CN105695466B - 一种水稻花粉强特异表达启动子OsPoll3及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种水稻花粉强特异表达启动子OsPoll3及其应用。本发明的启动子包含序列表中SEQ ID NO.1或2中所示的核苷酸序列，或者二者的衍生物。本发明还提供了含有该启动子的表达盒、作物表达载体。本发明的发明人发现、提取并鉴定了日本晴水稻中的一段具有转录调控活性的DNA序列，并对其进行了实验性应用。具体而言，本发明将上述启动子应用在作物基因工程中。本发明提供的启动子能够驱动目标基因在花粉中特异表达，从而创造雄性不育材料，应用于杂交制种；或者进行基因剔除，防止外源基因通过花粉污染其他非转基因(作物)植物，提高转基因作物的生物安全性。

Description

一种水稻花粉强特异表达启动子OsPoll3及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术和作物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种水稻花粉强特异表达启动子及其应用，该启动子能够在作物基因工程中驱动目标基因在花粉中特异表达，从而创造雄性不育材料，或者进行基因剔除，防止外源基因通过花粉污染其他非转基因(作物)植物，提高转基因作物的生物安全性。

背景技术

水稻是我国乃至全世界最主要的食品来源之一，我国目前有一半以上的人口以稻米为主食，人均摄入热量的30％、蛋白质的19％均来源于稻米。随着人民生活水平的提高，稻米在粮食作物中的比重将持续增长。水稻在保障我国粮食安全中担当重要角色，杂交育种对于提高水稻产量非常重要。水稻杂交育种常用三系法及两系法，这些方法利用的是花粉特异性发育性状。

目前水稻三系法制种主要利用核—质互作雄性不育系、保持系和恢复系实现三系配套实现杂交育种，这种方法不仅种子生产程序比较复杂，选育新组合的周期长，制种成本高，而且种质资源利用有限，在一定程度上限制了杂交水稻产量的进一步提高。而现在广泛使用的两系法制种体系即光温敏不育系实现了一系两用，简化了繁殖不育系的技术环节。但光温敏核不育系容易受光周期和温度变化的影响，育性不稳定，影响制种纯度，具有一定的制种风险，特别是当前全球气候异常影响了水稻光温敏不育系的推广和利用。因此，培育不受环境影响且可以自主繁殖的稳定不育系已成为两系杂交技术广泛应用的技术瓶颈。

水稻中广泛存在的核雄性不育材料，不育性遗传性状稳定，受外界环境条件影响小，在杂交育种和农业生产上都具有十分重要的意义。花粉特异启动子被广泛用于创造核雄性不育植物。而具有强特异性的启动子往往是可遇而不可求的，目前还没有任何一种方式能够根据需求来构建或直接筛选出相应启动子序列。目前发现的花粉特异启动子有烟草花特异启动子TA29，番茄花粉特异启动子lat52，水稻花粉特异RA8gene启动子、玉米ZmC5基因启动子、ZM13启动子等等，花粉特异启动子-barnase(RNase)载体已经用来转化烟草、油菜、水稻、玉米等，通过基因工程获得雄性不育系。

但是，仅仅上面几种可用的花粉启动子在生产和研究过程中是远远不够的。因此，本发明希望能够再找到一种在花粉中具有强特异性表达性状的启动子。

发明内容

本发明的目的是提供一种驱动外源基因在水稻花粉强特异表达的启动子、获得含有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。其中，本文中所涉及的“作物”是指禾本科作物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种水稻花粉特异表达启动子，所述水稻花粉特异表达启动子包含：

(a)序列表中SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列；或者

(b)序列表中SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列；或者

(c)在序列表中SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列中添加、取代或缺失一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者

(d)在序列表中SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列中添加、取代或缺失一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者

(e)与序列表中SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；或者

(f)与序列表中SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；或者

(g)与序列表中SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列具有至少90％同源性的核苷酸序列；或者

(h)与序列表中SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列具有至少90％同源性的核苷酸序列。

本领域技术人员可以预期，上述(c)-(h)中的水稻花粉强特异表达启动子序列与序列表中SEQ ID No:1或2所示序列具有相同功能，即驱动目标基因在作物花粉中特异表达功能的序列，因此，其也包含在本发明的范围内。序列表中SEQ ID No:1或2所示的DNA序列为来源于日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)的序列，本文中称为OsPoll3或启动子OsPoll3。具体而言，本申请的发明人从日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)中分离克隆得到了序列表中SEQ ID No:1和2中所示的DNA序列，并且发现该DNA序列具有驱动目标基因在水稻花粉强特异表达的作用。

需要说明的是，在序列表中，SEQ ID No:1中所示的DNA序列与SEQ ID No:2所示的启动子的区别主要在于SEQ ID No:1中所示的DNA序列在开头部分多了“ctgatgtggtctaaccccga gt”共计22bp，在结尾部分多了“gtgaagac cctgacgggg aaga”共计22bp，这两部分为获得启动子过程中使用的引物的留存序列或其互补序列。而SEQ ID No:2所示的DNA序列为纯获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指SEQ ID No:1，也可以指SEQ ID No:2，二者可以发挥相同的作用。即便本领域技术人员在本发明的基础上，采用其他引物获得了类似序列，其也落入本发明的保护范围之内。

优选地，本发明提供的水稻花粉强特异表达启动子的DNA序列由序列表中SEQ IDNo:1或2所示的序列，即OsPoll3或启动子OsPoll3构成。

另一方面，本发明还提供一种包含上述水稻花粉强特异表达启动子的表达盒。

又一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述的水稻花粉强特异表达启动子，在所述重组表达载体中，所述水稻花粉强特异表达启动子连接于待表达的基因序列的上游；优选地，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-OsPoll3，该重组表达载体为将SEQ ID No:1所示的序列即OsPoll3或启动子OsPoll3构建于pCAMBIA1391中得到的重组表达载体，本文中称为pCAMBIA1391-OsPoll3。

或者待表达基因可以为任何对作物的花粉性状具有改善能力的基因。通过本发明的启动子驱动该基因在花粉中强特异性地集中表达，从而实现改善水稻花粉相应性状的功能。

再一方面，本发明提供上述水稻花粉强特异表达启动子在培育转基因作物中的应用。所述应用包括将本发明提供的上述水稻花粉特异表达启动子连接于载体的待表达的基因序列上游(例如，将所述启动子序列置于/插入目标基因之前)，从而构建重组表达载体，将所述重组表达载体转化到作物细胞、组织或器官中进行培育。

并且优选地，所述应用可以用于改良作物生长特性，所述作物为禾本科作物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。

更优选地，所述应用包括：

利用序列表SEQ ID No.3和4中的引物，以水稻品种日本晴DNA为模板，扩增所述的水稻花粉强特异表达启动子OsPoll3；

回收目的片段，将其连接到预定载体上，按照热激法转化大肠杆菌感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞中，然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用SalI和EcoRI进行双酶切验证，验证正确的克隆即为所要获得的水稻花粉强特异表达启动子OsPoll3；

从上面获得的阳性克隆中提取质粒，用SalI和EcoRI双酶切，回收水稻花粉强特异表达启动子OsPoll3片段；

对含有目标基因的载体进行线性化处理、回收载体，将上述的水稻花粉强特异表达启动子OsPoll3片段和载体片段用T4连接酶进行连接，得到水稻花粉强特异表达启动子OsPoll3与目标基因融合的作物表达载体，利用冻融法将作物表达载体转入根癌农杆菌；

利用农杆菌介导方法，对水稻种子，采用上面所获得的转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，获得相应水稻植株。

综上所述，本发明的发明人发现、提取并鉴定了日本晴水稻(Oryza sativa Lcv.Nipponbare)中的一段具有转录调控活性的DNA序列，并将其命名为OsPoll3(序列表中的SEQ ID No:1或2)。具体而言，发明人发现该序列具有驱动基因在花粉中强特异性表达的能力，提取出该序列并对上述能力进行了鉴定。发明人将该序列经酶切后连接到作物双元表达载体pCAMBIA1391上，获得相应的重组质粒(即重组表达载体)，利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行组织化学检测发现，GUS仅着色于转基因植株花粉粒中，并不着色与根、茎、叶、颖壳和花丝、花药壁等其他位置，从而证明该序列具有驱动基因特异的在花粉细胞内强表达的活性。

本发明所述的启动子序列可与作物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因连接，构建重组作物表达载体，经转化后，可在花粉特异的驱动靶标基因在表达。

技术效果

本发明所克隆的水稻启动子OsPoll3能够调控基因在植株中花粉部位集中表达，在实际应用中具有重要价值。通过水稻花粉强特异表达启动子OsPoll3驱动目标基因在花粉中特异表达，从而创造雄性不育材料，或者进行基因剔除，防止外源基因通过花粉污染其他非转基因(作物)植物，提高转基因作物的生物安全性。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为将OsPoll3启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中图1中A为pCAMBIA1391示意图，B为pCAMBIA1391-OsPoll3示意图，其中示出了利用OsPoll3启动子驱动位于其下游的GUS基因表达；

图2为对本发明的启动子进行酶切验证的结果示意图。

图3为10周龄OsPoll3-GUS转基因植物各组织GUS染色图。(A)根；(B)茎；(C)成熟叶片；(D)小花；(E)雄蕊；(F)花药。标尺为1mm。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的生化试剂，载体耗材等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

含有酶切位点的OsPoll3启动子的获得

步骤1、引物的设计

根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因组序列，依据水稻OsPoll3基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。

本实施例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1391(图1中A部分，来自于CAMBIA，公开使用载体，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)为例，靶标基因为Gus基因，具体设计的引物为：正向引物(SEQ ID No:3)5’端带SalI，酶切位点(GTCGAC)，反向引物(SEQ ID No:4)5’端带EcoRI，酶切位点(GAATTC)，引物序列如下：

正向引物：GTCGACCTGATGTGGTCTAACCCCGAGT SalI

反向引物：GAATTCTCTTCCCCGTCAGGGTCTTCAC EcoRI

由深圳华大基因公司合成。

步骤2、启动子OsPoll3的获得

以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子OsPoll3，按常规PCR体系，采用如下扩增程序：

95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，35个循环；最后72℃延伸10min。

回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度1884bp，将其连接到PGEM-T-Easy载体(购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合)上，按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞中，然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用SalI和EcoRI进行双酶切验证，如图2所示。将经过鉴定的阳性克隆送交Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的启动子OsPoll3，其核酸序列如SEQ ID No:1所示。

作物表达载体的构建和农杆菌的转化

从上面“启动子OsPoll3的获得”过程中获得的阳性克隆中提取质粒，用SalI和EcoRI双酶切，回收启动子OsPoll3片段。同时利用SalI和EcoRI对pCAMBIA1391进行线性化处理、回收pCAMBIA1391，将上述的OsPoll3片段和pCAMBIA1391片段用T4连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，得到启动子OsPoll3与Gus基因融合的作物表达载体pCAMBIA1391-OsPoll3(图1B)，利用冻融法将作物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)。

利用启动子OsPoll3驱动Gus报告基因在水稻中表达

步骤1：农杆菌介导的水稻遗传转化

成熟种子去掉颖壳后，用70％酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween 20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％)溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀沿种子的糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11天后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌转化。

采用上述“作物表达载体的构建和农杆菌的转化”过程中转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan(Yongbo Duan，Chenguang Zhai，et al.An efficient and high-throughput protocol for Agrobacterium mediated transformation based onphosphomannose isomerase positive selection in Japonica rice(Oryza sativa L.)[J].Plant Cell Report，2012.DOI 10.1007/s00299-012-1275-3.)等提出的方法。

步骤2、GUS组织化学染色

参照Jefferson(Jefferson RA等人.GUS fusion：β-Glucuronidase as asensitive and versatile gene fusion marker in higher plant[J].EMBO J.，1987，6:3901-3907)等提出的方法，将需要染色的组织抽真空，然后浸入染色液中，37℃染色。脱色时在37℃条件下用75％乙醇处理，至组织中无叶绿素脱出。结果见图3(需要说明的是，鉴于专利文本中不接受彩色图片，因此，本申请的发明人将彩色的图3修改为灰度图像，但是，即便这样，基于图3中的颜色深浅度，也可以清晰地分辨出各部位是否发生染色)，各组织与GUS染液中染色1h后，仅有花药中有代表GUS活性的蓝色出现，组织放大后表明GUS仅着色于花粉粒中，并不着色与根、茎、叶、颖壳和花丝、花药壁等其他位置。实验表明OsPoll3启动子特异的在花粉细胞内具有强表达活性。

实施例2

为了验证本发明的序列表SEQ ID No.2中的序列同样具有启动子功能，本发明对该序列利用其他引物也进行了类似于上面实施例1的实验，即：以水稻品种日本晴DNA为模板，利用新的正向引物、反向引物进行启动子扩增；回收PCR扩增的目的片段，连接到PGEM-T-Easy载体，转入到激活的感受态细胞；然后，将其和pCAMBIA1391片段用T4连接酶进行连接获得相应作物表达载体，利用冻融法将作物表达载体转入根癌农杆菌；对成熟水稻种子进行农杆菌介导的水稻遗传转化，培育再生植株培养；最后进行染色验证。

经实验验证，序列表SEQ ID No.2中的序列也具有驱动Gus基因在花粉中强表达的作用。由于实验方法和结果与实施例1类似，这里不再详述。

本发明的花粉特异启动子可以用于进行基因剔除，防止外源基因通过花粉污染其他非转基因(作物)植物，提高转基因作物的生物安全性。因此，为创造核雄性不育材料提供了可用的遗传资源。

虽然本发明以水稻为例进行描述，但是申请人认为，本发明所获得启动子的应用场景不限于水稻，本发明启动子可以用于各种禾本科作物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高梁或燕麦，优选为水稻。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (8)

1.一种水稻花粉强特异表达启动子OsPoll3，其特征在于，所述水稻花粉强特异表达启动子OsPoll3由：

(a)序列表中SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列；或者

(b)序列表中SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列构成，

SEQ ID No:1中所述的核苷酸序列为：

SEQ ID No:2中所述的核苷酸序列为：

2.根据权利要求1所述的水稻花粉强特异表达启动子OsPoll3，其特征是，所述水稻花粉强特异表达启动子OsPoll3分离自日本晴水稻的成熟种子，分离所采用的扩增引物包括第一引物和第二引物，所述第一引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，所述第二引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示。

3.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含权利要求1所述的水稻花粉强特异表达启动子OsPoll3。

4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求1所述的水稻花粉强特异表达启动子，在所述重组表达载体中，所述水稻花粉强特异表达启动子OsPoll3连接于载体中待表达的基因序列的上游。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-OsPoll3，其中pCAMBIA1391为作物双元表达载体；或者所述待表达基因是具有改善花粉性状功能的基因。

6.一种根据权利要求1所述的水稻花粉强特异表达启动子OsPoll3在培育转基因水稻中的应用，其特征在于，所述应用包括：将权利要求1所述的水稻花粉强特异表达启动子连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到水稻细胞、组织或器官中进行培育。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用用于改良作物生长育性，所述作物为水稻。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用包括：

利用序列表SEQ ID No.3和4中的引物，以水稻品种日本晴DNA为模板，扩增权利要求1所述的水稻花粉强特异表达启动子OsPoll3；

回收目的片段，将其连接到预定载体上，按照热激法转化大肠杆菌感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞中，然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用SalI和EcoRI进行双酶切验证，验证正确的克隆即为所要获得的水稻花粉强特异表达启动子OsPoll3；

从上面获得的阳性克隆中提取质粒，用SalI和EcoRI双酶切，回收水稻花粉强特异表达启动子OsPoll3片段；

对含有目标基因的载体进行线性化处理、回收载体，将上述的水稻花粉强特异表达启动子OsPoll3片段和载体片段用T4连接酶进行连接，得到水稻花粉强特异表达启动子OsPoll3与目标基因融合的作物表达载体，利用冻融法将作物表达载体转入根癌农杆菌；

利用农杆菌介导方法，对水稻种子，采用上面所获得的转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，获得相应水稻植株。