CN102016040A - 稻非胚乳组织表达启动子(OsTSP I)及其用途 - Google Patents

Abstract

分离的稻非胚乳组织表达启动子，OsTSP I，及其用途。该载体包括：在说明书中给出的1785bp(SEQ ID NO：1)的限定的序列、或它的片段或变体，或在严格条件下杂交至SEQ ID NO：1、或它的片段或变体上的核苷酸序列。OsTSP I的活性是由转基因方法来证实的。正如组织化学所确定，OsTSP I以组织特异的方式调节了GUS的表达，并且在多种胚乳组织中没有活性。该OsTSP I可以用作针对在稻以及其他农作物中基因表达的研究和控制的有力的工具。它对于安全的转基因食物例如稻的开发是特别有利的。

Description

稻非胚乳组织表达启动子(OsTSP I)及其用途

发明领域

本申请要求于2007年11月19日提交的CN 200710190007.4的优先权，通过引用将其全部内容明确地结合在此。

本公开总体上涉及稻非胚乳组织启动子及其用途。本公开进一步涉及用本发明的启动子所转化的植物，其中在所披露的启动子控制下的基因表达于非胚乳组织之中。

本发明的背景

基因工程技术已经导致了多种转基因植物物种和种类的发展。成功地工程化处理的植物物种类包括稻(Oryza sativa)。

然而，几个严重的问题可能限制了转基因植物的商品化和使用。转基因稻的商品化受到外源蛋白在胚乳中积累的阻碍。这种积累可能引起对食品安全的担心。仅仅在植物的非可食用部分中表达这些外源基因是解决这种问题的有效的方法。

通过利用基因启动子策略(即，使用诱导型、组织特异性或时间依赖的启动子)，这是要保证植物的可食用部分不含有这些外源基因表达的产物，并且因此降低对人类健康的潜在风险、并且促进转基因稻的商品化。

启动子是一段用于RNA聚合酶定位的DNA序列，通常上位于基因编码区的上游。一旦RNA聚合酶位于并结合到该启动子上，它可启动这些基因的转录。该启动子与该RNA聚合酶、连同其他反式作用元件(例如，蛋白辅助因子)的相互作用是基因表达控制模式的核心。通常上，存在着顺式作用元件(该启动子上游的特异DNA序列)，它们与转录因子相结合以便激活或抑制基因转录。启动子是多种基因的基因表达所必需的，并且它们的序列特征以及与多种特异性转录因子的相互作用决定了这些外源基因以及类似物表达的空间和时间的特点、以及表达强度。已知的组织特异性启动子包括：种子特异性启动子、果实特异性启动子、茎特异性启动子、叶肉细胞特异性启动子、根特异性启动子、以及类似启动子。已经在分子育种中使用的一些组织特异性启动子列于表1中。

表1在分子育种中常用的组织特异性启动子

组织	启动子来源	感兴趣的基因	植物	作者
					花药	烟草Ta29	Bar	烟草和油菜	Mariani(1990)

种子	菜豆凝集素基因PHA-L(phaseolusvulgaris agglutiningene)	αai(凝集素基因)	烟草	Altabella(1990)
					叶	PEPC(玉米PEP羧化酶基因)	Cry1A(b)	玉米	Kozial(1993)
韧皮部	稻蔗糖合酶基因RSs1	GNA(雪花莲凝集素)	烟草	Shi(1994)
					果实	子房组织(专利)	IPT(异戊烯基转移酶)	烟草	Martineau(1995)
果实	番茄2A12启动子	IPT(异戊烯基转移酶)	番茄	Mao  et  al.(2002)
					胚乳	玉米淀粉合酶基因GBS	GUS	玉米	Russell(1997)
根系	发根土壤杆菌rolD启动子	ACC(1-氨基-环丙烷-1-羧酸)脱氨酶基因	番茄	Varvara(2001)
					髓部(core)	玉米pGL2	Cry1A(b)	稻	Datta(1998)

本发明的概述

本公开提供了分离的核酸分子(多核苷酸)，该核酸分子(多核苷酸)具有植物核苷酸序列，该核苷酸序列指导了连接的核酸区段(例如，连接的植物DNA，它包括针对结构基因或调节基因的开放阅读框)在植物或植物细胞的非胚乳组织中的转录。该核苷酸序列优选地是从植物基因组DNA中获得或可分离的。

本公开还提供了植物启动子(具有植物核苷酸序列的分离的核酸分子)，该植物启动子指导了连接的核酸区段在宿主细胞(例如，植物细胞)的非胚乳组织中的组成型转录。该核苷酸序列优选地是从植物基因组DNA中获得或可分离的。特别是，该核苷酸序列是从稻基因中获得或分离的，它指导了连接的核酸区段仅仅在非胚乳组织中的转录。

本公开进一步提供了分离的核酸分子，该分离的核酸分子包括植物核苷酸序列，它指导了连接的核酸区段在植物非胚乳组织(即，根、茎、以及叶)中优选的转录。

本公开提供了植物启动子(分离的核酸分子)，特征为具有序列SEQ ID

NO：1。本公开的一些方面提供了稻、非胚乳组织启动子OsTSP 1。

在某些方面中，该植物核苷酸序列在高严格条件下杂交至序列SEQ ID

NO：1的互补序列上。在其他方面中，该植物核苷酸序列是长度为从大约25至大约2000个核苷酸的功能片段。

本公开提供了针对SEQ ID NO：1的限定的杂交条件。本公开的一些方面提供了高严格性的杂交条件，例如在65℃下在包括2X SSC(300mM

NaCl，30mM柠檬酸钠，pH 7.0)0.5％(重量/体积)SDS溶液的溶液中重复洗涤30分钟。本公开的一些方面提供了低严格性的杂交条件，例如在42℃下在包括2X SSC、0.5％(重量/体积)SDS溶液的溶液中重复洗涤30分钟。

本公开提供了稻、非胚乳组织表达载体，该表达载体包括稻、非胚乳组织启动子，该启动子被可操作地连接至该启动子的下游的感兴趣的基因(GOI)上。本公开的某些方面提供了该稻、非胚乳组织启动子，并且感兴趣的基因(GOI)被插到质粒中。优选地，该质粒是pCAMBIA 1305.1，其中花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子(CaMV 35S启动子)被OsTSP启动子替换。优选地，该感兴趣的基因是GUS转基因。非限制性的感兴趣基因可以包括：抗昆虫基因、抗细菌基因、抗真菌基因、抗病毒基因、抗线虫基因、抗除草剂基因、选择性标记基因、高产量基因、高品质基因、多肽的转录物、或RNA分子。

本公开提供了有效的方法以便通过在稻非胚乳组织(例如，叶和茎)中表达外源基因来促进转基因稻的商业化。在转基因稻中表达的外源蛋白的消费也许会带来对人体健康的潜在危险。本公开提供了将外源蛋白的表达限制在非胚乳组织中的手段，因此减少或消除对人体健康的危险。

本公开提供了保护植物对抗害虫同时限制暴露于人类的手段。该保护手段可以是在稻营养体、但不在胚乳组织中表达苏云金芽孢杆菌(BT)毒性蛋白。

本发明的又其他方面和优点由本领域内的普通技术人员从以下的详细说明中将会变得很清楚。该说明本质上应当被认为是说明性的而非约束性的。

附图简要说明

本发明当与附图相结合进行阅读时从以下详细说明中得到最佳理解。在附图中包括的是以下图：

图1显示了启动子OsTSP I以及用于扩增的PCR引物的序列。图1A显示了启动子OsTSP I的序列(SEQ ID NO：4)，该序列包含PCR引物序列，并且具有1811个碱基对。EcoRI位点：8-13，以及BamHI位点：1799-1804。图1B显示了启动子OsTSP I的PCR正向引物OsTSP I-F(SEQ ID NO：2)(包含EcoRI位点)。图1C显示了启动子OsTSP I的PCR反向引物OsTSP

I-R(SEQ ID NO：3)(包含BamHI位点)。

图2是确证启动子OsTSP I的功能的克隆示意图。

图3显示了来自稻组织的RT-PCR产物的电泳图谱。(a)来自稻的不同组织的总RNA提取结果显示所提取的总RNA可以用于这些实验，因为存在着清晰的18S和28S条带。(b)在来自稻的不同组织的、经DNase I处理的RNA的β-肌动蛋白内标物(internal standard)基因的PCR结果显示，DNA已经完全从该RNA样品中去除，因为所测试的6个组织的结果中均不存在β-肌动蛋白基因条带(158bp)。(c)内标物β-肌动蛋白在这些稻组织中的RT-PCR结果显示，在稻的全部组织中可以发现这种内标物基因。(d)由该候选启动子在稻组织中所驱动的基因(GI21104672)的扩增产物(143bp)的RT-PCR结果显示由该启动子驱动的基因在灌浆期过程中在除了胚乳之外的其他组织中表达。泳道：M：100bp DNA标记物，1：根，2：茎，3：叶，4：花，5：颖片，6：在灌浆期过程中的胚乳(开花期后10至15天)，7：DNA对照物。

图4显示了启动子OsTSP I的PCR产物的电泳图谱。使用所提取的日本晴(Nipponbare)的(针对Oryza sativa japonica种质的Gramene.org登录名)DNA为模板，用在图1B和图1C中给出的引物将该候选启动子克隆。泳道：M：DL2000DNA标记物，并且1：大约1800bp的PCR扩增产物。

图5显示了非胚乳组织特异性表达载体pOsTSP I-GUS的T-DNA区的结构。使用限制性内切酶HindIII和NcoI，将CaMV35S启动子从载体pCAMBIA1305.1中切除。在将末端补平并且用连接酶连接之后，产生了中间载体pCAMBIA1305.1(-)。然后，用EcoRI和BamHI对pGEM-OsTSP I进行双酶切(double-digeste)以产生OsTSP I片段。用载体pCAMBIA1305.1(-)将得到的OsTSP I片段重组，载体pCAMBIA1305.1(-)还已经被EcoRI和BamHI酶切以便获得载体pOsTSP I-GUS的表达。显示了pOsTSP I-GUS的T-DNA区的结构，P_35S：CaMV35S启动子，T_35S：CaMV终止子，Hyg：潮霉素抗性基因，和T_NOS：NOS终止子。

图6显示了这些转基因稻植物的PCR鉴定和确证。A：35S片段可以从这些35S-GUS转基因稻的植物中扩增出，但不能从非转基因稻的植物中扩增出。B：GUS片段可以从这些35S-GUS转基因稻的植物中扩增出，但不能从非转基因稻的植物中扩增出。C：GUS片段可以从这些OsTSP I-GUS转基因稻的植物中扩增出，但不能从非转基因稻的植物中扩增出。泳道：M1：50bp DNA标记物，M2：DL2000DNA标记物，P1：pCAMBIA1305.1(35S-GUS)，P2：pOsTSP I-GUS，CK(-)：非转基因对照物，并且1-20：转基因植物。

图7显示了阳性转基因稻的T₀代叶以及子代种子的胚乳的GUS组织化学染色结果。蓝色染色可见于35S-GUS转基因稻的叶和胚乳中，并且还可见于OsTSP I-GUS转基因稻的叶而非胚乳中。这些结果证明了由OsTSP I驱动的GUS基因的组织特异性表达，即非胚乳的表达特异性。A：35S-GUS转基因稻的T₀代叶以及子代种子的胚乳的GUS组织化学染色结果；B：OsTSP I-GUS转基因稻的T₀代叶以及子代种子的胚乳的GUS组织化学染色结果；并且C：非转基因植物作为阴性对照物。I：叶；并且II：成熟种子的胚乳。

定义

在说明本发明时，将采用以下术语，并且这些术语旨在如以下所指示进行定义。

术语“基因”广泛地用来指与生物学功能相关联的核酸的任何区段。因此，基因包括对于它们的表达所要求的编码序列和/或调节序列。例如，“基因”是指表达mRNA或功能性RNA、或编码特异性蛋白的核酸片段，并且它包括调节序列。基因还包括非表达的DNA区段，例如形成对于其他蛋白的识别序列。基因还可包括其他的5′和3′未翻译的序列以及终止序列。可能存在的其他元件是，例如内含子。基因可以获自多种来源，包括通过从感兴趣的来源进行克隆、或通过使用已知或预测的序列的合成，并且可以包括被设计成具有所希望的参数的序列。

“标记基因”编码可选择或可筛选的性状。

嵌合基因：重组DNA序列，其中启动子或调节DNA序列被可操作地连接至DNA序列上、或与其相关联，该DNA序列对mRNA进行编码或者该DNA序列被表达为蛋白，这样使得该调节DNA序列能够调节该相关联的DNA序列的转录或表达。该嵌合基因的调节DNA序列在正常情况下不被可操作地连接至该相关联的DNA序列上，如在自然界所发现。

相关联/可操作地连接：是指两种物理学上或功能上相关的DNA序列。例如，启动子或调节DNA序列据说是与对RNA或蛋白进行编码的DNA序列“相关联”的(若这两个序列被可操作地连接)、或被定位为使得该调节DNA序列将影响该编码或结构DNA序列的表达水平。

编码序列：转录成RNA(如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、有义(sense)RNA(正义RNA)、或反义RNA)的核酸序列。优选地，然后在有机体中对该RNA进行翻译以产生蛋白。

互补物：是指两种核苷酸序列，它们包括反向平行的核苷酸序列，一旦在这些反向平行的核苷酸序列中在这些互补碱基残基之间形成氢键则这些反向平行的核苷酸序列能够彼此配对。

表达：是指内源性基因或转基因在植物中的转录和/或翻译。例如，在反义构建体的情况下，表达可仅指该反义DNA的转录。

表达盒：核酸序列，该序列能够指导特定的核苷酸序列在适当的宿主细胞中的表达，包括可操作地连接至所感兴趣的核苷酸序列上的启动子，该核苷酸序列被可操作地连接至终止信号上。它还典型地包括该核苷酸序列的适当翻译所要求的序列。包括所感兴趣的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，这意味着其组分中的至少相对于它的其他组分中的至少而言是异源的。该表达盒还可以是自然发生的、但是已经按照用于异源表达的重组体形式来获得的表达盒。然而，典型地，该表达盒相对于该宿主而言是异源的，即该表达盒的特定的核酸序列不是自然地发生于该宿主细胞中，并且必须已经由转化事件(event)引入到该宿主细胞或该宿主细胞的祖细胞(ancestor)中。该核苷酸序列在该表达盒中的表达可以是在组成型启动子或诱导型启动子的控制之下，该组成型启动子或诱导型启动子仅在该宿主细胞暴露于一些特定的外部刺激物时才启动转录。在多细胞生物(如，植物)的情况下，该启动子还可以是对特定的组织、或器官、或发育阶段特异的。

异源性DNA序列：如在此使用的，术语“异源性DNA序列”、“外源性DNA区段”或“异源性核酸”，各自是指序列，该序列起始于对该特定的宿主细胞而言外来的来源、或若来自相同的来源则是从其原始形式进行修饰。因此，在宿主细胞中的异源基因包括基因，该基因对于该特定的宿主细胞而言是内源性的、但是已经通过例如使用DNA改组而被修饰。这些术语还包括自然发生的DNA序列的非自然发生的多个拷贝。因此，这些术语是指DNA区段，该DNA区段对于该细胞而言是外来的或异源的、或对于该细胞是同源的(但却在该宿主细胞核酸内的位置中，其中该元件通常不被发现)。表达外源性DNA区段以产生外源性多肽。

同源性DNA序列：DNA序列，该DNA序列与引入它的宿主细胞相关联。

同类编码：当核酸序列编码的多肽具有与由参比核酸序列编码的多肽相同的氨基酸序列时，该核酸序列与该参比核酸序列是同类编码的。

分离的：在本发明的背景中，分离的核酸分子或分离的酶是经人手而存在于其天然环境之外的核酸分子或酶，并且因此不是自然产物。分离的核酸分子或酶可以按照纯化的形式而存在、或可存在于非天然的环境(例如像，重组的宿主细胞)中。

天然的：是指基因，该基因存在于未转化的细胞的基因组中。

自然发生的：术语“自然发生的”用来说明物体，该物体可作为有别于由人类人工产生的那种在自然界中被发现。例如，存在于有机体(包括病毒)中的蛋白或核苷酸序列(它可以从自然界的来源中分离出，并且它尚未由人类在实验室中有意地修饰)是自然发生的。

GUS基因编码了GUS编码的β-葡萄糖醛酸酶(E.C.3.2.1.31)，该酶催化了种类繁多的自然的和合成的β-葡萄糖醛酸苷的水解。人工底物包括：对硝基苯基葡萄糖醛酸苷、4-甲基伞形酮基葡萄糖醛酸苷、以及5-溴-4-氯-3-吲哚基葡萄糖醛酸苷(X-Gluc)。

核酸：术语“核酸”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸以及它们的单股或双股形式的聚合体。除非确切地限制，该术语涵盖了包含已知的自然核苷酸类似物的核酸，它们具有与该参比核酸相类似的结合特性并且以与自然发生的核苷酸相类似的方式进行代谢。除非另外表明，特定的核酸序列还暗示性地涵盖它的保守地修饰的变体(例如，简并密码子取代)以及互补序列、以及连同明确地指明的序列。确切地，简并密码子取代可通过产生以下序列来实现，在这些序列中一个或多个所选(或全部)密码子的第三位置被经混合的碱基和/或脱氧肌苷残基取代成(Batzer et al.，Nucleic Acid Res.19：5081(191)；Ohtsuka et al.，J.iol.Chem.260：2605-2608(1985)；Rossolini et al.，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。术语“核酸”或“核酸序列”还可与基因、cDNA、以及由基因编码的mRNA互换地使用。在本发明的背景中，该核酸分子优选地是DNA区段。通过以下的标准缩写由核苷酸的碱基来指示这些核苷酸：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、以及鸟嘌呤(G)。

术语“开放阅读框”和“ORF”是指在编码序列的翻译起始和终止的密码子之间编码的氨基酸序列。术语“起始密码子”和“终止密码子”是指在编码序列中三个相邻的核苷酸(“密码子”)的单位，它对应地指明蛋白合成(mRNA翻译)的起始和链终止。

植物：任何完整植物。

植物细胞：植物的结构和生理学单位，包括原生质体和细胞壁。该植物细胞可以是处于分离的单细胞或经培养的细胞的形式、或作为较高等组织化的单位(例如像，植物组织、植物器官、或完整的植物)的一部分。

植物细胞培养物：植物单元(例如像，原生质体，细胞培养的细胞，在处于不同发育阶段的植物组织、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、接合子、以及胚中的细胞)的培养物。

植物材料：是指叶、茎、根、花或花的部分、果实、花粉、卵细胞、接合子、种子、切条、细胞或组织培养物、或植物的任何其他部分或产物。

植物器官：植物的不同且明显的结构化并且分化的部分，如根、茎、叶、花蕾、或胚。

植物组织：被组织成结构和功能单元的一组植物细胞。包括了在植物中或在培养物中的任何组织。本术语包括但不局限于：完整的植物、植物器官、植物种子、组织培养物以及被组织成结构和/或功能单元的植物细胞的任何组。本术语与如以上所列的任何特异类型的植物组织一起(或在其缺失时)的使用、或通过由这项定义所涵盖含的其他方式的使用并非旨在排除任何其他类型的植物组织。

“启动子”是指核苷酸序列，通常在它的编码序列的上游(5′)，它通过提供对适当的转录所要求的RNA聚合酶以及其他因子的识别来控制该编码序列的表达。“启动子”包括最小的启动子，该启动子是短DNA序列，该序列是由TATA盒以及其他多个序列(它们用来限定转录起始位点)构成，将调节元件加到该启动子上用于表达的控制。“启动子”也指核苷酸序列，该核苷酸序列包括最小的启动子加上多个调控元件，它能够控制编码序列或功能性RNA的表达)这种类型的启动子序列由近端以及更远端的上游元件组成，这些后者元件经常被称为增强子。因此，“增强子”是DNA序列，它可以促进启动子的活性并且可以是该启动子或插入的异源元件的固有元件以增强启动子的水平或组织特异性。它能够在两个方向(正常或翻转)上进行操作，并且甚至当移动到该启动子的上游或下游时还能够发挥作用。增强子以及其他上游启动子元件均结合了介导它们的作用的序列特异性DNA结合蛋白。启动子可以是全部衍生自天然基因、或由衍生自在自然界中发现的不同启动子的不同元件构成、或甚至由合成的DNA区段构成。启动子可能还包含参与蛋白因子的结合的DNA序列，这些蛋白因子控制了响应于生理学的或发育状况的转录起始的有效性。

“起始位点”是围绕着该第一核苷酸的位置，该第一核苷酸是经转录的序列的一部分，它还被定义为位置+1。相对于这个位置，对该基因的所有其他序列及其控制区域进行编号。对下游序列(即，在3′方向上的其他蛋白编码序列)进行正性命名，而对上游序列(在5′方向上的大多数控制区域)进行负性命名。

启动子元件，特别是TATA元件(它们是无活性的或者它们在上游激活作用不存在时具有大大降低的启动子活性)被称为“最小或核心启动子”。在适合的转录因子的存在下，该最小启动子发挥作用以允许转录。因此，“最小或核心启动子”仅仅由转录起始所需要的全部基础元件组成，例如，TATA盒和/或起始子。

最小启动子：启动子元件(特别是TATA元件)，它在上游激活作用不存在时是无活性的或具有大大降低的启动子活性。在适合的转录因子的存在下，最小启动子发挥作用以允许转录。

如在此所使用的，“表达盒”意思指DNA序列，该DNA序列能够指导特定的核苷酸序列在适当的宿主细胞中的表达，包括可操作地连接至感兴趣的核苷酸序列上的启动子，该感兴趣的核苷酸序列被可操作地连接至终止信号上。它还典型地包括该核苷酸序列的适当翻译所要求的序列。该编码区通常对感兴趣的蛋白进行编码，但是还可能对感兴趣的功能性RNA进行编码，例如在有义或反义方向上的反义RNA或非翻译性RNA。包括所感兴趣的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意思指它的多个组分中至少有一个组分相对于它的其他组分中的至少一个组分而言是异源的。该表达盒还可以是自然发生的、但是已经按照用于异源表达的重组体形式来获得的表达盒。该核苷酸序列在该表达盒中的表达可以是在组成型启动子或诱导型启动子的控制之下，该组成型启动子或诱导型启动子仅在该宿主细胞暴露于一些特定的外部刺激物时才启动转录。在多细胞生物的情况下，该启动子还可以是对特定的组织、或器官、或发育阶段特异的。

“载体”被定义为尤其包括：在双股或单股的线型或环型中的任何质粒、粘粒、噬菌体、或土壤杆菌二元载体，它们可以是或不是可自我传送的或可活动的，并且它们可以通过整合到该细胞的基因组中或存在于染色体外来转化原核或真核生物的宿主(例如，具有复制起点的自动的复制质粒)。

植物转化载体包括一种或多种用于实现植物转化的DNA载体。例如，在本领域内，利用包括超过一个邻接DNA区段的植物来转化载体是常见的做法在本领域内，这些载体经常被称为二元载体。

二元载体连同具有辅助质粒的载体是大多常用于土壤杆菌介导的转化的，其中达到有效转化所需要的DNA区段的大小和复杂性是相当大的，并且有利的是将多种功能在分开的DNA分子上分开。二元载体典型地包含质粒载体，该质粒载体包含：T-DNA转移(如左边缘和右边缘)所要求的顺式作用序列、经工程化处理以便能够在植物细胞中表达的选择性标记物、以及感兴趣的多核苷酸(即，经工程化处理以便能够在植物细胞中表达的多核苷酸，对此转基因植物的产生是令人希望的)。还在这种质粒载体上存在的是细菌复制所要求的序列。这些顺式作用序列以方式进行排列以便允许有效转移到植物细胞中并且在其中表达。例如，该选择性标记序列和所感兴趣的该序列位于该左边缘和右边缘之间。第二质粒载体经常包含介导T-DNA从土壤杆菌转移到植物细胞中的这些转移作用因子。这种质粒经常包含这些有毒的功能部分(Vir基因)，它们允许通过土壤杆菌来转染植物细胞，以及通过在边缘序列上切割来转移DNA、以及Vir介导的DNA转移，如在本领域内所理解(Hellens et al.，2000)。几种类型的土壤杆菌菌株(例如，LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105、等等)能用于植物转化。该第二质粒载体不是通过其他方法(如显微投射(microprojection)、显微注射、电穿孔、聚乙二醇、等等)将多核苷酸引入到植物中所必需的。

特别包括的是穿梭载体，穿梭载体一词是指DNA载体，该DNA载体自然地或经设计能够在两个不同的宿主有机体中复制，这些宿主有机体可以是选自：放线菌以及相关的物种、细菌和真核生物(例如，高等植物、哺乳动物、酵母或真菌细胞)。

优选地，该载体中的核酸是在适当的启动子或其他调节元件的控制之下、或与其可操作地相连接的，用于在宿主细胞中(如，微生物的，例如细菌的、或植物的细胞)进行转录。该载体可以是双功能的表达载体，它在多种宿主中发挥作用。在基因组DNA的情况下，这可以包含它所拥有的启动子或其他调节元件；而在cDNA的情况下，这可以是处于适当的启动子或其他的调控元件的控制之下，用于在该宿主细胞中表达。

“克隆载体”典型地包含一个或少量限制性核酸内切酶的识别部位(在这些位点上可以按照可确定的方式将外来DNA序列插入而没有损失该载体的实质性生物学功能)、连同标记基因(该标记基因适合用于鉴定并选择用该克隆载体所转化的细胞。标记基因典型地包括了提供四环素抗性、潮霉素抗性、或氨苄西林抗性的基因。

“组成型表达”是指使用组成型或受调节的(regulated)启动子的表达。“有条件的”和“受调节的表达”是指由受调节的启动子所控制的表达。

“组成型启动子”是指启动子，该启动子能够在所有或几乎所有的植物组织中在植物的所有或几乎所有的发育阶段过程中表达它所控制的开放阅读框(ORF)。这些转录激活元件各自没有展示出绝对的组织特异性，但是却在大多数植物部分中以水平来介导转录激活，该水平是大于或等于在该植物中的转录最有活性的部分中所达到的水平的1％。

“调节启动子”是指非组成型地、但是却以暂时地和/或空间地调节方式指导基因表达的启动子，并且包括组织特异性启动子以及诱导型启动子这两者。它包括自然序列以及合成序列、连同可能是合成序列与自然序列的组合的多个序列。不同的启动子可能在不同的组织或细胞类型中、或在不同的发育阶段、或响应于不同的环境条件来指导基因的表达。在植物细胞中有用的不同类型的新型启动子正不断被发现，许多实例可见于由Okamuro et al.(1989)的编辑物中。在植物中有用的典型的受调节启动子包括但是不局限于：安全剂诱导的启动子、衍生自四环素诱导系统的启动子、衍生自水杨酸盐(酯)诱导系统的启动子、衍生自醇诱导系统的启动子、衍生自糖皮质激素诱导系统的启动子、衍生自病原体诱导系统的启动子、以及衍生自蜕皮激素(ecdysome)诱导系统的启动子。

“组织特异性启动子”是指以下受调节的启动子，它们不表达于所有植物细胞中而是仅仅在特异器官(如，叶或种子)的一个或多个细胞类型、特异性组织(如，胚或子叶)、或特异的细胞类型(如，叶实质或种子存藏细胞)中。这些还包括可暂时调节的启动子，例如在胚形成的初期或晚期、在种子或果实发育的果实成熟期间、在叶子被彻底分化中、或在衰老的起始时。

“诱导型启动子”是指那些受调节的启动子，它们可以通过外部刺激(如，化学物、光、激素、应力、或病原体)而在一种或多种细胞类型中被启动。

原生质体：分离的植物细胞，没有细胞壁或仅具有部分的细胞壁。

纯化的：术语“纯化的”在应用于核酸或蛋白时，指示该核酸或蛋白是基本上不含在自然状态下与它相关联的其他细胞组分的。优选的是处于均匀状态，尽管可以处于干的或水性溶液中。纯度和均质性典型地是使用分析化学技术(如，聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法)来确定的。蛋白(它是在配备品中存在的主导种类)是基本上纯化的。术语“纯化的”指示核酸或蛋白在电泳凝胶中基本上产生了一个条带。特别地，这意味着该核酸或蛋白是至少约50％纯的、更优选地至少约85％纯的、并且最优选地至少约99％纯的。

重组DNA分子：使用重组DNA技术结合在一起的多个DNA分子的组合。

调节元件：参与控制核苷酸序列的表达的序列。调节元件包括可操作地连接至感兴趣的核苷酸序列和终止信号上的启动子。它们还典型地涵盖了适当翻译该核苷酸序列所要求的序列。

选择性标记基因：基因，该基因在植物细胞中的表达给予该细胞选择优势。用该选择性标记基因所转化的这些细胞所具有的选择优势可以是由于它们与非转化细胞的生长相比具有在阴性选择剂(如，抗菌素或除草剂)的存在下生长的能力。与非转化细胞相比，由这些转化细胞所具有的选择优势还可以是由于它们将添加的化合物用作营养素、生长因子、或能源的增强或新型能力。选择性标记基因还指基因或多种基因的组合，它在植物细胞中的表达给予该细胞阴性以及阳性的选择优势。

显著增加：在酶活性方面的增大，该增大比这种测量技术中固有的误差界限更大，优选是在该抑制剂的存在下该野生型酶的活性的大约2倍或更高的增加，更优选大约5倍或更高的增加，并且最优选大约10倍或更高的增加。

在两个或更多个核酸或蛋白序列的背景下，术语“同一的”或“同一性”百分数是指两个或更多个序列或子序列，这些序列或子序列当针对最大对应性进行比较和比对时是相同的或具有特定百分数的相同的氨基酸残基或核苷酸，正如使用以下序列比较算法之一或通过目测检查所测量。

基本上同一的：在两个核酸或蛋白序列的背景下，短语“基本上同一的”是指两个或更多个序列或子序列，这些序列或子序列当针对最大对应性进行比较和比对时具有至少60％、优选地80％、更优选地90-95％、并且最优选地至少99％的核苷酸或氨基酸残基同一性，正如使用以下序列比较算法之一或通过目测检查所测量。优选地，该基本上的同一性存在于整个具有长度为至少约50个残基的序列的区域中、更优选地在整个至少约100个残基的区域中，并且最优选地该序列在至少约150残基中是基本上同一的。在方面，这些序列在整个这些编码区的全部长度上是基本上同一的。此外，基本上同一的核酸或蛋白序列基本上执行相同的功能。

对于序列比较，典型地序列充当与试验序列进行比较的参比序列。当使用序列比较算法时，将测试和参比的序列输入到电脑中(若有必要，指定子序列坐标)，并且指定序列算法程序的参数。然后，这种序列比较算法基于所指定的程序参数来计算这个或这些测试序列相对于该参比序列的序列同一性百分数。

用于比较的序列的最佳比对可以按照以下方式进行，例如通过Smith&Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法、通过Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源比对算法、通过Pearson&Lipman，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)的相似性法的搜索，通过这些算法(Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，Wis中的GAP、BESTFIT、FASTA、以及TFASTA)的计算机化实施，或通过目测检查(总体上见Ausubel等人，下文)。

适合于确定序列同一性百分数以及序列相似性的算法的实例是BLAST算法，它说明于Altschul et al.，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)。执行BLAST分析的软件是通过the National Centerfor Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.go-v/)可供公众使用的。这种算法涉及首先通过识别在询问序列中长度为W的短字码来识别高得分的序列对(HSP)，它们在与数据库序列中的同样长度的字码进行比对时或者相配或者满足一些正性评分的阈值得分T。T被称为邻近字码得分阈(Altschul et al.，1990)。这些初始的邻近命中字码充当种子用于引起调查以发现包含它们的较长的HSP。然后，将这些命中字码在两个方向上沿着每个序列延长直到该累积的比对得分可以得到增加。对于核苷酸序列，使用参数M(对于一对匹配残基的奖赏得分；总是＞0)和N(对于错配残基的罚分；总是＜0)来计算累积的得分。对于氨基酸序列，使用得分矩阵来计算该累积的得分。这些命中字码在每个方向上的延伸当该累积的比对得分从它的最大获得值下降达到X数量时被停止，该累积的得分变为0或以下，这是由于一个或多个负得分残基比对的累积、或达到任一序列的末尾。BLAST算法的参数W、T、和X决定了该比对的灵敏度与速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字码长度(W)11、期望值(E)10、截止值100、M＝5、N＝-4、以及两股的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字码长度(W)3、期望值(E)10、以及BLOSUM62得分矩阵作为默认值(见Henikoff&Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))。

除了计算序列同一性百分数之外，BLAST算法还进行两个序列之间相似性的统计分析(见，例如Karlin&Altschul，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 90：5873-5787(1993))。由BLAST算法提供的相似性的测量是最小概率和(P(N))，它提供了在两个核苷酸或氨基酸序列之间会偶然发生的相配的概率的指示。例如，若在测试核酸序列与参比核酸序列的比较中该最小概率和是小于约0.1、更优选地是小于约0.01、并且最优选地是小于约0.001，则该测试核酸序列被认为是与该参比序列相类似的。

两个核酸序列是基本上同一的另一个指标是这两个分子在严格条件下彼此杂交。短语“特异地杂交至”是指当该序列存在于络合的DNA或RNA混合物(例如，总细胞的)中时，分子在严格条件下仅与特定的核苷酸序列相结合、双链化、或杂交。“基本上结合”是指在探针核酸与目标核酸之间的互补性杂交，并且包含少量的错配，这些错配可通过降低该杂交介质的严格性而适应，以达成该目标核酸序列的所希望的检测。

在核酸杂交实验的背景下(如，DNA印迹杂交和RNA印迹杂交)，“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”是序列依赖的，并且在不同的环境参数下是不同的。较长的序列特异地在较高的温度下进行杂交。对核酸杂交的广泛指导见于Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2″Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probeassays″Elsevier，New York。总体上，所选择的高严格杂交和洗涤条件将在大约5℃，低于该特异的序列在限定的离子强度和pH下的热解链点(T_m)。典型地，在“严格条件”下，探针将会与它的目标序列杂交，但不会与任何其他序列杂交。

T_m是50％的目标序列杂交到完全配对的探针上的温度(在限定的离子强度及pH下)。“极度严格条件”是选择为等于特定探针的T_m。针对互补核酸(它们在DNA或RNA印迹中在滤纸上具有超过100个互补的残基)的杂交的严格杂交条件的实例是具有1mg肝素的50％甲酰胺、在42℃下、将该杂交过夜进行。高严格洗涤条件的实例是0.15M NaCl在72℃下大约15分钟。高严格洗涤条件的实例是0.2x SSC在65℃下洗涤大约15分钟。通常，在高严格清洗之前会先进行低严格清洗，以除去背景探针信号。针对(例如)超过100个核苷酸的双链体的高严格洗涤条件的实例是在45℃下用SSC洗涤1次持续15分钟。针对(例如)超过100个核苷酸的双链体的低严格洗涤条件的实例是在40℃下用SSC洗涤4-6次持续15分钟。对于短探针(例如，大约10-50个核苷酸)，严格条件典型地涉及：小于约1.0M Na离子的盐浓度、典型地在pH 7.0-8.3下大约0.01-1.0M Na离子浓度(或其他盐类)，并且该温度典型地是至少约30℃。严格条件还可以用加入去稳定剂(如甲酰胺)来达到。总体上，在该特定的杂交测试中与对非相关探针所观测到的相比，2倍(或更高)的信噪比表明检测到特异性杂交的核酸，这些在严格条件下彼此不杂交的核酸若它们所编码的蛋白是基本上同一的，则它们仍然是基本上同一的。这(例如)在使用由该遗传密码允许的最大密码子简并时产生核酸的拷贝时发生。

“子序列”是指核酸或氨基酸的序列，这些核酸或氨基酸对应地包括核酸或氨基酸(例如，蛋白)的较长序列的一部分。

核酸在其他核苷酸(或其他的类似分子)被整合到该核酸中时被“延长”。最常见地，这是用聚合酶(例如，DNA聚合酶)来进行的，例如，在该核酸的3′末端加入序列的聚合酶。

当来自两种核酸中每种的序列在子代核酸中组合时，这两种核酸是“重组”的。当两种核酸都是用于重组的底物时，这两种序列被“直接”重组。当使用中间物(如，交联的寡聚核苷酸)将这些序列重组时，这两种序列被“间接重组”。对于间接重组，这些序列中不超过一种序列是用于重组的实际底物，并且在一些情况下这些序列都不是用于重组的底物。

转化：用于将异源DNA引入到宿主细胞或有机体的方法。

“转化的”、“转基因的”、以及“重组的”是指宿主有机体，例如其中引入了异源核酸分子的细菌或植物。该核酸分子可以被稳定地整合到该宿主的基因组中，或者该核酸分子还可以作为染色体外的分子而存在。这种染色体外的分子可以是自动复制的。可以理解，转化细胞、组织、或植物不仅涵盖了转化过程的最终产物，而且还涵盖了它的转基因子代。“非转化的”，“非转基因的”、或“非重组的”宿主是指野生型有机体，例如细菌或植物，它不包含该异源的核酸分子。

详细说明

引用这些图以展示以下实例。应当理解，本发明不是由此局限于在这些图中所描绘的那些方面。

本发明是通过结合以下实例来更加确切地展示的。在这些实例中，这些稻植物是由启动子OsTSP I所驱动的GUS基因进行转化的。本发明的方案示于图2。

1.启动子OsTSP I的分离和序列分析。

使用稻的基因芯片来分析在稻的灌浆期(grain-filing peroid)(开花期后10-15天)过程中根、茎、叶、花、颖片、以及胚乳组织中的启动子依赖的基因表达特性，并且用RT-PCR进行确证(图3)。首先，我们发现了OsTSP I，稻非胚乳组织表达启动子，它是通过PCR进行扩增的(图4)。将PCR扩增产物克隆到pGEM-T(Promega，Madison，WI)中，并且通过测序确定长度为1785bp。OsTSP I阳性克隆被命名为pGEM-OsTSP I。使用在线软件Neural Network Promoter Prediction来预测该启动子的核心序列和转录起始位点。OsTSP I核心序列很可能位于位置45bp-95bp、849bp-899bp、920bp-970bp、以及1423bp-1473bp，其对应地概率为0.80、0.86、0.97、以及0.99。真核启动子的总体特征提示OsTSP I转录起始位点(即，帽结构)是ATG之前的位置85上的A。使用启动子预测性软件PLACE的序列分析证明OsTSP I含有多个顺式作用元件。OsTSP I的这些主要调节元件示于表2中。

表2 OsTSP I序列的结构分析。

2.稻非胚乳组织表达载体pOsTSP I-GUS的构建。

通过用限制性内切酶HindIII和NcoI将CaMV35S启动子切除，补平末端、并且用连接酶将这些末端连接来对质粒pCAMBIA 1305.1(CAMBIA.ORG)进行修饰，它产生了中间载体pCAMBIA 1305.1(-)，然后用EcoRI和BamHI度对该中间载体进行限制性酶切。用EcoRI和BamHI对质粒pGEM-OsTSP I进行双酶切以产生OsTSP I片段，将该片段与EcoRI和BamHI限制性酶切的pCAMBIA 1305.1(-)进行重组以获得表达载体pOsTSP I-GUS。表达载体pOsTSP I-GUS的T-DNA区域的结构示于图5。

3.根瘤土壤杆菌介导的稻的转化。

对日本晴稻(“日本晴”是稻变种日本晴的Gramene.Org登录名)的未成熟胚进行诱导以形成大约12天开花期的初生愈伤组织，并且在两次传代之后用作受方材料。将如以上构建的重组pOsTSP I-GUS载体通过冷冻-融化法引入到根瘤土壤杆菌AGL1中，并与日本晴受方共培养。对转化体进行选择。将由天然的pCAMBIA 1305.1(35S-GUS)转化的日本晴用作阳性对照物，而非转化的日本晴作为阴性对照物。

4.转基因植物的PCR鉴定。

从叶中提取DNA，并且用作通过PCR来检测GUS基因的模板(图6)。

5.启动子OsTSP I的功能表征。

使PCR阳性转基因植物在大田生长。对来自15个样品植物、处于几个发育阶段的不同组织和器官针对GUS活性进行组织化学染色，以便表征启动子基因表达的组织特异性(表3和图7)。染成蓝色的组织对于GUS活性是阳性的，(+)；不染色的组织对于GUS组织(-)是阴性的。

表3 转基因稻的GUS组织染色

6.组织特异性表达启动子的选择。

6.1引物设计。使用以下给出的扩增条件对引物进行设计。这些引物是由上海生物工程公司合成的。

6.2引物序列和扩增条件。使用该启动子OsTSP I来表达基因GI21104672。使用正向引物5’-GAACAGTCCAGCAGCGTAA-3’(SEQ ID NO：2)、反向引物5’-CCACAGCCCACCATCATAC-3’(SEQ ID NO：3)、以及循环条件温度：94℃5分钟，94℃30秒，60℃30秒，72℃30秒，35次循环72℃7分钟来扩增该基因。

使用正向引物5’-TATGGTCAAGGCTGGGTTCG-3’(SEQ ID NO：7)、反向引物5’-CCATGCTCGATGGGGTACTT-3’(SEQ ID NO：8)、以及循环条件温度：94℃5分钟，94℃30秒，60℃30秒，72℃30秒，35次循环72℃7分钟来扩增该内在β-肌动蛋白基因(158bp)。

使用正向引物                               OsTSPI-F(EcoRI)：5’-GATCATCGAATTCGTCCGTTTCCGTTCGTTAAT-3’(SEQ ID NO：2)、反向引物                                        OsTSPI-R(BamHI)：5’-AGTCAGTGGATCCGAGGCCGAGCAGGGCAGAGC-3’(SEQ ID NO：3)、以及循环条件温度：94℃5分钟，94℃1分钟，56℃1分钟，72℃1.5分钟，35次循环72℃7分钟来扩增该启动子OsTSP I(1785bp)。

6.3从稻组织中提取总RNA。对在正常生长的稻的灌浆期过程的不同组织(包括：根、茎、叶、花、颖片、以及胚乳)提取总RNA。使用UNIQ-10TM总RNA提取和纯化试剂盒(Sangon，Shanghai，CN)通过柱色谱法来进行提取。

样品在液氮中研磨后被溶解。在液氮中对样品(高达100mg)进行研磨。在所得到的粉末转移到1.5ml离心管中之后液氮从其中挥发出来，从而确保该样品尚未融化。将RLT溶液(RLT是UNIQ-10^TM试剂盒的组分)(450μL)加到该样品中，并且通过剧烈振荡混合该混合物，并且允许通过在56℃下放置1-3分钟而溶解。优选地，具有高淀粉含量的样品应当在低温下溶解，否则可能形成附聚的团块。

使用UNIQ-10^TM柱使RNA不含污染物。将一部分已融化的样品与0.5倍体积的无水乙醇混合。将700μL部分的该样品(可能含有沉淀)负载到放置有2mL回收管的UNIQ-10^TM柱上，并且以8,000xg离心1min。将洗出液弃去。将该柱负载500μL RW溶液(UNIQ-10^TM试剂盒的组分)，允许在室温下放置1min，并且以10,000x g离心30秒。

通过以10000×g离心30秒，用500μL部分的RPE溶液(UNIQ-10^TM试剂盒的组分)对该柱洗涤两次。将这些洗出液弃去。通过以10000×g离心15秒，使该柱不含残余的RPE溶液。

将这些UNIQ-10^TM柱转移到多个1.5mL、无菌的、无RNA酶的离心管中。将DEPC-H₂O(30-50μL)(UNIQ-10^TM试剂盒的组分)加到该柱膜的中央，并且将这些柱在50℃下孵育2分钟。通过以8,000×g离心1分钟将RNA洗脱。所洗脱的RNA可以立即使用，或在-20℃下、或更低的温度下储存供稍后使用。通过电泳对所提取的RNA的质量进行评估。

6.4DNA的DNA酶I酶切。将RNA在反应体系中在冰上反应10-30分钟，该反应体系包括(以μl计算)RNA，5；DEPC-H₂O，3.5；10×DNA酶I缓冲液1(400mM TrisCl(pH 7.5，在25℃下)，80mM MgCl2，50mMDTT)；以及DNA酶I(10U/μL)，0.5。

6.5cDNA的第一链的合成。在无RNA酶的Eppendorf^TM(EP)管中对cDNA合成混合物进行反应，该cDNA合成混合物包括(以μL计算)：5份提取的总RNA，5；10mmol/L dNTPs，1；0.5μg/μL寡(dT)16份，1；以及足够的DEPC-H₂O以便将终体积补足至10μL。将该混合物在65℃下孵育5分钟，并接着在冰上放置1分钟。该cDNA反应补充有2μL10×缓冲液(Universal

cDNA Synthesis System，Promega，Madison，WI)、4μL25mmol/L MgCl₂、2μL 0.1mol/L DTT，并且加入了4μL无RNA酶的重组

Ribonuclease Inhibitor(Promega)。混匀后，将该混合物离心并且在42℃下在水浴中加热2分钟，然后补充1μL逆转录酶(200单位/μL，A-MLV，Promega，Madison，WI)。将该反应物混合并且在42℃下在水浴中加热50分钟，并接着在70℃下15分钟。将得到的产物储存在-20℃下直到使用。

6.6逆转录产物的PCR扩增。使用稻的β-肌动蛋白基因作为内标物，通过PCR对得到的cDNA进行扩增。将以下组分顺序地加到0.2ml EP管中：10×PCR I缓冲液(100mM Tris-HCl，pH 8.3在25℃下；500mM KCl；0.01％明胶)，2.5μL；MgCl₂(25mmol/L)，2.0μL；dNTP(2.0mmol/L)，2.0μL；引物-F(6.25μmol/L)[SEQ ID NO：7]，1μL；引物-R(6.25μmol/L)[SEQID NO：8]，1μL；Taq酶(5U/μL)(Shanghai Biological Engineering Corp.，China)，0.2μL；模板DNA(5ng/μl)，2.0μL；以及ddH₂O，14.3μL以便将该总体积补足到25μL。在以上列出的这些条件下将这些管内容物混合扩增。将这些PCR产物(2μL)与2μL负荷缓冲液(30％甘油，0.025％溴苯酚蓝)混合。这些扩增产物的片段长度是通过在2％的琼脂糖凝胶上以5V/cm的电泳来进行表征的。至少一个泳道包含标记DNA以充当大小的比较。用凝胶成像系统使电泳图显影。通过比较在它们控制之下所表达的DNA的大小，建立了这些不同的稻启动子的表达特征。

7.启动子OsTSP I的克隆和测序。

7.1稻基因组的提取与检测。稻基因组DNA的提取是通过改进的SDS方法来进行的。称取大约100mg的叶放入2.0mL的离心管中。加入液氮，并且用玻璃棒将该样品研磨成粉末。用700μLSDS提取缓冲液(100mmol/LTris-HCl(pH 8.0)、20mmol/L EDTA(pH 8.0)、500mmol/L NaCl、1.5％(重量/体积)SDS在60℃水浴中提取该粉末达1小时。按1∶1的体积比加入氯仿/异戊醇(24∶1)，并且将该混合物在室温下保持30分钟。在4℃下以12,000×g离心10分钟之后，将该上清液转移到干净的1.5mL离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇。在4℃下孵育30分钟之后，在4℃下以12,000×g离心10分钟之后将该上清液弃去。通过在4℃下以10,000×g离心5分钟，用70％乙醇将该小粒洗涤两次。将这些沉淀溶解于TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0)中，并且加入2μLRNA酶。将该TE溶液与2μLRNA酶(10mg/ml)在37℃的水浴中孵育30分钟，并接着在-20℃下储存直到使用。

7.2所提取的稻基因组DNA的质量和浓度的测定。将DNA溶液(2μL)在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳。所提取的DNA具有的OD260/OD280比率为1.8，并且浓度为300ng/μL。

7.3启动子OsTSP I基因的PCR扩增、检测、与回收。

7.3.1PCR扩增与检测。将以下组分顺序地加到0.2ml PCR管中(以μL计算)：10×PCR缓冲液(100mM Tris-HCl，pH 8.3在25℃下；500mM KCl；0.01％明胶)，(2.5)，MgCl₂(25mmol/L)(2.0)；dNTP(2.0mmol/L)(2.5)；OsTSP 1引物-F(6.25μmol/L)[SEQ ID NO：2，(1)；OsTSP 1引物-R(6.25μmol/L)[SEQ ID NO：3]，(1)；LA Taq酶(5U/μL)(0.4)；模板DNA(2)；以及ddH₂O(13.6)，总体积为25μL。该扩增操作如以上给出。将这些扩增产物进行电泳，并与标准DNA标记物进行比较。当扩增产物的大小具有预计的值时，将所合成的DNA从相应的条带中回收。

7.3.2PCR扩增产物的回收。用一把手术刀将含有所感兴趣的DNA的条带从该凝胶中切下，并且将其置入1.5mL的离心管中，其中每100mg琼脂凝胶(或100μL的DNA溶液)中具有400μL结合缓冲液(来自UNIQ-10试剂盒，Sangon，Shanghai，China)。将这些离心管在50-60℃水浴中间歇地振荡孵育10分钟，直到该凝胶完全溶解。将溶解的凝胶溶液转移到配置有2mL回收管的UNIQ-10TM柱(Sangon，Shanghai)上，在-20℃下冷却达2分钟，以8,000×g(室温)离心达1分钟，并且将该洗出液弃去。通过以8,000×g(室温)离心达1分钟以及一次最终离心(12,000×g达15秒)，用500μL等分部分的洗涤溶液(UNIQ-10试剂盒)将这些柱洗涤两次。将这些洗涤洗出液弃去。将这些柱放入洁净的1.5mL管中。将这些柱在室温下用30μL洗脱缓冲液(UNIQ-10试剂盒)或ddH₂O(pH＞7.0)平衡2分钟。通过以12,000×g离心1分钟将DNA洗脱。使产物冷冻储存在-2℃下。

7.3含有启动子OSTSP I基因的TA克隆载体的构建、测序和分析

7.3.1.启动子OSTSP I基因的产物与T载体的连接反应。10μL的反应混合物包括2×快速连接缓冲液(

载体系统试剂盒，Promega)，5μL；OsTSP PCR产物，3μL；T4DNA连接酶(3U/μL)，1μL；以及

载体，1μL；将该反应混合物以4,000rpm离心5秒，置于室温达5分钟，在冰上保持5分钟，并且贮存在-20℃冷冻机中。

7.3.2.大肠杆菌感受态的制备。挑出单克隆，将其接种于100mL LB(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl，10g/L)液体培养基中，并且在37℃下以200rpm振荡培养过夜。将10mL的等份部分接种于100mLLB液体培养基上，并且在37℃下以200rpm振荡培养2-3小时，直到该培养物达到0.3-0.4的光学密度(600nm)。将该培养物在冰上冷却20分钟，在4℃下以4000×g离心5分钟，弃去上清液。将这些小粒重悬于30mL 0.1M冰冷的CaCl₂中，并且在冰上孵育30分钟。在4℃下以4,000×g离心5分钟后，收集小粒，并且将其重悬于3mL 0.1M CaCl₂中。将该悬浮物在冰上孵育4-10小时，分装成200μL的等份部分，并且储存在-70℃下供以后使用、以及储存在4℃下供在一周内的更直接的使用。

7.3.3.转化与选择。将10μL等份部分的连接反应产物加到100μL感受态细胞悬浮液中，并且在冰上冷却30分钟。将该悬浮液在42℃水浴中热休克90秒，并且立即转移到冰上达3-5分钟。通过用1ml等份部分的LB液体培养基(不含Kan)通过补充该细胞悬浮液并且在37℃下振荡培养1小时，使表达质粒编码的卡那霉素抗性的细菌实现正常生长。将培养物以10,000×g离心1分钟，并且将100μL的该上清液涂布于含卡那霉素(50μg/mL)的盘上。将该盘正面向上放置30分钟以达到该细菌由该培养基的完全吸收。将该盘倒置并且在37℃下培养16-24小时。

7.3.4.重组质粒的鉴定。

克隆的PCR检测。如以上所给出，在0.2mL PCR管中制备PCR反应混合物。用无菌牙签挑取单克隆，并且将其与该PCR反应混合物进行混合。通过PCR对OSTSP I启动子的基因进行确定，由以上所详述。

该重组质粒的酶促鉴定。使用限制性内切酶EcoR1和BamH1通过酶促方法对阳性DNA克隆进行鉴定。限制性酶切是在37℃下在缓冲液中过夜进行的，该缓冲液包括(以μL计算)：pGEM-OsTSP I，15；BamH1，1；EcoR1，1；10×缓冲液K(Fermentas Company)，5；以及经蒸馏的去离子水。在0.8％的琼脂糖凝胶上通过电泳来检验这些产物，并且将其储存在4℃。该重组质粒被命名为pGEM-OSTSP I。对阳性克隆进行测序。

7.4.这些序列的同源性搜索和顺式作用元件分析。序列的同源性比对是使用互联网软件(BLASTn，National Center for Biotechnology)来进行的。使用在Fruitfly.org网站上的Plant CARE软件和在DNA.Affrc网站上的PLACE软件来分析OSTSP 1的顺式作用元件。

8.GUS植物表达载体的构建。

8.1重组质粒的制备。利用HindIII和NcoI在37℃下通过限制性酶切过夜将质粒pCAMBlA 1305.1双剪切以去除调节GUS的内源性CaMV35S启动子。限制是在缓冲液中进行的，该缓冲液包括(以μL计算)：pCAMBIA1305.1，15；HindIII，1；NcoI，1；10×缓冲液K，5；以及经蒸馏的去离子水，28(总体积为50μL)。将切后的质粒在12℃下在20μL的缓冲液中通过用连接酶处理20分钟来补平末端并且环化，该缓冲液包括(以μL计算)：pCAMBIA 1305.1(HindIII/NcoI)，13；10×T4DNA聚合酶缓冲液(Promega)，2；10％牛血清白蛋白(BSA)，2；2mM dNTPs，2；以及T4DNA聚合酶，1。聚合酶在75℃下被灭活。在50μL的缓冲液中利用EcoRI和BamHI对质粒pCAMBIA 1305.1(-)和pGEM-OsTSP1进行对应地双酶切、在37℃下过夜，该缓冲液包括(以μL计算)：pGEM-OsTSP I或pCAMBIA1305.1(-)，15；EcoR1，1；BamH1，1；10×缓冲液K，5；以及经蒸馏的去离子水，28。将这些感兴趣的片段对应地回收并且在20μL的缓冲液中由T4DNA连接酶在16℃下连接过夜，该缓冲液包括(以μL计算)：pCAMBIA1305.1(-)/EcoR1+BamH1，8.5；pGEM-OsTSP□(I)/EcoR1+BamH1，8.5；10×连接酶缓冲液，2；以及T4DNA连接酶，1。将这些连接的片段转化到大肠杆菌JM109中。大肠杆菌感受态细胞的制备与转化如以上所说明。

8.2重组质粒的鉴定。PCR克隆是如以上所说明来进行的。将多个阳性克隆转接到包含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中并且振荡在37℃下培养过夜。提取这些质粒并且通过酶促消化和测序进行确证。该目标重组质粒被命名为pOsTSP I-GUS。

8.3由该重组质粒转化土壤杆菌。

8.3.1制备土壤杆菌AGL1感受态细胞。将土壤杆菌AGL1单克隆接种于5mL的含相应抗生素的YEP培养基中(酵母提取物，10g/l；蛋白胨，10g/l；氯化钠，5g/l；pH 7.0)，并且在28℃下以200rpm振荡培养过夜。将2ml的等分部分转移到50ml YEP液体培养基中，并且在28℃下以200rpm振荡培养直到OD₆₀₀达到0.5-1.0。将这些培养物转入无菌的离心管中，并且在冰上保持30分钟。在4℃下通过以5,000×g离心5分钟来收集这些细胞。使这些细胞小粒重悬于1mL冰冷的20mmol/L的CaCl₂溶液中。这些感受态细胞可以立即使用，或可以在4℃下储存为在无菌Eppendorf管中的200μl的等分部分用于48小时内使用。

8.3.2土壤杆菌AGL1的转化。将土壤杆菌AGL1感受态细胞短暂离心并且保持在冰上。将重组pOsTSP I-GUS质粒(1ng)加到100μl的感受态细胞中。将这些质粒与感受态细胞轻柔混合，并接着在冰上保持30分钟。将该混合物在液氮中冷冻5分钟，然后在37℃水浴中融化5分钟。加入LB液体培养基(900μl)，并且将该混合物在28℃下以200rpm振荡培养4-5小时。将这些细胞以8,000×g离心1分钟。使这些小粒化的土壤杆菌属细胞重悬于100μl的上清液中，并且涂布于包含LB培养基(补充有40μg/ml卡那霉素和25μg/ml利福平)的培养皿上。在28℃下培养2天后，将合适大小的单克隆接种到YEB液体培养基中，并且在28℃下振荡培养直到OD₆₀₀达到0.4-0.6。所得到的培养物可用于稻的转化和共培养。

9.在稻中土壤杆菌介导的表达载体的转化。

9.1愈伤组织的诱导和传代培养。将成熟或未成熟的稻种用70％酒精表面消毒1.5分钟，之后跟随在28℃下通过将含有一滴Tween-20的20％次氯酸钠的溶液振荡45分钟来进行深层消毒。将这些种子在ddH₂O被彻底洗涤，直至洗涤水澄清，并接着在25℃下在诱导培养基上暗培养约3周。将诱导的愈伤组织转接到新鲜的诱导培养基上进行第一次传代培养。每3至4周重复传代培养。两次传代培养之后，这些胚性愈伤组织是脆的、鲜黄色的、并且3-5mm长，用于下一步共培养。

表4  遗传转化培养基

NB培养基：

2830mg/L KNO₃；463mg/L(NH₄)₂SO₄；400mg/L KH₂PO₄；

185mg/L MgSO₄.7H₂O；166mg/L CaCl₂.2H₂O；27.8mg/L FeSO₄.7H₂O；

37.5mg/L Na₂EDTA；10mg/L MnSO₄.4H₂O；3mg/L H₃BO₃；

2mg/L ZnSO₄.7H₂O；0.25mg/L Na₂MoO₄.2H₂O；0.025mg/LCuSO₄.5H₂O；

0.025mg/L CoCl₂.6H₂O；0.75mg/L KI；

10mg/L维生素B 1(盐酸硫胺素)；

1mg/L维生素B6(盐酸硫胺素)；

1mg/L烟酸；100mg/L肌醇。

10.2愈伤组织与根瘤土壤杆菌的共培养。将生长旺盛的稻的胚性愈伤组织置于无菌培养皿中，并且振荡加入新鲜的土壤杆菌(OD₆₀₀0.4-0.6)。共培养1小时后，将这些愈伤组织去除，并且将在无菌滤纸上吸除残余的培养基。将这些愈伤组织转移到共培养培养基中，并且在25℃下暗培养2-3天。

10.3去除土壤杆菌。共培养2-3天后，在这些愈伤组织上可观察到一些土壤杆菌菌斑。将这些愈伤组织挑出，置于无菌烧瓶中，并且通过在含有250rng/L羧苄西林的无菌水中振荡来进行彻底洗涤(extensively wash)，直至在洗涤水中看不到丝状菌体。使这些愈伤组织继续浸没在洗涤水中达1小时以允许贴壁的土壤杆菌从这些愈伤组织脱附。将这些愈伤组织在25℃在包含500rng/L的羧苄西林的无菌水中下以120rprn进一步振荡2小时。将这些愈伤组织去除，并且在无菌滤纸上吸干。

10.4抗性愈伤组织的选择。将这些愈伤组织转移到选择培养基上，并且在25℃下暗培养，用土壤杆菌污染进行周期性检查。每两周重复传代培养。4-8周后，多数愈伤组织死亡，如褐色外观所指明。有少数瘤状(抗性)愈伤组织从褐色的愈伤组织表面长出，使它们在选择培养基上传代培养。将完全长大的愈伤组织转移到分化培养基中。

10.5抗性愈伤组织的分化培养。将抗生素抗性的愈伤组织转移到分化培养基中，并且在26℃下暗培养1周，之后跟对在25℃上的光照培养(16小时光照/8小时黑暗)。

10.6转基因植物的再生和幼苗移植。转移到分化培养基上的愈伤组织组织在培养2周后开始转绿，并且3周后发芽并生根。当再生的小苗长至2-3cm时，将它们转移到生根培养基上并且光照培养。当它们长至7-10cm时，在开口烧瓶中使它们在温室中培育5-7天。当这些小苗生长健壮后将它们从培养瓶中移出，并且将根上的培养基洗去。将这些小苗移至高湿度的温室进行盆裁，以确保它们的成活率。

11.转基因植物的PCR鉴定。

从这些再生植物的叶子中提取DNA，并且将其作为模板，并如以上所说明使用表5的条件用于PCR鉴定。

表5引物和扩增条件

12.组织化学染色用于GUS的定位

12.1.阳性转基因植物(T₀)的移植。将经PCR确证的阳性转基因植物移植于大田。取15株苗期植物样品，在每个样品的根、茎、叶、以及器官组织上进行GUS活性的组织化学染色。在不成熟的植物胚乳(在开花后16天)和成熟的植物胚乳(在开花后30天)上也进行GUS活性的组织化学染色。未转基因的稻用作阴性对照物。

12.2.GUS染色操作。样品在37℃下在反应液(表6)中孵育2至6小时。通过在室温下在70％乙醇孵育5小时，叶绿素从绿色组织中去除。将该步骤重复几次，直到所有的叶绿素都被去除。反应溶液制备如下：将X-Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸环己基铵盐)搅拌溶于N，N-二甲基甲酰胺，并接着将0.1mol/L磷酸盐缓冲液，5mmol/L铁氰化钾和5mmol/L亚铁氰化钾搅拌加到X-Gluc溶液中。最后，加入Triton X-100。这种溶液应当在制备之后立即使用。

表6  反应溶液：X-Gluc溶液

Claims (22)

1.分离的启动子，包括分离的多核苷酸，该多核苷酸具有选自下组的序列：SEQ ID NO：1和在规定的严格性条件下与SEQ ID NO：1杂交的序列。

2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述条件是低严格性。

3.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述条件是高严格性。

4.如权利要求1所述的启动子，其中所述启动子驱动可操作地连接的基因在植物非胚乳组织中的转录。

5.表达盒，包括：

启动子，该启动子包括分离的多核苷酸，该多核苷酸具有选自下组的序列：SEQ ID NO：1和在规定的严格性条件下与SEQ ID NO：1杂交的序列；和，

可操作地连接至所述启动子的编码区域，其中所述启动子显示了在由所述表达盒转化的植物的非胚乳植物组织中的转录活性。

6.根据权利要求5所述的表达盒，其中将所述多核苷酸序列以有义方向插入该表达盒之中。

7.根据权利要求5所述的表达盒，其中将所述多核苷酸序列以反义方向插入该表达盒之中。

8.根据权利要求5所述的表达盒，其中所述启动子驱动该编码区域在由该表达盒转化的植物的非胚乳组织中被转录和表达。

9.表达载体，包括：

表达盒，该表达盒进一步包括：

启动子，该启动子包括分离的多核苷酸，该多核苷酸具有选自下组的序列：SEQ ID NO：1和在规定的严格性条件下与SEQ ID NO：1杂交的序列；和，

可操作地连接至所述启动子的编码区域，其中所述启动子显示了在由所述表达盒转化的植物的非胚乳植物组织中的转录活性。

10.根据权利要求9所述的表达载体，其中所述载体包括选自下组的核酸构建体：质粒、粘粒、噬菌体、和二元载体。

11.根据权利要求10所述的表达载体，其中所述二元载体是土壤杆菌属二元载体。

12.引物，包括选自下组的核酸分子：SEQ ID NO：OsTSP I正向引物和SEQ ID NO：OsTSP I反向引物。

13.引物，包括核酸分子，该核酸分子驱动SEQ ID NO：OsTSP I的PCR扩增。

14.根据权利要求5所述的表达盒，其中将所述盒稳定地并入植物基因组之中。

15.根据权利要求9所述的表达载体，其中将所述载体稳定地整合到植物基因组之中。

16.植物，包括由外源启动子稳定转化的至少一个植物细胞，该外源启动子包括外源多核苷酸，该外源多核苷酸具有选自下组的序列：SEQ ID NO：1和在规定的严格性条件下与SEQ ID NO：1杂交的序列。

17.植物，包括由表达盒稳定地转化的至少一个植物细胞，该表达盒进一步包括：

启动子，该启动子包括外源的多核苷酸，该外源的多核苷酸具有选自下组的序列：SEQ ID NO：1和在规定的严格性条件下与SEQ ID NO：1杂交的序列；以及，

可操作地连接至所述启动子的编码区域，其中所述启动子显示了在由所述表达盒转化的植物的非胚乳植物组织中的转录活性。

18.植物，包括由表达载体稳定转化的至少一个植物细胞，该表达载体包括：

表达盒，该表达盒进一步包括：

启动子，该启动子包括分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸具有选自下组的序列：SEQ ID NO：1和在规定的严格性条件下与SEQ ID NO：1杂交的序列；和，

可操作地连接至所述启动子的编码区域，其中所述启动子显示了在由所述表达盒转化的植物的非胚乳植物组织中的转录活性。

19.植物种子，包括如权利要求1所述的启动子。

20.植物种子，包括如权利要求5所述的表达盒。

21.植物种子，包括如权利要求9所述的表达载体。

22.转基因植物细胞、组织、器官、或种子，包括根据权利要求5所述的表达盒，其中所述编码区域编码抗昆虫蛋白、抗细菌蛋白、抗真菌蛋白、抗病毒蛋白(或多肽产物或RNA分子)、抗线虫蛋白、抗除草剂蛋白、或选择性标记蛋白。

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