CN103834661A - 一种植物热诱导表达启动子Posheat1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种植物热诱导表达启动子Posheat1及其应用。本发明还提供了含有该启动子的表达盒、植物表达载体、宿主菌和转化子。具体而言，本发明将上述启动子应用在植物转基因工程中。本发明提供的启动子可以在热诱导的情况下启动外源基因在植物中表达，适用于任何植物，尤其能够驱动外源基因在水稻植株中表达，因此可以用于提高和改善水稻的生长特性，从而培育出理想的耐热水稻品种。

Description

一种植物热诱导表达启动子Posheat1及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种植物热诱导基因表达启动子及其应用，该启动子能够在水稻转基因调控体系中在热诱导下驱动目标基因在植株中表达。

背景技术

植物在生长发育过程中往往会受到各种非生物因子的胁迫，包括干旱、渍水、盐碱化、温度的变化等。随着人类工业化进程的迅猛发展，自然环境的破坏以及CO₂、甲烷等温室气体的大量排放，温室效应日趋恶化，高温已经成为影响植物生长发育的最重要的因素之一。据国际水稻所研究，高温环境可以直接导致水稻产量明显损失，由此可见，高温对植物生长发育的危害呈加重趋势。

水稻是我国主要粮食作物，在保障国家粮食安全过程中占有举足轻重的地位，而高温对水稻整个生长发育过程都会产生影响。Prasad等认为高温胁迫导致花药不开裂或开裂受阻，花粉活力降低。李成得等、曹云英等研究认为，当日平均温度高于32℃，日最高温度高于35℃时，花粉活力、花药开裂、花粉萌发和花粉管伸长等都受影响，导致受精结实率下降。尽管前人对高温造成结实率降低的原因及生理机制有一些研究，但目前研究大多仅限于某一方面，而利用转基因工程技术改良或选育耐热性水稻品种的研究报道不多。

随着分子生物学、生物信息学的飞速发展和转基因技术的日趋成熟，通过现代基因工程技术进行分子育种已成为改良水稻耐热性的一种高效途径。因此，为应对高温热害这一挑战，必须不断挖掘和利用新的耐热水稻品种资源，加强水稻耐热的生理机制和遗传基础研究，以培育出耐高温热害能力突出的水稻新品种。

发明内容

本发明的目的是提供一种驱动外源基因在热诱导条件下表达的启动子、获得含有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。其中，本文中所涉及的“植物”是指单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种植物热诱导表达启动子，所述植物热诱导表达启动子包含序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列。序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列为来源于日本晴水稻（Oryza sativaL cv.Nipponbare）的水稻热诱导表达启动子，本文中称为Posheat1或启动子Posheat1。

优选地，本发明提供的植物热诱导表达启动子的DNA序列为SEQ IDNo:1所示的序列，即Posheat1或启动子Posheat1。

另一方面，本发明提供一种植物热诱导表达启动子Posheat1，其DNA序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列具有至少80%同源性；或者，所述植物热诱导表达启动子Posheat1为在SEQ ID No:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突变体或等位基因或衍生物；或者所述植物热诱导表达启动子Posheat1具有与SEQ ID No:1所示的DNA序列杂交的产物。这些植物热诱导表达启动子序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列具有相同功能，即驱动目标基因在热诱导条件下在植物中表达。

另一方面，本发明还提供一种包含上述植物热诱导表达启动子Posheat1的表达盒。

又一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述的植物热诱导表达启动子Posheat1，在所述重组表达载体中，所述植物热诱导表达启动子Posheat1连接于待表达的基因序列的上游；优选地，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1381-Posheat1，该重组表达载体为将SEQ ID No:1所示的序列即Posheat1或启动子Posheat1构建于pCAMBIA1381中得到的重组表达载体，本文中称为pCAMBIA1381-Posheat1。

另一方面，本发明还提供一种宿主菌，所述宿主菌包含本发明提供的上述植物热诱导表达启动子Posheat1、上述表达盒、或上述重组表达载体；优选地，所述宿主菌为根癌农杆菌。

另一方面，本发明提供一种转化子，所述转化子包含本发明提供的上述植物热诱导表达启动子Posheat1、上述表达盒、上述重组表达载体、或上述宿主菌。其中，所述转化子优选为转基因细胞系、愈伤组织或植株。

再一方面，本发明提供上述植物热诱导表达启动子在培育转基因植物中的应用。所述应用包括将本发明提供的上述植物热诱导表达启动子连接于植物表达载体的待表达的基因序列上游（例如，将所述启动子序列置于目标基因之前），从而构建重组表达载体，将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。

并且优选地，所述应用可以用于改良植物生长特性，所述植物为单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。

本发明中所提供的启动子的DNA序列为（与序列表中SEQ ID No：1中相同）：

GCAATGCCATTTCTCTTCAGGTGAAACCATGGGTAAAGACAAGCCTTGCCCCTGGATCTGGGGTTGTCACTAAATACTTGTTACAGAGGTACCTTCGTGTCATTGAATAACTAATTTTAGTAAAGATGAAATTCCAGTGTCATATCTGGACCAATCTCAACCAAACATGGTAATTTCTCTGTGCAGTGGCCTTCAAGAATACTTGAACAAGCAAGGTTTCCATGTTGTTGGATATGGTTGTACCACTTGCATTGGCAACTCTGGTGATCTAGATGAATCTGTATCAGCTGCCATTTCAGAAAATGGTACATCTAGATTCTATGAATGTTGAATATTTAGCTGCAACGAGCCAATGAGTTTCTCTATTGGCAACTTATGGTTTTCTTTTTTATAGATGTTGTTGCTGCTGCTGTTCTGTCGGGCAACCGTAACTTCGAGGGTCGTGTGCACCCATTGACCCGGGCTAATTACCTTGCTTCACCGCCTCTTGTGGTTGCATATGCACTTGCTGGCACTGTAAGTTTGTGTTGTTTTCTCCTCCTTGATACTCATATTAACTCGATTCTGTTGGAAGGGTTGGCATGGTATTAAAATTTTGCCTATCTTTGCTTTTGTCTCAGGGAGCCTGCTAACATTAGAACTTGTACTTTTCAGGTTGACATTGATTTTGAGAAAGAGCCGATTGGAGTTGGAAAGGATGGTAAAGAAGTCTTCTTCAGGGACATATGGCCCTCAACTGAAGAAATTGCAGAAGTACGTGTTCTGTGATGTTATTTTAATATGTTTCAGATTTTCATCTGTAAGTGTGAGTTTCATTTATTGGAGATATTTATCTCTCGAGTCTCGCTTAATTATTGGCAATAAAATGCTACTTGACAGGTGGTCCAATCTAGCGTACTGCCTGATATGTTCAAAAGTACATACGAGGCTATTACAAAAGGCAACCCGATGTGGAATCAGCTGACCGTGCCCGAAGCATCGCTCTATTCGTGGGATCCAAACTCCACCTACATCCATGAGCCTCCATACTTTAAGGACATGACCATGTCCCCACCTGGCCCCCATGGGGTGAAGAATGCCTACTGCTTACTGAACTTTGGGGACAGCATTACGACAGACCATATTTCACCAGCAGGTAGCATTCACAAAGACAGCCCTGCTGCCAAGTACTTGCTTGAGCGTGGTGTGGACCGTAAGGACTTCAATTCATATGGTAGCCGTCGTGGTAATGATGAAGTAATGGCAAGAGGAACATTTGCGAACATCAGGATTGTGAACAAGTTTTTGAATGGAGAAGTTGGACCCAAGACCGTTCATGTCCCTACAGGGGAGAAGCTCTATGTATTTGATGCTGCCTTGGTATGTTGCTAGTATGTAGACAGACGATGTGATACTGTTGTTGTATCGACTAACATCCTTGGTTTTGTCTGGTACATTAATGCAGAAATACAAGTCTGAGGGTCATGACACTATTGTTCTTGCTGGTGCTGAGTATGGAAGTGGCAGTTCTCGTGACTGGGCTGCCAAGGGACCGATGCTCCTGGTAACTCCCCATATCTAGATTCGTCATCTTGTTTTGATACTCATGTTTGGGGAAGTATAGCATTATTAAGTACATGCTGTTTTCAGGGTGTTAAAGCTGTGATCGCTAAGAGCTTTGAGCGTATCCACCGAAGCAACCTGGTGGGTATGGGAATCATTCCTCTCTGCTTCAAGGCTGGTGAGGATGCCGACTCACTTGGCCTTACTGGACATGAGCGGTATACCATCGACCTCCCGACCAACGTCAGCGAGATCCGTCCCGGGCAGGACATTACCGTCACAACCGACAACGGGAAATCCTTCACTTGTACTCTTCGCTTTGACACAGAGGTACATACTTTCCAAATACTCGTTGGATAAACTTACCAGGCCAGTTCCGTATGGAGAATTCATTACAGCTGCTTAGGTCCTCTCAACCGGTTTGCTTACATATTACGTCGTTCTTTGTTGTGCTATATAGGTGGAACTGGCATACTTCAACCATGGAGGCATCCTCCCATACGTCATCCGCAACCTGGCGCAGAACTAGGAGAAAATGCACACCAT

需要说明的是：上述启动子的DNA序列中，序列开头以斜体并加粗表示的序列“GCAATGCCATTTCTCTTCAGGT”为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列，共计22bp；序列末尾以斜体并加粗表示的序列“ACTAGGAGAAAATGCACACCAT”为获得启动子过程中使用的反向引物的留存序列（该留存序列与反向引物的相应序列互补），共计22bp；该DNA序列中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。

综上所述，本发明的发明人从日本晴水稻（Oryza sativa L cv.Nipponbare）中分离克隆得到结构包括转录起始位点在内的2088bp的DNA序列，并将其命名为Posheat1（序列表中的SEQ ID No:1）。将该序列经酶切后连接到植物双元表达载体pCAMBIA1381上，获得相应的重组质粒（即重组表达载体），利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行组织化学检测发现，转基因植株在热诱导处理后，整体上的Gus基因表达水平相对较高并显蓝色，从而证明该2088bp的序列具有驱动基因表达的活性，而且该启动子驱动的Gus基因在水稻热诱导处理后表达。

本发明所述的启动子序列可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因链接，构建重组植物表达载体，经转化后，在热诱导处理后可驱动靶标基因在植株中特异性表达，从而提高外源靶标基因在植物中的表达量，增加转基因的效果。本文中所提到的热诱导指的是给植物施加的温度高于其正常环境温度，例如，高于34或35摄氏度，从而诱导目标基因表达。

技术效果

本发明所克隆的水稻启动子Posheat1能够在热诱导的条件下调控基因在植株中集中表达，在实际应用中具有显著价值。通过该启动子对农作物品种进行基因改造，如通过该启动子调控目标基因在植株中表达，可以提高和改善水稻的生长特性和机制，代替35S等组成型启动子，从而培育出理想的生物安全性高的耐热的转基因植物品种（只需将本发明实施例中所采用的待表达基因换成耐热基因即可）。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为将Posheat1启动子构建于pCAMBIA1381载体质粒中的示意图，其中图1中A为pCAMBIA1381示意图，图1中B为pCAMBIA1381-Posheat1示意图，其中示出了利用Posheat1启动子驱动位于其下游的gus基因表达；

图2为热诱导处理图片，图中左侧为对照（未经过热处理的染色结果），右侧是37℃热处理24小时后的染色结果。

图3为将萌发5天后的Posheat1：：gus转基因幼苗，放在37℃条件下分别处理4小时和24小时,来模拟热处理条件，同时将同样的幼苗放在常温水中为对照。

图4为对本发明的启动子进行酶切验证的结果示意图。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

含有酶切位点的Posheat1启动子的获得

步骤1、引物的设计

根据NCBI中提供的水稻品种日本晴（Oryza sativa L cv.Nipponbare）全基因组序列，依据水稻Posheat1基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。

本实施例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1381（图1A，来自于CAMBIA，为公开使用载体，在安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存）为例，靶标基因为Gus基因，具体设计的引物为：正向引物（SEQ ID No:2）5’端带SalI，酶切位点（GTCGAC），反向引物（SEQ ID No:3）5’端带HindIII，酶切位点（AAGCTT），引物序列如下：

正向引物：GTCGACGCAATGCCATTTCTCTTCAGGT    SalI

反向引物：AAGCTTATGGTGTGCATTTTCTCCTAGT    HindIII

由深圳华大基因公司合成。

步骤2、启动子Posheat1的获得

以水稻品种日本晴的DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子Posheat1，按常规PCR体系，采用如下扩增程序：

95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，执行35个从95℃预变性到72℃延伸的循环；最后72℃延伸10min。

回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度2088bp，将其连接到PGEM-T-Easy载体（购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合）上，按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞中，然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用SalI和HindIII进行双酶切验证，如图4所示。将经过鉴定的阳性克隆送交Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的启动子Posheat1，其核酸序列如SEQ ID No:1所示。

植物表达载体的构建和农杆菌的转化

从上面“启动子Posheat1的获得”过程中获得的阳性克隆中提取质粒，用SalI和HindIII双酶切，回收启动子Posheat1片段。同时利用SalI和HindIII对pCAMBIA1381进行线性化处理、回收pCAMBIA1381，将上述的Posheat1片段和pCAMBIA1381片段用T4连接酶（购于TaKaRa公司）进行连接，得到启动子Posheat1与Gus基因融合的植物表达载体pCAMBIA1381-Posheat1（图1B），利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105（安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存），从冻融法所得产物中提取阳性质粒，用SalI和HindIII进行酶切验证，验证结果如图4中所示。

利用启动子Posheat1驱动Gus报告基因在水稻中表达

步骤1：农杆菌介导的水稻遗传转化

将成熟水稻种子去掉颖壳后，用70%酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween20的50%次氯酸钠（原液有效氯浓度大于4%）溶液浸泡种子40min（150r/min）。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀对种子沿糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11天后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌转化。

采用上述“植物表达载体的构建和农杆菌的转化”过程中转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan（Yongbo Duan，Chenguang Zhai，et al.An efficient and high-throughput protocol for Agrobacterium mediatedtransformation based on phosphomannose isomerase positive selection inJaponica rice(Oryza sativa L.)[J].Plant Cell Report，2012.DOI10.1007/s00299-012-1275-3.）等提出的方法。

共获得52株Posheat1-pCAMBIA1381植株（Posheat1：：gus转基因水稻植株）。

步骤2、GUS组织化学染色

参照Jefferson(Jefferson RA等人.GUS fusion：β-Glucuronidase as asensitive and versatile gene fusion marker in higher plant[J].EMBO J.，1987，6:3901-3907)等提出的方法，将需要染色的组织抽真空，然后浸入染色液中，37℃染色24小时。脱色时在37℃条件下用95%乙醇处理，至阴性对照材料呈白色。

在37℃热诱导条件处理24小时后，通过GUS组织染色，检测启动子Posheat1在水稻转基因植株中对GUS的启动活性。结果显示，Posheat1：：gus转基因水稻植株经GUS染色后呈现蓝色，而对照植株无染色。结果说明，在37℃热诱导条件下，启动子Posheat1能够驱动Gus基因在水稻植株中高水平表达，结果见图2。

另外，在37℃热处理条件下，对水稻转基因植株分别处理4小时和24小时后，将样品用液氮速冻后提取RNA，以actin基因为内参，用RT-PCR来检测Gus基因在转录水平上的相对表达量，进而来反映该启动子的热诱导活性。结果显示，Gus基因的表达量是未经处理转基因植株的3.5和5.5倍，因此说明，该启动子经37℃条件热诱导后，特别是在热诱导处理24h后诱导活性达到最高值，结果见图3。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (9)

1.一种植物热诱导表达启动子Posheat1，其特征在于，所述植物热诱导表达启动子Posheat1包含SEQ ID No:1所示的DNA序列。

2.根据权利要求1所述的植物热诱导表达启动子Posheat1，其特征在于，所述植物热诱导表达启动子Posheat1的DNA序列为SEQ ID No:1所示的序列。

3.根据权利要求1所述的植物热诱导表达启动子Posheat1，其特征在于，所述植物热诱导表达启动子Posheat1的DNA序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列具有至少80%同源性；

或者，所述植物热诱导表达启动子为在SEQ ID No:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突变体或等位基因或衍生物；

或者，所述植物热诱导表达启动子具有与SEQ ID No:1所示的DNA序列杂交的产物。

4.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含权利要求1-3中任意一项所述的植物热诱导表达启动子Posheat1。

5.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求1-3中任意一项所述的植物热诱导表达启动子Posheat1，在所述重组表达载体中，所述植物热诱导表达启动子Posheat1连接于载体中待表达的基因序列的上游；

优选地，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1381-Posheat1，其中pCAMBIA1381为植物双元表达载体。

6.一种宿主菌，其特征在于，所述宿主菌包含权利要求1-3中任意一项所述的植物热诱导表达启动子Posheat1、权利要求4所述的表达盒、或权利要求5所述的重组表达载体，其中，所述宿主菌为根癌农杆菌。

7.一种转化子，其特征在于，所述转化子包含权利要求1-3中任意一项所述的植物热诱导表达启动子Posheat1、权利要求4所述的表达盒、或权利要求5所述的重组表达载体、或者权利要求6所述的宿主菌。

8.一种根据权利要求1-3中任意一项所述的植物热诱导表达启动子Posheat1在培育转基因植物中的应用，其特征在于，所述应用包括：将根据权利要求1-3中任意一项所述的植物热诱导表达启动子Posheat1连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用用于改良植物生长特性，所述植物为单子叶植物：水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦。

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