CN103710344B - 一种植物胚乳特异性表达启动子pENP2及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种植物胚乳特异性表达启动子pENP2及其应用，含有该启动子的表达盒、重组表达载体、宿主菌和转化子，并且本发明还提供了上述启动子在植物转基因工程中的应用。本发明提供的启动子可以启动外源基因在植物胚乳中特异性表达，适用于任何种子具有胚乳的植物，特别是单子叶植物或胚乳型双子叶植物，尤其能够驱动外源基因在稻米胚乳中特异性表达，因此可以用于提高和改善稻米的品质，从而培育出理想的、品质更加优良的稻米。

Description

一种植物胚乳特异性表达启动子pENP2及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种水稻基因表达启动子及其应用，该启动子能够在水稻转基因调控体系中驱动目标基因在胚乳中表达。

背景技术

水稻是最主要的粮食作物之一，世界上三分之一以上的人口都以稻米为主食。随着经济的发展，全球范围内对稻米产量和品质提出了越来越高的要求。因而，利用各种方法来提高水稻单产、改良稻米品质，有着极其重要的意义。将现代生物技术运用于水稻品种改良中，可以解决一些用常规方法难以解决的问题。自九十年代以来，水稻生物技术取得了很大的发展，一些控制重要农艺性状基因的分离和水稻转基因技术的不断完善，为用基因工程技术来改良水稻品种奠定了良好的基础。

植物生物技术的最新发展不仅实现了传统农艺性状的改良，如：提高作物产量、增强抗病、抗虫、抗除草剂特性和改良品质等，而且使植物成为生物医药和工业产品的生物反应器。对于绝大多数禾本科作物，由于其产量高、生产成本低、耐储藏且生产规模容易控制等特点，决定了其为第二代转基因产物的理想载体。近年来利用水稻种子生产具有保健作用的外源蛋白和可食性疫苗研究发展很快，且已经取得了巨大成功。如维生素A、具有降低血糖作用的大豆球蛋白、具有预防和治疗缺铁性贫血和提高自身免疫功能的大豆铁蛋白、具有刺激胰岛素分泌预防糖尿病发生功能的GLP(胰高血糖素样肽)、乙肝疫苗和花粉过敏症疫苗等均成功地在水稻中表达并高水平积累。然而缺少相应的启动子成为目前生物技术应用(外源基因的理想表达部位，表达方式，表达时期和表达水平等)的限制因子。

植物基因工程的根本目标是培育能使目的基因稳定而且高效表达的转基因植株。基因表达受控于转录起始处的核苷酸序列即启动子成分，它主要包括RNA聚合酶启动转录的信号，以指导合成相应的信使RNA分子，进一步指导蛋白质的合成。启动子控制基因转录水平，同时还决定了基因的表达时间和表达方式。因此，启动子是基因表达所必需的，其决定了外源基因在转基因植物中表达的时间、空间和表达的强度等，是人们定向改造生物的重要限制因素。目前在植物表达载体中广泛应用的启动子是组成型启动子。然而，由于组成型启动子驱动外源基因在受体植物内所有部位持续的表达，不仅造成浪费，而且往往会影响植株正常的生长发育。组织特异型启动子可将外源基因集中在某一时间或目标组织中表达，不仅可避免因在转基因植株非目标组织中表达所造成的能源浪费，而且也可避免因在非收获器官或组织中表达目标蛋白而造成的转基因食品的潜在不安全性等。因此，组织特异性启动子不仅有助于阐明植物形态、发育、代谢途径等基础理论，而且具有广泛的应用价值。胚乳特异型启动子是组织特异型启动子的一种，它可以控制外源基因在植物胚乳中高效表达、避免外源基因在植物的其它部位表达，从而减少对植物的不利影响。

筛选和分离一些具有组织专一性、高表达水平的启动子以及分析有关重要特异性调控元件的功能，在基因工程研究中有着广泛的用途。胚乳是粮食作物营养的最重要组成部分，因此分离胚乳特异性强表达启动子对植物品质的改良具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种驱动外源基因在植物胚乳中特异性表达的启动子、获得含有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。其中，本文中所涉及的“植物”是指单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。

具体而言，一方面，本发明提供一种植物胚乳特异性表达启动子，所述启动子包含序列表SEQ ID No:1所示的DNA序列。序列表SEQ ID No:1所示的DNA序列为来源于日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)的水稻胚乳特异表达启动子，本文中称为pENP2或启动子pENP2。

优选地，所述植物胚乳特异性表达启动子的DNA序列为SEQ ID No:1所示的序列。

另一方面，本发明提供一种植物胚乳特异性表达启动子pENP2，所述植物胚乳特异性表达启动子pENP2的DNA序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列有至少80％同源性；

或者，所述植物胚乳特异性表达启动子pENP2为在SEQ ID No:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突变体或等位基因或衍生物。这些启动子序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列具有相同功能，即驱动目标基因在植物胚乳中特异性表达。

另一方面，本发明还提供一种表达盒，所述表达盒包含权利要求1-3中任意一项所述的植物胚乳特异性表达启动子pENP2。。

又一方面，本发明还提供一种重组载体，所述重组载体包含上述的植物胚乳特异性表达启动子pENP2。优选地，所述重组载体为重组表达载体；进一步优选地，在所述重组表达载体中，本发明提供的所述植物胚乳特异性表达启动子pENP2连接于待表达的基因序列的上游。

根据本发明的一种实现方式，所述待表达的基因为Gus基因(β-葡萄糖苷酸酶基因)；所述重组表达载体为将SEQ ID No:1所示的序列(即pENP2或启动子pENP2)构建于pCAMBIA1391中得到的重组表达载体，本文中称为pCAMBIA1391-pENP2。其中，pCAMBIA1391来自于CAMBIA，为公开使用载体，并且在安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存。

并且，本发明还提供一种宿主菌，所述宿主菌包含本发明提供的上述植物胚乳特异性表达启动子、上述表达盒、或上述重组载体；优选地，所述宿主菌为根癌农杆菌。

另一方面，本发明提供一种转化子，所述转化子包含本发明提供的上述植物胚乳特异性表达启动子、上述表达盒、上述重组载体、或上述宿主菌。

再一方面，本发明提供上述植物胚乳特异性表达启动子在培育转基因植物中的应用。具体而言，转基因植物的培育过程是：将本发明提供的上述植物胚乳特异性表达启动子连接于待表达的基因序列上游(例如，将所述启动子序列置于目标基因之前)，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。待表达的基因即目标基因包括用于改良植物品质和积累的基因以及植物营养吸收相关的基因。

并且优选地，可以利用所述应用来改良植物胚乳性状，所述植物为单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻；更优选地，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-pENP2，以用于改良水稻胚乳形状。

本发明中所提供的启动子的DNA序列为(与SEQ No：1中相同)：

需要说明的是：上述启动子的DNA序列中，序列开头以斜体并加粗表示的序列“taagcgaaag gaaatcaatg ttccac”为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列，共计16bp；序列末尾以斜体并加粗表示的序列“attggtgctgctgctactg tgt”获得启动子过程中使用的反向引物的留存序列(该留存序列与反向引物的相应序列互补)，共计12bp；而序列表中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的启动子。

更具体而言，本发明的发明人从日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)中分离克隆得到结构包括转录起始位点在内的约1700bp的DNA序列，并将其命名为pENP2(序列表中的SEQ ID No:1)。将该序列进行酶切后连接到植物双元表达载体pCAMBIA1391上，获得相应的重组质粒，利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行组织化学检测发现，转基因植株整体上的Gus基因表达水平相对较低，仅在胚乳处显蓝色，从而证明该约1700bp的序列具有驱动基因表达的活性，而且该启动子驱动的Gus基因在水稻胚乳中特异性表达。

本发明所述的启动子序列可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因链接，构建重组植物表达载体，重组植物表达载体经转化后可驱动靶标基因在胚乳中的特异性表达，从而提高外源靶标基因在植物胚乳中的表达量，增加转基因的效果，减轻外源靶标基因由于过量表达而对作物性状的影响。

有益效果

本发明提供的水稻启动子pENP2能够调控基因在胚乳中集中表达，在实际应用中具有显著价值。通过该启动子对农作物品种进行基因改造，如通过该启动子调控目标基因在胚乳中特异性表达，可以提高种子中稀有蛋白质、维生素和必需氨基酸的含量，提高稻米的营养价值和改善稻米的品质，从而培育出品质更加优良的稻米。

因此，该启动子在转基因作物开发中，可以提高和改善稻米的品质，从而培育出理想的、品质更加优良的稻米，由于其具有在胚乳中特异性表达的特征，可用其代替35S等组成型启动子，从而培育出理想的生物安全性高的转基因植物品种。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1A-1B为将pENP2启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中图1A为pCAMBIA1391示意图，图1B为pCAMBIA1391-pENP2示意图，其中示出了利用pENP2启动子驱动位于其下游的GUS基因表达；

图2为利用pENP2启动子驱动Gus基因表达的结果示意图，示出了pENP2：：gus转基因水稻植株各部位Gus染色结果，其中A表示植株幼苗，B表示根，C表示茎，D表示叶，E表示叶鞘，F表示花，G表示胚乳横切面；

图3为酶切验证的示意图。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

含有酶切位点的pENP2启动子的获得

步骤1、引物的设计

根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因组序列，依据水稻pENP2基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。

本实施例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1391(图1A，来自于CAMBIA，公开使用载体，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)为例，靶标基因为Gus基因，具体设计的引物为：正向引物(SEQ ID No:2)5’端带HindIII，酶切位点(AAGCTT)，反向引物(SEQ ID No:3)5’端带E.coRI，酶切位点(GAATTC)，引物序列如下：

正向引物：AAGCTTCGAAAGGAAATCAATGTTCCAC    HindIII

反向引物：GAATTCACACAGTAGCAGCAGCACCAAT    E.coRI

由深圳华大基因公司合成。

步骤2、启动子pENP2的获得

提取日本晴水稻的DNA，以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子pENP2，按常规PCR体系，采用如下扩增程序：

95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，进行35个上述循环；最后72℃延伸10min。

回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度约1700bp，将该目的片段连接到PGEM-T-Easy载体(购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合)上，按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞中，然后，经菌落PCR筛选获得包含目的片段的阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用HindIII和E.coRI进行双酶切验证，如图3所示。将经过鉴定的阳性克隆送交Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的启动子pENP2，其核酸序列如SEQID No:1所示。

植物表达载体的构建和农杆菌的转化

从上面获得的阳性克隆中提取质粒，用HindIII和E.coRI双酶切，回收启动子pENP2片段。同时利用HindIII和E.coRI对pCAMBIA1391载体进行线性化处理、回收pCAMBIA1391，将上述的pENP2片段和pCAMBIA1391片段用T4连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，由于pCAMBIA1391片段包含Gus基因，所以可以得到启动子pENP2与Gus基因融合的植物表达载体pCAMBIA1391-pENP2(图1B)，利用冻融法将该植物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)，从冻融法所得产物中提取阳性质粒，用HindIII和E.coRI进行酶切验证，验证结果如图3所示。

利用启动子pENP2驱动Gus报告基因在水稻中表达

步骤1：农杆菌介导的水稻遗传转化

成熟水稻种子去掉颖壳后，用70％酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween 20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％)溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀种子的沿糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11天后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌转化。

采用上述“植物表达载体的构建和农杆菌的转化”过程中转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等过程参照Yongbo Duan(Yongbo Duan，ChenguangZhai，et al.An efficient and high-throughput protocol for Agrobacteriummediated transformation based on phosphomannose isomerase positive selectionin Japonica rice(Oryza sativa L.)[J].Plant Cell Report，2012.DOI10.1007/s00299-012-1275-3.)等提出的方法。

共获得26株pENP2-1391植株(pENP2：：gus转基因水稻植株)。

步骤2、GUS组织化学染色

参照Jefferson(Jefferson RA等人.GUS fusion：β-Glucuronidase as asensitive and versatile gene fusion marker in higher plant[J].EMBO J.，1987，6:3901-3907)等提出的方法，将需要染色的组织抽真空，然后浸入染色液中，37℃染色24小时。脱色时在37℃条件下用95％乙醇处理，至阴性对照材料呈白色。

通过GUS组织染色，检测启动子pENP2在水稻转基因植株中对Gus基因的启动活性。结果显示，pENP2：：gus转基因水稻植株的胚乳经GUS染色后呈现蓝色，而其它部位组织无染色。结果说明，启动子pENP2能够驱动Gus基因在水稻胚乳中特异性高水平的表达，其结果见图2。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (7)

1.一种植物胚乳特异性表达启动子pENP2，其特征在于，所述植物胚乳特异性表达启动子pENP2的DNA序列为序列表SEQ ID No:1所示的序列，所述植物胚乳特异性表达启动子pENP2能够调控目标基因在胚乳中集中表达。

2.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含权利要求1所述的植物胚乳特异性表达启动子pENP2。

3.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包含根据权利要求1所述的植物胚乳特异性表达启动子pENP2。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为重组表达载体，在所述重组表达载体中，所述植物胚乳特异性表达启动子pENP2连接于待表达的基因序列的上游，所述待表达的基因为Gus基因；所述重组表达载体为pCAMBIA1391-pENP2。

5.一种转化子，其特征在于，所述转化子包含根据权利要求1所述的植物胚乳特异性表达启动子pENP2、根据权利要求2所述的表达盒、或根据权利要求3-4中任意一项所述的重组载体。

6.一种权利要求1所述的植物胚乳特异性表达启动子pENP2在培育转基因植物中的应用，所述植物为水稻。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，培育转基因植物包括：将权利要求1所述的植物胚乳特异性表达启动子pENP2连接于载体中的待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。