CN105567694B - 一种强表达活性的水稻非种子表达启动子safes4及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种强表达活性的水稻非种子表达启动子SAFES4及其应用。本发明还提供了含有该启动子的表达盒和作物表达载体。具体而言，本发明所提供的启动子SAFE S4能够调控外源基因在植株中集中表达，却在胚和胚乳中无表达。通过该启动子对农作物品种进行基因改造，可以提高和改善水稻的整体生长特性和机制，而不会带来食用部分的外源基因表达，从而可以在培育出实用有效的转基因植物品种的同时，降低对人类食用部分的影响，降低乃至消除人们对转基因食品的疑虑。本发明提供的启动子可以特异地驱动外源基因在根/花/绿色组织/非种子组织中表达，有效地弥补了绿色组织特异表达启动子往往不能兼顾根部表达的需求，在抗生物逆境的性状改良中极具竞争力。

Description

一种强表达活性的水稻非种子表达启动子SAFES4及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术和作物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种强表达活性的水稻非种子表达启动子及其应用，该启动子能够驱动目标基因在根、花、绿色组织等非种子部位中特异表达，从而可在不影响种子的食用安全和繁殖活性情况下达到改良水稻生产性能的目的。
背景技术
转基因就是以人为的方法改变物种的基因排列，通常涉及将某种生物的某个基因从一连串的基因中分离，再植入另一种生物体内。水稻是世界上最重要的粮食作物之一。对其遗传特性、遗传转化以及育种利用等方面，科学家都进行了深入、细致的研究，也在世界范围内建立起了水稻遗传转化的技术平台，可将优良目标外源基因导入特定的细胞而获得转基因水稻植株，此后，许多目标基因都相继成功地导入到水稻的不同组织中。
与此同时，我们需要看到的是，转基因水稻的商品化目前依然困难重重。其中一个最主要的原因就是作为主食作物，人们对转基因水稻的安全性存在较大顾虑，人们对此的关注程度也日益提高。水稻转基因带来的安全性问题主要体现在生态环境安全和食品安全两大方面。具体而言，在生态环境安全方面，转基因水稻对环境所带来的问题主要是对栽培稻、野生稻以及稻田杂草等非靶标生物可能带来的潜在危险，比如，作物的生存竞争性、目标基因的转移、抗药性的增强以及对非靶标生物的危害，进而破坏生态平衡。在食品安全方面，由于稻米是我国乃至全世界最主要的食品来源之一，我国目前有一半以上的人口以稻米为主食，人均摄入热量的30％、蛋白质的19％均来源于稻米。随着人民生活水平的提高，稻米在粮食作物中的比重将持续增长。经过转基因工程技术处理后的水稻及其加工产品是否使人产生过敏反应、长期食用是否会患癌症等致命性疾病，这都是需要关心的食品安全问题。
水稻作为主要的粮食之一，种子是食用部位和繁殖器官。在转基因水稻中尤以外源蛋白在胚乳中的积累及其可能造成的食用安全风险，成为制约商业化进程的重要因素。利用组织特异性启动子，驱动基因表达产物在特定器官或组织中积累，限定了目的基因的作用范围，避免了非必要组织中范式表达造成的物质能量浪费，降低或者避免在食用部位积累的安全风险。研究非种子表达启动子在转基因水稻产业化的进程中最大限度地降低或者避免其带来的风险。
发明内容
本发明的目的是提供一种驱动外源基因特异的在水稻根/花/绿色组织/非种子特异表达的启动子、获得含有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。
为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种强表达活性的水稻非种子表达启动子SAFES4，其特征在于，所述强表达活性的水稻非种子表达启动子SAFES4包含：
(a)SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列；或者
(b)在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者
(c)在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者
(d)SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者
(e)与SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列具有至少90％同源性的核苷酸序列。
优选地，所述强表达活性的水稻非种子表达启动子SAFES4由SEQ ID No:1所示的DNA序列构成。
另一方面，本发明提供一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含权利要求1所述的强表达活性的水稻非种子表达启动子SAFES4。
另一方面，本发明提供一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含上述的强表达活性的水稻非种子表达启动子，在所述重组表达载体中，所述强表达活性的水稻非种子表达启动子连接SAFES4于载体中待表达的基因序列的上游。
优选地，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-SAFES4，其中pCAMBIA1391为作物双元表达载体。
优选地，所述待表达基因是具有改善非种子性状功能的基因。
另一方面，本发明提供一种根据上述的强表达活性的水稻非种子表达启动子SAFES4在培育转基因水稻中的应用，其特征在于，所述应用包括：将所述的强表达活性的水稻非种子表达启动子连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到水稻细胞、组织或器官中进行培育。
优选地，所述应用包括：
利用序列表SEQ ID No.2和3中的引物，以水稻品种日本晴DNA为模板，扩增权利要求1所述的水稻非胚乳表达启动子SAFES4；
回收目的片段，将其连接到PGEM-T-Easy载体上，按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞中，然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用引物进行双酶切验证，验证正确的克隆即为所要获得的启动子SAFES4；
从上面获得的阳性克隆中提取质粒，用引物双酶切，回收启动子SAFES4片段；
并利用SEQ ID No.2和3中所示引物对含有目标基因的载体进行线性化处理、回收载体，将上述的SAFES4片段和载体片段用T4连接酶进行连接，得到启动子SAFES4与目标基因融合的作物表达载体，利用冻融法将作物表达载体转入根癌农杆菌；
利用农杆菌介导方法，对水稻种子，采用上面所获得的转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，获得相应水稻植株。
序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列为来源于日本晴水稻(Oryza sativa Lcv.Nipponbare)的序列，本文中称为SAFES4或启动子SAFES4。具体而言，本申请的发明人发现日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)中一段具有转录活性的2022bp DNA序列具有驱动目标基因在作物非种子组织特异表达的作用。并且分离克隆得到了序列表中SEQID No:1所示的DNA序列。
需要说明的是，在所述重组表达载体中，该重组表达载体为将SEQ ID No:1所示的序列即SAFES4或启动子SAFES4构建于pCAMBIA1391中得到的重组表达载体，本文中称为pCAMBIA1391-SAFES4。
如上面所提到的，待表达基因可以为任何对作物的非种子性状具有改善能力的基因。通过本发明的启动子驱动该基因在非种子组织中特异性地集中表达，从而实现改善作物非种子组织相应性状及降低食用安全风险。
本发明中所提供的启动子的DNA序列为(与序列表中SEQ ID No：1中相同)：
AGAGTGGAGAGAATTTGAACCGGTCAATCATAGACATTATTTCTACTCTTGCACTATATATTATTATTGCGAAGCTTAAATTGAGACATGGCGCATACTTATAGTGAATGCACAGTTTCTTTTTATTTGCTAAGCTTCCATATTGGCTGGACATTTTTAATAAGTAATCCAAATGAAATCATTAGCTTGTAACAATCATGCCCTGTGCGGCTAATGAATTATCCAAAATGATATGTTTCTGTACTTTTCCAGGTTCTATATATGACCCCATGTTTCCTAGATTTAGAATTGCCAGATTCTGTTGAATCAGAATTAAAATTTTTAGCTTATAGCAAGCATTTTCCATATGCTAATAACTTTCTTCCAATGAGATGTTTGGATCCTCTCCAACTATTATATATAATCACTTATTTTACTTTGTACAACAGACCATAAATGGCGATATATACTTGATGGAAGATATGACAGTGCTCCCTGACATTGTGTTCTTGAACTTAATTTTCTTTTCAAGTGGATATTGTATTGGTCCTAGCTTATTCCATGTTCTCAGGATGACCACTGGTGTCAGAAGGTTGAAGCTAGAATTACATAATCATTATAAACGAGAGGTAAAAGCTGAAACTATACTTGGTTTGTTTATCTGATGCAGAGTTACTAAGGAAGTTACGAGAAGCAATTTGTATTTACATTTCCTGTCACACTAGGCTTGATTTGCTATTTTGCTACTTGCCCTACTCTATATAGTGGTTTGATACTGATATATGTAGTAAATGTGTGACATATGCATCTCCTATCGGCAATACTTTGGGGCAACACAACAAGGATTTAGAAGATGATACTAACTGGCTATGCGTTATTGATATTAGAATACTTAGGACGTGCGTAAATTTATACTCCGTTTTCACAGAACTTTCTCATAGGACAGAGGTTGGCTTCAAACTAGTACCCAAGTTGTTATTCTTTTGCAGACTTTTTTATGCTGGTTTATCTCGAGTTGTTCAGGCAGCCTGACAGCTTGAGGCAAGCTTAATGTTGCTACACTAATATACCGCTCTTTTCAGTTTTGTGGATCGGATTGTGTTTGTGATCTTCCACCAAACTGGACATCCGAGGAACTTGTGTTGAACTCCCTTCGTGAAGTGCAAATCACTAACCTGAGAGGAACTGAGAACGAATTTGCTGTTGTGGAGCGGCTATTCAGTTGGGCAGCAGTGCTGAAACAGATGACAATAAATTTCCATAACTCAATCACCGTGAGCACTGCAAGAGAGTTGTGCGAGATGTTACTGAGCTTCTCCAGGCCAGAGATAAGCATGAAATTTTACATTAACCAGGGATCACGTAAGGTTTTGTATGTTCCAGAAGACTAATGTGCCTCATCAGGCTTGCCAGTTGACTAGTGAAGTAGAACTCATTTTGCTTTCTTCCTTTCTCTGATGGATTGATGAAAGAATTCTGTGGACTTGGTTCTTTGATGGTGATGAAACACAACTTATCTGGGTTCCCAATCCTGGAATTGAATGGCAAGAATCAATCTCTTGGTTGGAAAAAAAAATGAAACGAATTTTTTTTTCATCTCATCGTTCTACATGTTGGGTAGGCTTAATGTGTGGCTCCAGCCTCCGGACAGGAAAACTCTTCTGATCTTTCTGCTCAGATATGCTACTGCTGCTAAGCTCAATCTGCATCACACTAGACTGTAGCTGAATGCTACCTGGATTTGTAAGCTAGCCTGGATTTGTATTTCAGCTTGGATTTGTATTTTTGGTCGGATTTATTTGGGCCGTCCATGCAGATATCTCGCAGCAGCAGCAGCATCTGCACGTTACTCACGTGGCATCTCCAACTCTACCGCCAAAATTTGTATTCTTTTTTTGAAAAAAAAATCGTTGGCTCCCGCGACCGCGACGCCTCGTCGCGGCCTTGGTGGTAGAGTACAAGAAGGAGCCAGGCTTCTCTTCTCCTCGAGCCAGCAGCAACACGCACGCACGCACCACACACGTAGCAGCAGAGCAATGGCGG
需要说明的是：上述启动子的DNA序列中，序列开头以斜体并加粗表示的序列“AGAGTGGAGAGAATTTGAACCG”为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列，共计22bp；序列末尾以斜体并加粗表示的序列“CGTAGCAGCAGAGCAATGGCGG”为获得启动子过程中使用的反向引物的留存序列(该留存序列与反向引物的相应序列互补)，共计22bp；该DNA序列中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。即便本领域技术人员在本发明的基础上，采用其他引物获得了类似序列，其也落入本发明的保护范围之内。
综上所述，本发明的发明人发现、提取并鉴定了日本晴水稻(Oryza sativa Lcv.Nipponbare)中一段具有转录调控活性的2022bp DNA序列，并将其命名为SAFES4(序列表中的SEQ ID No:1)。具体而言，发明人发现该序列具有驱动基因在非种子中特异性表达的能力，提取出该序列并对上述能力进行了鉴定。发明人将该序列经酶切后连接到作物双元表达载体pCAMBIA1391上，获得相应的重组质粒(即重组表达载体)，利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行组织化学检测发现，转基因植株在根、茎、鞘、叶有很强的蓝色出现，在种子中没有着色，从而证明该2022bp的序列具有驱动基因特异的在非种子组织中强表达的活性。
本发明所述的启动子序列可与作物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因连接，构建重组作物表达载体，经转化后，可在非种子组织特异的驱动靶标基因表达。
技术效果
本发明所克隆的水稻启动子SAFES4能够调控基因在植株中非种子部位集中表达，在实际应用中具有显著价值。通过该启动子对农作物的非种子组织性状进行基因改造，调控目标基因在根、花、绿色组织等非种子组织中表达，提高水稻的生产性能或抗逆性，降低种子的食用安全风险。有效地弥补了绿色组织特异表达启动子往往不能兼顾根部表达的需求，在抗生物逆境的性状改良中极具竞争力。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为将SAFES4启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中图1中A为pCAMBIA1391示意图，B为pCAMBIA1391-SAFES4示意图，其中示出了利用SAFES4启动子驱动位于其下游的Gus基因表达；
图2为对本发明的启动子进行酶切验证的结果示意图。
图3为利用SAFES4启动子驱动Gus基因表达的结果示意图，示出了水稻各部位Gus染色结果，其中示出了SAFES4：：gus转基因水稻植株，其中a表示根，b表示茎，c表示鞘，d表示叶，e表示种子纵切面；从图中可以看出，在根、茎、鞘、叶中有很深的蓝色出现，而在种子中没有着色。图中标尺＝1cm。
图4为利用SAFES4启动子驱动Gus基因表达的荧光定量PCR结果示意图。示出了Gus在叶、根、茎、鞘、花组织中均有很强的表达。在种子中无表达。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的生化试剂，载体耗材等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
含有酶切位点的SAFES4启动子的获得
步骤1、引物的设计
根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因组序列，依据水稻SAFES4基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。
本实施例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1391(图1中A部分，来自于CAMBIA，公开使用载体，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)为例，靶标基因为Gus基因，具体设计的引物为：正向引物(SEQ ID No:2)5’端带SalI，酶切位点(GTCGAC)，反向引物(SEQ ID No:3)5’端带XmaI，酶切位点(CCCGGG)，引物序列如下：
正向引物：GTCGACAGAGTGGAGAGAATTTGAACCG SalI
反向引物：CCCGGGCCGCCATTGCTCTGCTGCTACG XmaI
由深圳华大基因公司合成。
步骤2、启动子SAFES4的获得
以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子SAFES4，按常规PCR体系，采用如下扩增程序：
95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，循环35次；最后72℃延伸10min。
回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度2022bp，将其连接到PGEM-T-Easy载体(购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合)上，按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞中，然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用SalI和XmaI进行双酶切验证，如图2所示。将经过鉴定的阳性克隆送交Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的启动子SAFES4，其核酸序列如SEQ ID No:1所示。
作物表达载体的构建和农杆菌的转化
从上面“启动子SAFES4的获得”过程中获得的阳性克隆中提取质粒，用SalI和XmaI双酶切，回收启动子SAFES4片段。同时利用SalI和XmaI对pCAMBIA1391进行线性化处理、回收pCAMBIA1391，将上述的SAFES4片段和pCAMBIA1391片段用T4连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，得到启动子SAFES4与Gus基因融合的作物表达载体pCAMBIA1391-SAFES4(图1B)，利用冻融法将作物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)。
利用启动子SAFES4驱动Gus报告基因在水稻中表达
步骤1：农杆菌介导的水稻遗传转化
成熟种子去掉颖壳后，用70％酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween 20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％)溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀沿种子的糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11天后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌转化。
采用上述“作物表达载体的构建和农杆菌的转化”过程中转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan(Yongbo Duan，Chenguang Zhai，et al.An efficient and high-throughput protocol for Agrobacterium mediated transformation based onphosphomannose isomerase positive selection in Japonica rice(Oryza sativa L.)[J].Plant Cell Report，2012.DOI10.1007/s00299-012-1275-3.)等提出的方法。
共获得50株SAFES4-pCAMBIA1391植株(SAFES4：：Gus转基因水稻植株)。
步骤2、Gus组织化学染色
Gus染色：参照Jefferson(Jefferson RA等人.GUS fusion：β-Glucuronidase asa sensitive and versatile gene fusion marker in higher plant[J].EMBO J.，1987，6:3901-3907)等提出的方法，将需要染色的组织抽真空，然后浸入染色液中，37℃染色24小时。脱色时在37℃条件下用95％乙醇处理，至阴性对照材料呈白色，结果见图3，在根、茎、鞘、叶等非种子组织中有很深的蓝色出现。
步骤2、启动子活性定量检测
启动子活性定量：取SAFES4-pCAMBIA1391植株和作为对照的PActin-pCAMBIA1391植株(来自于美国康奈尔大学，由目前基因工程中常用的组成型启动子水稻PActin驱动Gus基因，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心保存)及POsrbcS-pCAMBIA1391(来自华中农业大学，由目前基因工程中常用的绿色组织特异型启动子水稻POsrbcS驱动Gus基因，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心保存)的植株的叶、根、茎、鞘、花、种子样本，使用天根生化科技有限公司的植物总RNA提取试剂盒提取样品总RNA，再使用天根生化科技有限公司的FastQuant RT试剂盒反转录为cDNA，以cDNA为模板，以ACTIN基因为内参，以天根生化科技有限公司的SuperReal PreMix Plus实时荧光定量PCR预混液为反应试剂，在ABI公司的PRISM 7500荧光PCR仪上，通过qRT-PCR反应检测SAFES4-pCAMBIA1391、PActin-pCAMBIA139和POsrbcS-pCAMBIA1391转基因植株中报告基因Gus的表达强度，反应相应启动子活性。其中，用于标定内参基因ACTIN的定量qRT-PCR引物为：
ACTIN上游引物：5'-CCTTCAACACCCCTGCTATG-3’，
ACTIN下游引物：5'-CAATGCCAGGGAACATAGTG-3’
用于检测Gus基因表达的qRT-PCR引物为：
Gus上游引物：5'-TACGGCAAAGTGTGGGTCAATAATCA-3’
Gus下游引物：5'-CAGGTGTTCGGCGTGGTGTAGAG-3’
结果显示，在叶、根、茎、鞘、花组织中，启动子SAFES4与对照PActin均能驱动Gus基因表达活性，且活性相当。POsrbcS驱动Gus基因在叶、茎、鞘等绿色组织表达，在根和种子中不表达。启动子SAFES4没有驱动Gus基因在种子表达。结果见图4。该结果说明启动子SAFES4是一种强表达活性的水稻非种子表达启动子。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (7)

1.一种强表达活性的水稻非种子表达启动子SAFES4，其特征在于，所述强表达活性的水稻非种子表达启动子SAFES4由SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列构成，
SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列为：
2.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含权利要求1所述的强表达活性的水稻非种子表达启动子SAFES4。
3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求1所述的强表达活性的水稻非种子表达启动子，在所述重组表达载体中，所述强表达活性的水稻非种子表达启动子连接SAFES4于载体中待表达的基因序列的上游。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-SAFES4，其中pCAMBIA1391为作物双元表达载体。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述待表达基因是具有改善非种子性状功能的基因。
6.一种根据权利要求1所述的强表达活性的水稻非种子表达启动子SAFES4在培育转基因水稻中的应用，其特征在于，所述应用包括：将权利要求1所述的强表达活性的水稻非种子表达启动子连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到水稻细胞、组织或器官中进行培育。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用包括：
利用序列表SEQ ID No.2和3中的引物，以水稻品种日本晴DNA为模板，扩增权利要求1所述的水稻非胚乳表达启动子SAFES4；
回收目的片段，将其连接到PGEM-T-Easy载体上，按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞中，然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用引物进行双酶切验证，验证正确的克隆即为所要获得的启动子SAFES4；
从上面获得的阳性克隆中提取质粒，用引物双酶切，回收启动子SAFES4片段；
并利用SEQ ID No.2和3中所示引物对含有目标基因的载体进行线性化处理、回收载体，将上述的SAFES3片段和载体片段用T4连接酶进行连接，得到启动子SAFES4与目标基因融合的作物表达载体，利用冻融法将作物表达载体转入根癌农杆菌；
利用农杆菌介导方法，对水稻种子，采用上面所获得的转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，获得相应水稻植株。
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