CN103740717B - 一种水稻胚特异性表达启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种植物胚特异性表达启动子及其应用。本发明的植物胚特异性表达启动子是通过发明人所设计的引物，以水稻基因组DNA为模板，利用PCR方法从水稻中分离得到。通过该启动子在水稻中的表达特异性实验表明本发明的启动子使β-葡糖苷酸酶(GUS)报告基因只在水稻种子胚中特异性表达。说明本发明的启动子可以启动外源基因在植物的胚中特异性的表达，适用于任何种子具有胚的植物，即单子叶植物或双子叶植物。

Description

一种水稻胚特异性表达启动子及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种植物基因表达启动子及其应用，该启动子能够在单子叶植物，尤其是水稻转基因调控体系中驱动目标基因在胚中表达。

背景技术

生物体的生长发育、生理过程都是生物体的众多基因有序的、并在外界环境因子的作用下特定表达的结果。基因正常而有规律的表达保证了植物的正常生长发育。近年来，分子生物学的研究表明转录水平上的调控是基因表达调控中的起始步骤，也是基因表达调控的重要方式之一。基因启动子控制着基因在特定的组织、特定的发育阶段以及一定的环境条件下表达。因而，分离、鉴定基因启动子，了解启动子的时空专一性表达特征及其作用机制已成为研究基因表达调控的主要内容。

组织特异性启动子也称器官特异性启动子，该类启动子所调控的下游基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达，并表现出发育调节的特性。目前，为了使外源基因在植物体内有利、高效地发挥作用，人们开始越来越多地研究组织特异性启动子、分析特异启动子中的顺势作用元件及作用机制，并根据需要选择或人工构建合适的启动子，实现对外源基因表达的定时、定点、定量三维精确调控。例如，组织特异性启动子在植物育种、植物生物反应器等研究的应用上已初见成效。获得有组织专一性表达特性的启动子也是寻找相关功能基因的一种有效途径。另外，植物基因工程研究中也需要具有组织特异性高表达的启动子，使外源目的基因能在特定的组织中高效表达。

植物种子的发育包括两个重要的过程：胚胎发生和种子成熟。随着胚的逐步成熟，大量贮藏产物，如：蛋白质、脂肪、碳水化合物开始合成和积累，种子逐步成熟。胚胎发育的形态发生阶段决定了植物个体的发育程序与整体结构模式。目前对于种子的形态学和生理学研究已取得了一定的进展，但由于克隆种子胚特异性基因在技术上存在困难，例如，种子储藏蛋白基因的高水平表达很容易掩盖一些低丰度基因的信息(参见Goldberg et al.，cell 1989，56：149-160)；缺少胚胎发育过程中的一些特殊分子或细胞标记等原因，目前在分子生物学水平上对种子胚胎发育的了解还很少。

因而，分离、获得种子胚特异性表达启动子，既有助于更细致地理解植物胚胎发育中形态发生与细胞分化的分子机理，又能广泛应用于植物基因工程研究中，使外源目的基因能在特定的组织中高效表达，以实现对外源基因表达的定时、定点定量三维精确调控，在改良作物品质的同时又可减少对植物的不利影响。

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，胚是水稻种子的重要组成部分，胚的发生和发育直接影响着水稻的繁殖和发育。因而分离、鉴定水稻种胚特异性启动子，了解胚特异基因表达的时空专一性特征及其相关表达机制已成为研究水稻种胚的发生和发育的主要内容。对水稻种胚特异性表达的启动子的功能研究与鉴定，将有利于实现外源基因在转基因植物特定组织中高效表达。近年来有关水稻种子特异性的研究逐渐增多，但由于目前已知的胚发育过程中特殊分子标记较少，具有种胚特异表达模式的功能基因的报道也不多，故对水稻种子特异性启动子的研究仍主要集中在胚乳特异性启动子上，像醇溶蛋白基因启动子、球蛋白基因启动子等，而对胚特异性启动子的研究及报道较少。Kuwano等研究证实水稻Ole18基因的启动子驱动相关基因在种子种胚中特异表达(PlantBiotech J,2009,7:96-105)。Wu等通过对水稻中不同贮藏蛋白相关基因的表达模式分析，从中鉴定了一个在水稻种胚中表达强度较高的水稻球蛋白启动子Glb(参见Plant Cell Physiol,1998,39:885-889)。若选择胚特异性高强度表达启动子，有助于定时定向调控外源有用蛋白的合成，既节约能源，保证了植物正常生理活动不受干扰，同时又能提高外源有用蛋白在种子中的储藏水平。同时，利用胚特异启动子可提高外源基因在植物胚中的表达和累积水平，也可改良种子品质、将具有生理活性的蛋白或短肽导入种子中创制保健型功能新品种、利用种子作生物反应器生产有用外源蛋白或可食性疫苗，增加农产品科技附加值等因此，胚特异启动子及其应用为揭示整个植物胚胎发育的过程和机理的研究，利用生物技术改良种子品质、分子医药农场等研究奠定了基础，具有极大的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种驱动外源基因在水稻胚中特异性表达的启动子以及该启动子在植物基因工程中的应用。其中，本文中所涉及的“植物”是指单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。

具体而言，一方面，本发明提供一种植物胚特异性表达启动子，其特征在于，所述植物胚特异性表达启动子包含SEQ ID No:1所示的DNA序列。

序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列为来源于日本晴水稻(Oryzasativa L cv.Nipponbare)的水稻胚特异表达启动子，本文中称为pEMB1或启动子pEMB1。

优选地，所述植物胚特异性表达启动子的DNA序列为SEQ ID No:1所示的DNA序列。

另一方面，本发明提供一种植物胚特异性表达启动子，所述植物胚特异性表达启动子的DNA序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列有至少80％同源性；或者，所述植物胚特异性表达启动子为在SEQ ID No:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突变体或等位基因或衍生物；或者，所述植物胚特异性表达启动子的DNA序列为具有与SEQ ID No:1所示的DNA序列的植物杂交的产物。这些启动子序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列具有相同功能，即驱动目标基因在植物胚中特异性表达，本文中称之为“pEMB1”或“启动子pEMB1”。

另一方面，本发明还提供一种表达盒，所述表达盒包含上述的植物胚特异性表达启动子。

另一方面，本发明还提供一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含上述的植物胚特异性表达启动子；

优选地，在所述重组表达载体中，上述的植物胚特异性表达启动子连接于待表达的基因序列的上游。优选地，所述待表达的基因为Gus基因；所述重组表达载体为将SEQ ID No:1所示的序列即pEMB1或启动子pEMB1构建于pCAMBIA1391中得到的重组表达载体，本文中称为pCAMBIA1391-pEMB1。

另一方面，本发明还提供了一种宿主菌，所述宿主菌包含本发明提供的上述植物胚特异性表达启动子pEMB1、上述表达盒、或上述的重组表达载体，其中，所述宿主菌为根癌农杆菌。

再一方面，本发明提供上述植物胚特异性表达启动子在培育转基因植物中的应用。具体而言，所述应用包括如下步骤：将所述的植物胚特异性表达启动子连接于重组表达载体的待表达的基因序列上游，并且将连接于所述重组表达载体的产物转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。

更具体而言，培育转基因植物是将本发明提供的上述植物胚特异性表达启动子连接于待表达的基因序列上游(例如，将所述启动子与目标基因融合，即合并到同一条DNA，将启动子序列置于目标基因之前)，并构建在重组表达载体中，将重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。待表达的基因即目标基因包括用于改良植物品质和积累的基因以及植物营养吸收相关的基因。

并且优选地，所述应用可以用于改良植物胚性状，所述植物为单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻；更优选地，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-pEMB1，以用于改良水稻胚形状。

本发明中所提供的启动子的DNA序列为(与SEQ No：1中相同)：

需要说明的是：上述启动子的DNA序列中，以斜体并加粗表示的序列“AATCAGCGAA CTGCCTCTTG AT”为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列，共计12bp；以斜体并加粗表示的序列“G GGTTGTTGTC ATGCTTAATA A”为获得启动子过程中使用的反向引物的留存序列(该留存序列与反向引物的相应序列互补)，共计12bp；而序列表中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的启动子。

综上所述，本发明的发明人从日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)中分离克隆得到结构包括转录起始位点在内的2071bp的DNA序列,并将其命名为pEMB1(序列表中的SEQ ID No:1)。将该序列经酶切后连接到植物双元表达载体pCAMBIA1391上，获得重组质粒，利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行组织化学检测发现，转基因植株整体上的Gus基因表达水平相对较低，仅在胚处显蓝色(图2F中的右上角部分)，从而证明该2071bp的序列具有驱动基因表达的活性，而且该启动子驱动的Gus基因在水稻胚中特异性表达。

本发明所述的启动子序列可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因链接，构建重组植物表达载体，所构建的重组植物表达载体经转化后可驱动靶标基因在胚中的特异性表达，从而提高外源靶标基因在植物胚中的表达量，增加转基因的效果，减轻外源靶标基因由于过量表达而对作物性状的影响。

从上面可以看出，本发明所克隆的水稻启动子pEMB1能够调控基因在胚中集中表达，在实际应用中具有显著价值。通过该启动子对农作物品种进行基因改造，如通过该启动子调控目标基因在胚中特异性表达，可以提高种子中稀有蛋白质、维生素和必需氨基酸的含量，提高稻米的营养价值和改善稻米的品质，从而培育出品质更加优良的稻米。

因此，该启动子在转基因作物开发中，可以提高和改善稻米的品质，从而培育出理想的、品质更加优良的稻米，由于其具有在胚中特异性表达的特征，可用其代替35S等组成型启动子，从而培育出理想的生物安全性高的转基因植物品种。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1A-1B为将pEMB1启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中图1A为pCAMBIA1391示意图，图1B为pCAMBIA1391-pEMB1示意图，其中示出了利用pEMB1启动子驱动位于其下游的GUS基因表达；

图2为利用pEMB1启动子驱动Gus基因表达的结果示意图，示出了水稻各部位Gus染色结果，图2示出了pEMB1：：gus转基因水稻植株，其中A表示根，B表示茎，C表示叶，D表示叶鞘，E表示花，F表示胚横切面；

图3为酶切验证的示意图。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

含有酶切位点的pEMB1启动子的获得

步骤1、引物的设计

根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因组序列，依据水稻pEMB1基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。

本实施例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1391(图1A，来自于CAMBIA，公开使用载体，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)为例，靶标基因为Gus基因，具体设计的引物为：正向引物(SEQ ID No:2)5’端带HindIII，酶切位点(AAGCTT)，反向引物(SEQ ID No:3)5’端带E.coRI，酶切位点(GAATTC)，引物序列如下：

正向引物：AAGCTTAATCAGCGAACTGCCTCTTGAT  HindIII

反向引物：GAATTCATATTAAGCATGACAACAACCC  E.coRI由深圳华大基因公司合成。

步骤2、启动子pEMB1的获得

以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子pEMB1，按常规PCR体系，采用如下扩增程序：

95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，进行35个从95℃预变性到72℃延伸的循环；最后72℃延伸10min。

回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度2071bp，并且将该目的片段连接到PGEM-T-Easy载体(购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合)上，按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞中，此后经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用HindIII和E.coRI进行双酶切验证，如图3所示。将经过鉴定的阳性克隆送交Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的启动子pEMB1，其核酸序列如SEQ ID No:1所示。

植物表达载体的构建和农杆菌的转化

从上面“启动子pEMB1的获得”步骤中获得的阳性克隆中提取质粒，用HindIII和E.coRI双酶切，回收启动子pEMB1片段。同时用HindIII和E.coRI对pCAMBIA1391载体进行线性化处理、回收pCAMBIA1391，将上述的pENP2片段和pCAMBIA1391片段用T4连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，得到启动子pEMB1与Gus基因融合的植物表达载体pCAMBIA1391-pEMB1(图1B)，利用冻融法将该植物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)，从冻融法所获得的产物中提取阳性质粒，用HindIII和E.coRI进行酶切验证，验证结果如图3所示。

利用启动子pEMB1驱动Gus报告基因在水稻中表达

步骤1：农杆菌介导的水稻遗传转化

将成熟水稻种子去掉颖壳后，用70％酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween 20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％)溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀种子的沿糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11天后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌转化。

采用在上述的“植物表达载体的构建和农杆菌的转化”步骤中转入重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan(Yongbo Duan，ChenguangZhai，et al.An efficient and high-throughput protocol for Agrobacteriummediated transformation based on phosphomannose isomerase positive selectionin Japonica rice(Oryza sativa L.)[J].Plant Cell Report，2012.DOI10.1007/s00299-012-1275-3.)等的方法。

共获得28株pEMB1-1391植株(pEMB1：：gus转基因水稻植株)。

步骤2、GUS组织化学染色

参照Jefferson(Jefferson RA等人.GUS fusion：β-Glucuronidase as asensitive and versatile gene fusion marker in higher plant[J].EMBO J.，1987，6:3901-3907)等的方法，将需要染色的组织抽真空，然后浸入染色液中，37℃染色24h。脱色时在37℃条件下用95％乙醇处理，至阴性对照材料呈白色。

通过GUS组织染色，检测启动子pEMB1在水稻转基因植株中对GUS的启动活性。结果显示，pEMB1：：gus转基因水稻植株的胚经GUS染色后呈现蓝色，而其它部位组织无染色。结果说明，启动子pEMB1能够驱动Gus基因在水稻胚中特异性高水平的表达。结果见图2。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (6)

1.一种水稻胚特异性表达启动子，其特征在于，所述水稻胚特异性表达启动子由SEQ ID No:1所示的DNA序列构成。

2.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含权利要求1所述的水稻胚特异性表达启动子。

3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含根据权利要求1所述的水稻胚特异性表达启动子；

其中，在所述重组表达载体中，权利要求1所述的水稻胚特异性表达启动子连接于待表达的基因的序列的上游。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述待表达的基因为Gus基因。

5.一种权利要求1所述的水稻胚特异性表达启动子在培育转基因水稻中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用包括如下步骤：将权利要求1所述的水稻胚特异性表达启动子连接于植物双元表达载体的待表达的基因的序列上游得到重组表达载体，并且将所述重组表达载体的产物转化到水稻细胞、组织或器官中进行培育。