGTGGTTCGAGTGATGGCAACGTGTACTTATGGCAGGTAGTTGTTGGATCATGTTATCATTTCGCACACGCATTAGCTGCTCTTTTACTTTCTATTCATGCCACTACTTTTTCACTGACATAGGTGGATCAGCCTGAAAGAGGTCCTATAATTTTGGAAGGCCATGAAGGTGAAGCTACTTCAGTTGACTGGTATGTTCTACATACAATTGTAGTTTTTTTTTGTGTAAATCTTATCAACCATCCAATGTTCAGATTTCAGTACGATTTTTTCACAATTTTCAGGTGTGCATCAGAGGTCGGGAAGATCGCAACGTCATCTGACGATTCCAAGGTGAGTATGTGATTAACCTTGCAAATTTTGTTCATTCAACTTTCATGAATCTTATGAGAATGAGATCCTTTTCTTTTTCTATTACACACCTACATGTTGCAAGCGAATTTAAATGCCTGTTTTGGTATGTAGAAAGGGGAGCTGCTGATATTCAGTATTTTTTTTAAGAAAACCACTGATAACAACACTTTATGATGTGTATCTATCAGGTTCGCGTATGGAATACTGAGAGAAGGGTGTTCCCAAACACAAGTTCCCCAACGGTCATCCGCAAGAGAATAACCGCACCAAACACTGGAAGCCGGTCTGCTAGCCATGAGCTAGCTACTACCTCAAGAGATGTAGGAGTAGCAGCCTGCACCAGTGCAGATGGTGAATTGCCAACTGGTTCACGCTCTCCCCTTCAGCCCAGAGTACTGGAGTTTGGCACACCGGAGTCAGCGAAGAAGAGAGCCTTTAGGTTGTTTCAGGAGGACTCATTGGACATAAGGAAAAGCCCAGAGGCTCAAATGAACAGCCCTTCTTCGGTTCTAAGCCCCCCACATTCACTGAAGAGGAGAACAATTCGGGACTACTTTGCTAGTAGCTCATCTTGTGAGCACACCAAGCATGTCCATGACCTTGCACTCTTGGCTCACTCGTCAACTGTGAAGAACCTCAAAAATGCTCAATATAGCTACAGGTGCCTGAAAAAATAACTTTAAAGTTTTGAACATCGATTTCACTAAACAACAATTATTATCTCCCTCTGAAATGTTGCTACCTAAGATGATAGTTTAGAACTCTAGAATCATTGTCGGCGGAGAAAGTAAATTATTTTCCCCAAATTTCCAGCTATGAAAAAACCCTCACCAAACACCATCAAACAAGAGTTCACCAAACCGCCCATGCGGCCATGCTGTCACGCAACGCACCGCATTGCCTGATGGCCGCTCGATGCATGCATGCTTCCCCGTGCACATATCCGACAGACGCGCCGTGTCAGCGAGCTCCTCGACCGACCTGTGTAGCCCATGCAAGCATCCACCCCCTCCACGTACACCCCCTCCTCCTCCCTACGTGTCACCGCTCTCTCCACCTATATATGCCCACCTGGCCCCTCTCCTCCCATCTCCACTTCACCCGATCGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCGTTGCATT

需要说明的是：上述启动子的DNA序列中，序列开头以斜体并加粗表示的序列“AATCACTACGCAATATGTTTGT”为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列，共计22bp；序列末尾以斜体并加粗表示的序列“CATCTTGCTAGCTAGCTTAGCA”为获得启动子过程中使用的反向引物的留存序列(该留存序列与反向引物的相应序列互补)，共计22bp；该DNA序列中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。需要说明的是，即便本领域技术人员在本发明的基础上，采用其他引物获得了类似序列，其也落入本发明的保护范围之内。

综上所述，本发明的发明人发现、提取并鉴定了日本晴水稻(Oryza sativa Lcv.Nipponbare)OsSee1基因上游包括转录起始位点在内的1960bp的DNA序列，并将其命名为启动子OsSee1。将该序列经酶切后连接到植物双元表达载体pCAMBIA1391上，获得相应的重组质粒(即重组表达载体)，利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行Gus表达定量检测发现，转基因植株的种子部位Gus基因表达水平提高，从而证明该1960bp的序列具有驱动基因在种子部位特异性表达的活性。

本发明所述的水稻种子特异表达启动子OsSee1可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因连接，构建重组植物表达载体，经转化后，在水稻的种子部位特异性的驱动靶标基因的表达，增加转基因的效果，改良水稻的特性。

技术效果

本发明所克隆的水稻启动子OsSee1能够调控基因在水稻种子中特异性集中表达，在实际应用中具有显著价值。通过该启动子对农作物品种进行基因改造，如通过该启动子驱动目标基因在植株中表达，可以提高和改善水稻的种子发育特性，从而培育出理想的转基因植物品种，比如，提高种子的发育速度，降低种子中的直链淀粉含量，增加支链淀粉及蛋白质含量，改善水稻的口感。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为将OsSee1启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中图1中A为pCAMBIA1391示意图，图1中B为pCAMBIA1391-OsSee1示意图，其中示出了利用OsSee1启动子驱动位于其下游的Gus基因表达；

图2为对本发明启动子进行酶切验证的结果示意图；

图3为成熟植株(90天)的根(a)、茎(b)、叶(c)、鞘(d)及成熟种子的纵截面(e)和横截面(f)。代表报告基因Gus活性的蓝色仅出现于成熟种子的胚和胚乳细胞中，其中胚细胞中的强度略高于胚乳细胞。这些数据表明OsSee1启动子仅在水稻种子中表达，且在胚中表达强度略高于胚乳(标尺＝2.5mm)。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

含有酶切位点的OsSee1启动子的获得

步骤1、引物的设计

根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因组序列，依据水稻OsSee1基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。

本实验例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1391(来自于CAMBIA，公开使用载体，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)为例，靶标基因为Gus基因，具体设计的引物为：正向引物(SEQ ID No:2)5’端带SalI，酶切位点(GTCGAC)，反向引物(SEQ ID No:3)5’端带EcoRI，酶切位点(GAATTC)，引物序列如下：

正向引物：GTCGACAATCACTACGCAATATGTTTGT SalI

反向引物：GAATTCTGCTAAGCTAGCTAGCAAGATG EcoRI

由深圳华大基因公司合成。

步骤2、启动子OsSee1的获得

以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子OsSee1，按常规PCR体系，采用如下扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，循环35次；最后72℃延伸10min。

回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度1960bp，将其连接到PGEM-T-Easy载体(购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合)上，按照冷激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞，然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆菌液提质粒，用SalI和EcoRI进行酶切验证，如图2所示。将经过鉴定的阳性克隆送并Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的启动子OsSee1，其核酸序列如SEQ ID No:1所示。

植物表达载体的构建和农杆菌的转化

从上面“启动子OsSee1的获得”过程中获得的阳性克隆中提取质粒，用SalI和EcoRI酶切，回收启动子OsSee1片段。同时利用SalI和EcoRI对pCAMBIA1391进行线性化处理、回收pCAMBIA1391，将上述的OsSee1片段和pCAMBIA1391片段用T4连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，得到启动子OsSee1与Gus基因融合的植物表达载体pCAMBIA1391-OsSee1，利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)。

利用启动子OsSee1驱动Gus报告基因在水稻中表达

步骤1：农杆菌介导的水稻遗传转化

成熟种子去掉颖壳后，用70％酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％)溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀沿种子的糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11天后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌的转化。

采用上述“植物表达载体的构建和农杆菌的转化”过程中转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，获得OsSee1::Gus转基因水稻植株，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan(Yongbo Duan,Chenguang Zhai,etal.An efficient and high-throughput protocol for Agrobacterium mediatedtransformation based on phOsphomannOse isomerase pOsitive selection inJaponica rice(Oryza sativa L.)[J].Plant Cell Report,2012.DOI10.1007/s00299-01201275-3.)等提出的方法。

步骤2、转基因水稻苗的组织器官染色

将转化OsSee1启动子的转基因水稻的组织器官，即根、茎、叶、花器官分别进行Gus染色：将各组织分别浸于Gus染色液中，37℃，过夜24小时，75％乙醇脱色，将组织中的叶绿素脱掉。然后在解剖显微镜下观察并记录Gus染色的结果。结果如图3所示，Gus基因在转基因水稻成熟的种子的胚和胚乳部位显现出可明显观测到蓝色，其中，胚细胞中的强度略高于胚乳细胞。另外，在其它各器官(根、茎、叶片和叶鞘)中，均没有检测到Gus基因的表达。这表明，本发明的启动子能够在转基因植株的种子中指导其下游的Gus蛋白表达，这种表达具有种子组织表达特异性。

本领域技术人员应该理解，将待表达基因换成其他基因之后，表达效果是一样的，这是可以预期的。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

虽然上面结合本发明的优选实施例对本发明的原理进行了详细的描述，本领域技术人员应该理解，上述实施例仅仅是对本发明的示意性实现方式的解释，并非对本发明包含范围的限定。实施例中的细节并不构成对本发明范围的限制，在不背离本发明的精神和范围的情况下，任何基于本发明技术方案的等效变换、简单替换等显而易见的改变，均落在本发明保护范围之内。

Claims (1)

1.一种培育高产水稻中的方法，其特征在于，所述方法包括序列表中SEQ ID No：1所示的DNA序列与目标基因相连，并构建于载体中获得重组表达载体，然后，

将成熟种子去掉颖壳后，用70％酒精浸泡种子1min，倒掉酒精； 用含有1滴Tween20的50％次氯酸钠溶液浸泡种子40min；倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道；无菌水浸泡种子过夜；用解剖刀沿种子的糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上；30℃下暗培养11天后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌的转化；将所述重组表达载体转化到根癌农杆菌，采用上述转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，将所述重组表达载体转入水稻细胞、组织或器官中进行培育，所述目标基因为促进种子发育速度的基因。