CN111690650B - 一种植物热诱导表达启动子Posheat5及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种植物热诱导表达启动子Posheat5及其应用。本发明还提供了含有该启动子的表达盒、植物表达载体、宿主菌和转化子。具体而言，本发明获得了上述启动子并将上述启动子应用在植物转基因工程中。本发明提供的启动子可以在热诱导的条件下驱动外源基因在植物中表达，适用于单子叶禾谷类植物，尤其能够驱动外源基因在水稻植株中诱导表达，因此可以用于提高和改善水稻的生长特性，从而培育出理想的耐热水稻品种。

Description

一种植物热诱导表达启动子Posheat5及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种植物热诱导基因表达启动子及其应用，该启动子能够在水稻转基因调控体系中在热诱导条件下驱动目标基因在植株中表达。

背景技术

水稻作为全球第三大粮食作物,是约50％世界人口的主要粮食,我国三分之二的人口以水稻为主食,保证我国水稻高产是确保我国粮食安全的重要课题。高温是制约水稻生产和产量的重要因素，环境胁迫尤其是高温胁迫对水稻的各个时期都会造成极大损害,从而降低水稻的产量和品质。因此迫切需要发掘水稻耐热种质资源，培育出水稻耐热品种。

随着分子生物学技术以及植物基因工程的迅速发展，利用转基因技术来改变一些作物的性状，提高其对外界胁迫条件的耐受性从而增加作物的产量已经成为一种重要的技术。外源基因在转基因植物中低水平表达和非特异性表达是制约植物基因工程发展的一个重要因素，主要原因是缺少理想的启动子。

组织特异启动子由于其表达的空间特异性，可将外源基因在转基因植物中定位表达，这不但可以降低植物负担、减轻对作物农艺性状的影响，而且还能提高外源基因产物在特定部位的浓度，增加转基因的效果。与组成型表达启动子相比，诱导型启动子驱动的外源只在特定的环境或者组织中才高强度表达，因此可以根据实验需要来控制目的基因的时空表达。尽管已有文献报道从植物中分离了一些与抗逆有关的诱导特异性表达启动子，如SalT启动子和RD29A启动子等，但在重要农作物水稻中尚未分离到受高温强烈诱导表达的启动子用于植物抗逆遗传工程。因此，挖掘一些特异性表达特别是受高温诱导的启动子在改良作物抗逆育种上具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种驱动外源基因在热诱导条件下特异性表达，尤其是强表达的启动子、获得含有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。其中，本文中所涉及的“植物”是指单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种植物热诱导表达启动子Posheat5，所述植物热诱导表达启动子Posheat5包含序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列。序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列为来源于日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)的水稻热诱导表达启动子，本文中称为Posheat5或启动子Posheat5。

优选地，本发明提供的植物热诱导表达启动子Posheat5的DNA序列为SEQ ID No:1所示的序列，即Posheat5或启动子Posheat5。

另一方面，本发明提供一种植物热诱导表达启动子Posheat5，其DNA序列与SEQ IDNo:1所示的DNA序列有至少80％同源性；或者，所述植物热诱导表达启动子Posheat5为在SEQ ID No:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突变体或等位基因或衍生物；或者所述植物热诱导表达启动子Posheat5具有与SEQ ID No:1所示的DNA序列杂交的产物。这些植物热诱导表达启动子Posheat5序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列具有相同功能，即驱动目标基因在热诱导条件下在植物中特异性表达。

本发明所提到的热诱导指的是对转基因植株在37度处理24小时，从而通过本发明的启动子诱导特定基因表达。

另一方面，本发明还提供一种包含上述植物热诱导表达启动子Posheat5的表达盒。

又一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述的植物热诱导表达启动子Posheat5，在所述重组表达载体中，所述植物热诱导表达启动子Posheat5连接于待表达的基因序列的上游；优选地，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-Posheat5，该重组表达载体为将SEQ ID No:1所示的序列即Posheat5或启动子Posheat5构建于pCAMBIA1391中得到的重组表达载体，本文中称为pCAMBIA1391-Posheat5。或者，在实际应用中，选择耐热基因作为待表达基因，通过本发明的启动子在热诱导条件下，驱动耐热基因表达，从而提高植物的耐热性。

另一方面，本发明还提供一种宿主菌，所述宿主菌包含本发明提供的上述植物热诱导表达启动子Posheat5、上述表达盒、或上述重组表达载体；优选地，所述宿主菌为根癌农杆菌。

另一方面，本发明提供一种转化子，所述转化子包含本发明提供的上述植物热诱导表达启动子Posheat5、上述表达盒、上述重组表达载体。其中，所述转化子优选为转基因细胞系、愈伤组织或植株。

再一方面，本发明提供了上述植物热诱导表达启动子Posheat5在培育转基因植物中的应用。所述应用包括将本发明提供的上述植物热诱导表达启动子Posheat5连接于载体的待表达的基因序列上游(例如，将所述启动子序列置于目标基因之前)，从而构建重组表达载体，将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。所述待表达基因优选能够为植物提供耐热性，即耐热基因。

并且优选地，所述应用可以用于改良植物生长特性，所述植物为单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。

本发明中所提供的启动子的DNA序列为(与序列表中SEQ ID No：1中相同)：

需要说明的是：上述启动子的DNA序列中，序列开头以斜体并加粗表示的序列“CGGCCGGCGTAAGCCGCGTGCA”为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列，共计22bp；序列末尾以斜体并加粗表示的序列“ATCGTAGCTAGCAATCCTATAC”为获得启动子过程中使用的反向引物的留存序列(该留存序列与反向引物的相应序列互补)，共计22bp；该DNA序列中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。

综上所述，本发明的发明人从日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)中分离克隆得到结构包括转录起始位点在内的2100bp的DNA序列，并将其命名为Posheat5(序列表中的SEQ ID No:1)。将该序列经酶切后连接到植物双元表达载体pCAMBIA1391上，获得相应的重组质粒(即重组表达载体)，利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行组织化学检测发现，转基因植株在热诱导处理后，整体上的Gus基因表达水平相对较高并显蓝色，从而证明该2100bp的序列具有驱动基因表达的活性，而且该启动子驱动的Gus基因在水稻热诱导处理后特异性表达。

本发明所述的启动子序列可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因链接，构建重组植物表达载体，经转化，在热诱导处理后可驱动靶标基因在植株中特异性表达，从而提高外源靶标基因在植物中的表达量，增加转基因的效果。在具体应用时，可以将靶标基因选择为具有提高植株耐热性功能的基因(耐热基因)，这样，通过热诱导处理之后，该基因大量表达，增强植株的耐热性。

技术效果

本发明所克隆的水稻启动子Posheat5能够调控基因在植株中适时集中表达，在实际应用中具有显著价值。通过该启动子对农作物品种进行基因改造，如通过该启动子调控目标基因在植株中表达，代替35S等组成型启动子，从而培育出理想的生物安全性高的耐热的转基因植物品种。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为将Posheat5启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中图1中A为pCAMBIA1391示意图，图1中B为pCAMBIA1391-Posheat5示意图，其中示出了利用Posheat5启动子驱动位于其下游的GUS基因表达；

图2为对本发明的启动子进行酶切验证的结果示意图。

图3为萌发20天后的Posheat5::GUS转基因植株组织染色图。在28℃条件下正常生长的水稻植株，经24小时染色后，根(A),茎(B),叶(C)均无GUS活性，而在37℃热处理24小时后，再经过12小时染色后，在根(D),茎(E),叶(F)中均有GUS强烈表达(标尺＝10mm)，尤其是叶片，表达量为正常表达量的10倍以上。

图4为Posheat5::GUS转基因植株在高温处理前后，不同组织中的Posheat5驱动的GUS基因表达量的变化。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

具体实施例1、含有酶切位点的Posheat5启动子的获得

步骤1、引物的设计

本申请的发明人在实验研究中，注意到水稻日本晴(Oryza sativa Lcv.Nipponbare)基因组DNA中的一个特定片段(详见序列表)具有受高温诱导的特性，并因此对该基因进行了深入研究。申请人将该基因命名为Posheat5。以此基因为目的基因设计引物并进行了诱导实验。

本实施例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1391(图1A，来自于CAMBIA，公开使用载体，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)为例，靶标基因为Gus基因，具体设计的引物为：正向引物(SEQ ID No:2)5’端带BamHI，酶切位点(GGATCC)，反向引物(SEQ ID No:3)5’端带EcoRI，酶切位点(GAATTC)，引物序列如下：

正向引物：GGATCCCGGCCGGCGTAAGCCGCGTGCA BamHI

反向引物：GAATTCGTATAGGATTGCTAGCTACGAT EcoRI

由深圳华大基因公司合成。

步骤2、启动子Posheat5的获得

以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子Posheat5，按常规PCR体系，采用如下扩增程序：

95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，执行35个从95℃预变性到72℃延伸的循环；最后72℃延伸10min。

回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度2100bp，将其连接到PGEM-T-Easy载体(购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合)上，按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞中，然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用BamHI和EcoRI进行双酶切验证，如图3所示。将经过鉴定的阳性克隆送交Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的启动子Posheat5，其核酸序列如SEQ ID No:1所示。

具体实施例2、植物表达载体的构建和农杆菌的转化

从上面“启动子Posheat5的获得”过程中获得的阳性克隆中提取质粒，用BamHI和EcoRI双酶切，回收启动子Posheat5片段。同时利用BamHI和EcoRI对pCAMBIA1391进行线性化处理、回收pCAMBIA1391，将上述的Posheat5片段和pCAMBIA1391片段用T4连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，得到启动子Posheat5与Gus基因融合的植物表达载体pCAMBIA1391-Posheat5(图1B)，利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)，从冻融法所得产物中提取阳性质粒，用BamHI和EcoRI进行酶切验证，验证结果如图2中所示。

具体实施例3、利用启动子Posheat5驱动Gus报告基因在水稻中表达

步骤1：农杆菌介导的水稻遗传转化

将成熟水稻种子去掉颖壳后，用70％酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween 20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％)溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀对种子沿糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11天后将愈伤组织与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌转化。

采用上述“植物表达载体的构建和农杆菌的转化”过程中转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan(Yongbo Duan，Chenguang Zhai，et al.An efficient and high-throughput protocol for Agrobacterium mediated transformation based onphosphomannose isomerase positive selection in Japonica rice(Oryza sativa L.)[J].Plant Cell Report，2012.DOI 10.1007/s00299-012-1275-3.)等提出的方法。

共获得24株pCAMBIA1391-Posheat5植株(Posheat5：：gus转基因水稻植株)。

步骤2、热处理和GUS组织化学染色

将所获得植株在37℃下高温处理24小时后，再经过12小时的GUS染色，染色方法参照Jefferson(Jefferson RA等人.GUS fusion：β-Glucuronidase as a sensitive andversatile gene fusion marker in higher plant[J].EMBO J.，1987，6:3901-3907)等提出的方法，将需要染色的组织抽真空，然后浸入染色液中。脱色时在37℃条件下用95％乙醇处理，至阴性对照材料呈白色。如图3所示，在28℃条件下正常生长的水稻植株，经24小时染色后，根(A)、茎(B)、叶(C)均无GUS活性，而在37℃高温处理24小时后，再经过12小时染色后，在根(D)、茎(E)、叶(F)中均有GUS强烈表达。

步骤3、荧光定量PCR鉴定Posheat5启动子热诱导活性

分别提取生长20天T1代Posheat5::GUS转基因幼苗在高温(37℃)前后的RNA。RNA提取采用天根公司(北京)的植物RNA提取试剂盒方法提取。荧光定量PCR(qRT-PCR)采用天根公司(北京)的SuperReal荧光定量预混液试剂盒(TIANGEN，SYBR Green，FP205)。以水稻ACTIN基因作为内参基因对所用RNA模板量进行定量。采用2^–ΔΔCT(ΔCT＝CT目标基因-CT内参基因；ΔΔCT＝ΔCT处理后-ΔCT对照)对获得的信号和数据进行处理。每个基因做3次重复。本实验中用到的基因的定量引物为：

Actin-FP，5’-CCTGACGGAGCGTGGTTAC-3’

Actin-RP，5’-CCAGGGCGATGTAGGAAAGC-3’

用于内参基因ACTIN的扩增；

GUS-FP，5’-TACGGCAAAGTGTGGGTCAATAATCA-3’

GUS-RP，5’-CAGGTGTTCGGCGTGGTGTAGAG-3’

用于GUS基因的扩增。

定量RT-PCR结果如图4所示，以热处理前的10天大小的Posheat5启动子转基因植株的根中的GUS基因表达量为1，当高温处理24小时后，根、茎、叶中由Posheat5启动子驱动的GUS基因表达量都有不同程度的提高。特别是在叶中，高温处理后由Posheat5启动子驱动的GUS基因表达量是处理前的12倍，这进一步说明，该启动子是一个高温诱导启动子，它能够在高温条件下，驱动GUS基因的表达。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

序列表

<110> 安徽省农业科学院水稻研究所

<120> 一种植物热诱导表达启动子Posheat5及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2100

<212> DNA

<213> 启动子

<400> 1

cggccggcgt aagccgcgtg cacccggtcc accgtggacc gtgaggctgc cgcgtgggcc 60

ccactcccgt ggacccggtc cgcgcgcccc tcccctcggc tgacgcaata aatccgattt 120

taaattaaaa tttaaatgaa gaaattcgta aatatccatt taaagagcat ataaacttca 180

aatggccata acttggccat ttgaactcgg aattggaccg ttcaagtctc taatttttcc 240

ttaagaagcc aagaacccat ttttgtgctt tgtttctgct tgttatatgg agtttagtag 300

agtaaaagcc ttttcttttc cgttggtcgt gtagacgctg cggcttcgga agatccgctc 360

ttcgtggaag ttgaagccga cgtttgggaa agcgagcaag gcaagtcaca tcatccttga 420

acatattgaa tcccagttta taaaattatt ttgatttaaa ttattgcatt atcgctttat 480

ttaaattccc gcgttatcac tgttttattt agccatgcct atttaccttt gttatgacct 540

tattattatt gctattgtta ttattacctt gttcacccta ggaaaacaaa accccaacta 600

gtgggtactc tattcatggt tccactagta tgaacttcgg tagatgcttc gctggttaat 660

taggaaacat tagggggttt tataacttta gactttggga aatctcatat catttggaca 720

ttatggaatt gtcggattat ggtggaattg gacatagccc tctcttcctc tttcaaagcc 780

cctaaaacct gtttttcggt ggggtttggg tgcatgccag ttgtgggaag tagcaccccg 840

gccactataa ggattaagct cgggcctctg ttgcaaagca ctaccgtact tccacatgtc 900

tagtgggtaa ggcttagttt gtagctcaga ctggttataa acaaaagtac acggatggag 960

atggacgaag tcgggggtcg atggacatct ctaggacaaa tgaaggctac acgagctgcg 1020

gcccggtagt cgagatgtca tggcacaggg ctggtgtcct gctgctaggg gctcaatcct 1080

gcctacctgt cccggaggtt ccggccgtag gtggggttgg gtcggtactc ttgtttatgg 1140

ctaggatggg ttgggaacta tgtcacgtct tccgtccgta taccgtggtg gtatgtggca 1200

cgtggttaca cgtgaggaag atgtgtcttg tgggtaaaga tgtacacctc tgatcagagt 1260

ataatctatt cgaatagccg cgccctcggt tatgggcaag ccgagcaatg tacccaagtt 1320

agtgttttaa ttcttaaaat ttgctcaaca actaaaatgt ggaatggttg gcctgggttg 1380

gcttgggacg agctgggacc cagggtcggg ttgccagttc ggtctgaatc atcgtaggcc 1440

ttgggttaag gcaggttcgt gagggttcac ggccttgatt aataatactg tgtagctcta 1500

ggatcgtctt tataaaatgg ctttgggcaa ctaagtgact tttaaatgct gttttctgca 1560

taacttaacc cctatatcat taccccttgt acccccttgc attagtcgtg catctgccgg 1620

tgtggcttgc tgagtactgt ggttgtactc attcttgctc tatctttctc cccccttcag 1680

taagagaagc tttggagaag aagtcttagg tggagtcttg gcttataccc cagttgagcg 1740

cctgtgaaga tggagccgta ggcccgctag tccgctgctg tttatttttg attgtcaggc 1800

cttaagtgcc tttgtaataa tgtaaatatt atcgatataa taaagatgtg tcttttatat 1860

catgtttgta tggtgtaccc cggcttttcc tgggacgggg attaatacac tagcgttcgg 1920

gaaaatgcaa ttttctcggt cgcgacaaat agccattgcc aattcgccat gatgtttgca 1980

cttgtcactt gctttgtgca gtgatcagca agcgacactg ccactctctc cctaggccta 2040

taaataccac cagtctggca ccatccacaa cccaggtcat cgtagctagc aatcctatac 2100

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggatcccggc cggcgtaagc cgcgtgca 28

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gaattcgtat aggattgcta gctacgat 28

Claims (7)

1.一种植物热诱导表达启动子Posheat5，其特征在于，所述植物热诱导表达启动子Posheat5的DNA序列为SEQ ID No: 1所示的序列。

2.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含权利要求1所述的植物热诱导表达启动子Posheat5。

3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求1所述的植物热诱导表达启动子Posheat5，在所述重组表达载体中，所述植物热诱导表达启动子Posheat5连接于载体中待表达的基因序列的上游。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-Posheat5，其中pCAMBIA1391为植物双元表达载体，或者，所述待表达基因是具有耐热性的基因。

5.一种宿主菌，其特征在于，所述宿主菌包含权利要求1所述的植物热诱导表达启动子Posheat5、权利要求2所述的表达盒、或权利要求3所述的重组表达载体，其中，所述宿主菌为根癌农杆菌。

6.一种转化子，其特征在于，所述转化子包含权利要求1所述的植物热诱导表达启动子Posheat5、权利要求2所述的表达盒、或权利要求3所述的重组表达载体，所述转化子为非植物细胞。

7.一种权利要求1所述的植物热诱导表达启动子Posheat5在培育转基因水稻中的应用，其特征在于，所述应用包括：将权利要求1所述的植物热诱导表达启动子Posheat5连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到水稻细胞、组织或器官中进行培育，所述待表达基因为耐热基因。

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