CN104342441A - 一种植物非胚乳表达启动子safe s1及其获取方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种植物非胚乳表达启动子，所述植物非胚乳表达启动子SAFE S1包含SEQ ID No:1所示的DNA序列或其同源物、衍生物。本发明的启动子能够驱动外源基因表达，却可以使外源基因在胚乳部位不表达，因此，可以保证水稻的食用部分不含有外源基因表达的产物，降低其对人类健康带来的潜在风险，这对消除公众对转基因水稻的疑虑和偏见是非常有利的，进而有利于促进转基因产品最终实现商品化应用于生产。在应用中，本发明可以与具有改善植物的非胚乳部位性状能力的基因结合使用，将本发明的启动子与性状改善基因相连接导入植物中，并驱动性状改善基因在植物的根、茎、叶或其他部位表达，却并不会影响胚乳的外源基因表达量。从环境安全和食品安全两个角度来讲，本发明的启动子都是具有极高商业价值的。

Description

一种植物非胚乳表达启动子SAFE S1及其获取方法

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种获取植物非胚乳表达启动子及相应获取方法，该启动子能够用于在水稻转基因调控体系中驱动目标基因在非胚乳部位表达。

背景技术

转基因技术(Genetically Modified)是20世纪发展起来的一种新的生物技术，是指运用科学手段从某种生物体中提取所需要的基因，将其转入另一种生物中，使其与另一种生物的基因进行重组，再从结果中进行数代的人工选育，从而获得特定的具有变异遗传性状的物质。

与杂交不同，转基因技术可以创造新染色体，改变动植物性状，培育新品种，也可以利用其它生物体培育出期望的生物制品，用于医药、食品等方面。转基因按照途径可分为人工转基因和自然转基因，按照对象可分为植物转基因和动物转基因。

目前人们所应用的转基因技术主要是将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰。

植物转基因是基因组中含有外源基因的植物。它可通过原生质体融合、细胞重组、遗传物质转移、染色体工程技术获得，有可能改变植物的某些遗传特性，培育高产、优质、抗病毒、抗虫、抗寒、抗旱、抗涝、抗盐碱、抗除草剂等的作物新品种。

水稻是最重要的农作物之一，全世界有三分之一以上的人口以稻米为主粮。在过去的20多年里，转基因水稻的研究取得了巨大的进步，不仅建立了成熟的遗传转化体系，而且获得了一大批有应用潜力的转基因材料。此外，随着拟南芥、水稻等模式植物功能基因组研究的全面展开，一大批具有重要功能的基因被发现和克隆，极大地丰富了转基因水稻研究可以利用的基因资源。但是转基因水稻的研究在许多方面上还有待进一步的发展。首先，在遗传转化技术上还不够成熟。其次，在转基因水稻研究上，可用的基因资源相对缺乏仍然是一个比较突出的问题。比如在转基因抗虫水稻性状改良方面，缺乏可以有效控制稻飞虱的抗性基因；在水稻病害方面，还缺乏抗水稻纹枯病的主效基因；在水稻营养高效利用特别是氮高效利用方面也尚未发现好的主效基因或QTL等等。基因资源的缺乏在很大程度上限制了转基因水稻新品种的培育。再次，转基因技术对于改良复杂性状还受到很大的限制。比如抗旱和C4水稻的培育，虽然导入个别的外源基因可以看到一定的效果，但是，目前取得的进展离理想的目标尚有较大的距离。

我们需要看到的是，转基因技术被认为是人类解决土地资源锐减和人口急剧膨胀这一矛盾最有效的方法之一，但由于该技术开发和利用的时间较短，人类对其生物安全性认识十分有限，在科学界和社会公众中，很多人对植物转基因技术的安全性心存顾虑。人们的顾虑主要表现在：①外源基因的引入可能对生物体本身有毒害作用。②外源基因可能对生态环境和生物多样性带来不利的影响。③转基因食品对人类健康的潜在危害。如一些杀虫、抗菌基因以及过敏蛋白可能危害人类健康，以及抗生素抗性基因逃逸到人类病原微生物中构成的潜在危险等等。

水稻作为主要的粮食之一，水稻食用部位精米即胚乳。在转基因水稻中尤以外源蛋白在胚乳中的积累及其可能造成的食用安全风险，成为制约商业化进程的重要因素。针对这一问题，利用启动子策略即选用诱导型、组织特异性及时间依赖型启动子，使外源基因只在非食用部分表达，保证食用部分不含有外源基因表达的产物，降低其对人类健康带来的潜在风险，是促进转基因水稻的商业化进程的一条有效途径。目前，已发现的非胚乳表达的启动子主要包括茎特异性启动子、叶肉细胞特异性启动子、根特异性启动子等等。如shi等发现的在韧皮部特异性表达的启动子RSs1；美国农业部研究局Roger Thilmony领导的作物改良与利用研究小组近日发现一种组织特异性启动子LP2，其属于光合作用组织中的受体基因，在转基因水稻的叶中高度活跃，在种子和花中未被检测到；Varvara等发现的发根农杆菌的rolD启动子，仅在根中表达并转入到目的植物番茄中。目前，在国内研究中，非胚乳表达启动子的发明鲜有报道，仅见于杨剑波等发明的水稻非胚乳表达启动子OsTSP I即只在水稻非胚乳组织(根、茎、叶等)中表达，在胚乳中不表达。以及Meng Cai等发现的仅在水稻绿色组织部位表达的启动子PD540。

如果转基因水稻不能最终实现商品化应用于生产，那么再好的研究成果也没有任何应用价值。针对以上问题，目前需要大力开展功能基因组的研究，大量挖掘和分离具有实用价值的非胚乳表达启动子，消除公众对转基因水稻的偏见和顾虑。为了消除公众的疑虑，尽量减少食用部分的表达含量是至关重要的，因此，人们迫切需要找到并提取出更多能诱导外源基因在胚乳部位不表达的启动子，降低胚乳部分外源基因的表达量。

发明内容

本发明的目的是提供一种非胚乳表达启动子以及相应获取方法。

具体而言，本发明提供一种植物非胚乳表达启动子SAFE S1，所述植物非胚乳表达启动子SAFE S1包含SEQ ID No:1所示的DNA序列或其变体、同源物或衍生物。序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列为来源于日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)的水稻非胚乳表达启动子，本文中称为SAFE S1或启动子SAFE S1。优选地，本发明提供的植物非胚乳表达启动子的DNA序列为SEQ ID No:1所示的序列，即SAFE S1或启动子SAFE S1。

另一方面，本发明提供一种表达盒、重组表达载体或转化子，其特征在于，所述表达盒、重组表达载体或转化子包含权利要求3中所述的植物非胚乳表达启动子。在所述重组表达载体中，所述植物非胚乳表达启动子连接于待表达的基因序列的上游；优选地，待表达的基因为具有改善植物，尤其是水稻在非胚乳部位的性状能力的基因。更优选地，该重组表达载体为将SEQ ID No:1所示的序列即SAFE S1或启动子SAFE S1构建于pCAMBIA1391中得到的重组表达载体，本文中称为pCAMBIA1391-SAFES1

本发明还提供一种上述启动子在改善植物非胚乳部位的性状方面的应用。所述植物非胚乳表达启动子SAFE S1用于驱动外源基因在植物非胚乳部位表达。所述植物为单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。

所述启动子采用如下方法获得：

步骤(1)制备正向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；

步骤(2)制备反向引物，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示；

步骤(3)以水稻品种日本晴的DNA序列为模板，利用所述正向引物和所述反向引物，采用KOD-plus高保真DNA聚合酶对日本晴的DNA序列中的一目的片段进行PCR扩增，该目的片段的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示；

步骤(4)对所述目的片段进行加A并连接PGEM-T-Easy载体；

步骤(5)，利用该载体转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞中；

步骤(6)挑取单克隆摇菌液提质粒，用SalI和EcoRI引物进行双酶切验证，将经过鉴定的阳性克隆进行测序，验证正确的克隆即为所要获得的目的片段——启动子SAFE S1，其核酸序列如SEQ ID No:1所示；

步骤(7)，利用AXYGEN胶回收试剂盒回收所述目的片段。

本发明中所提供的启动子的DNA序列如SEQ ID No：1所示，需要说明的是：SEQ ID No：1中，序列开头部分的“TGGCTGATAAGCATAAGGATAA”为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列，共计22bp；序列末尾部分的“AGAAACAAGCCTAGAGAGTACT”为获得启动子过程中使用的反向引物的留存序列(该留存序列与反向引物的相应序列互补)，共计22bp；该DNA序列中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。

本发明的发明人利用SEQ ID No:2所示的正向引物以及SEQ ID No:3所示反向引物从日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)中分离克隆SAFE S1(LOC_Os09g36680)基因上游包括转录起始位点在内的2021bp的DNA序列，并对其进行了验证。

技术效果

本发明的启动子SAFE S1可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。该启动子SAFE S1能够调控基因在植株中的非胚乳部位集中表达，在实际应用中具有显著价值。胚乳是水稻的食用部分，由于本发明的方法所获取的启动子不会在胚乳部位发生表达，因此，通过该启动子驱动外源基因在植物中表达，可以保证食用部分不含有外源基因表达的产物，降低其对人类健康带来的潜在风险，更有利于转基因品种的推广应用。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为获取本发明启动子的过程的流程示意图。

图2为将SAFE S1启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，图2中A为pCAMBIA1391示意图，B为pCAMBIA1391-SAFE S1示意图，其中示出了利用SAFE S1启动子驱动位于其下游的GUS基因表达；

图3为对本发明的启动子进行酶切验证的结果示意图。

图4为利用SAFE S1启动子驱动Gus基因表达的结果示意图。

图中所示即SAFE S1：：gus转基因水稻植株各部位Gus染色结果，其中a表示根，b表示茎，c表示叶鞘，d表示叶，e表示胚乳横切面；GUS染色在转基因植株的非胚乳部位明显表达。(标尺＝1cm)。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

含有酶切位点的SAFE S1启动子的获得

1、植物材料

日本晴水稻的成熟种子，由安徽省农科院水稻所生技室保存。

2、菌株及质粒

本研究所用大肠杆菌菌株为XL1-blue；根癌农杆菌为EHA105，安徽省农科院水稻所生物技术室保存；植物表达载体pCAMBIA1391购自澳大利亚CAMBIA公司。

3、试剂与药品

次氯酸钠(NaClO，有效氯浓度4％)，Tween20购自Sigma公司。潮霉素B购自Roche公司；质粒DNA提取采用Axygen质粒小提试剂盒；DNA片段回收试剂盒购自TIANGEN公司。引物合成和测序由北京六合华大基因科技股份有限公司完成；KOD高保真聚合酶和定量PCR试剂盒购自大连TaKaRa宝生物技术有限公司；PEASY-Tsimple和DNA marker-Trans2K购自Transgen公司；限制性内切酶购自NEB公司；T4DNA连接酶购自Promega公司。

4、基因克隆

根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)SAFE S1(LOC_Os09g36680)基因序列设计引物，以目的片段的DNA为模板，采用KOD-plus高保真DNA聚合酶进行PCR扩增。反应体系和程序如下：

上面所列左侧为所添加试剂，右侧为反应条件和时间。

然后，回收片段大小和目的基因片段长度大小相近的片段，进行加A并连接T载体，用于后续转化大肠杆菌XL1-blue。

5、转化

(1)准备LB(不含抗生素)和X-gal固体培养基。(每板(指每个具有样品的培养皿)涂浓度为20mg/mL的X-gal 40μl，24mg/mL的IPTG 160μl，室温下放置2-3h)；

(2)从-80℃冰柜中取出大肠杆菌XL1-blue感受态细胞，冰浴中融化。在无菌的1.5mL Eppendorf中加入2μl连接产物(上述步骤(4)中连结T载体后的产物)，其中一管加入2μl H₂O作为对照。取50μl感受态细胞与连接产物轻轻混匀，冰浴中放置20min。

(3)对上述混合物42℃热击90s，然后立即冰浴2min。加入950μl LB液体培养(不含抗生素)，37℃摇床振荡培养1h(120r/min)；

(4)12000r/min，离心1min，所得沉淀用100μl LB重悬。取适量涂于固体培养基上，37℃倒置培养16-20h，有的菌落为白色，有的变为蓝色，选取白色的菌落进行PCR鉴定，白色的菌落为插入了目的片段的大肠杆菌。

6、质粒小量提取的方法

用AXYGEN质粒DNA小量试剂盒提取相应的质粒，具体操作方法如下：第一次使用时，将试剂盒携带的RNaseA全部加入到Buffer S1中，混匀，4℃贮存。

(1)取约4mL过夜培养的含有大肠杆菌(步骤5中所获得的插入了目的片段的大肠杆菌)的LB液体，下文称为菌液(菌液过浓时体积应减半或更少)，12,000×g离心30s，弃尽上清。

(2)加250μl Buffer S1悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小菌块。

(3)加250μl Buffer S2，缓慢地上下翻转4-6次，混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过5min。

(4)加350μl Buffer S3，温和并充分地上下翻转混合6-8次，12,000×g离心10min。

(5)吸取步骤4中的上清并转移到吸附柱(置于2mL离心管中)，室温静止2min，12,000×g离心1min，弃滤液。

(6)将吸附柱放回离心管，加500μl Buffer W1，12,000×g离心30s，弃滤液。

(7)将吸附柱放回离心管，加700μl Buffer W2，12,000×g离心30s，弃滤液；以同样的方法再用500μl Buffer W2洗涤一次。弃滤液。

(8)将吸附柱置回2mL离心管中，12,000×g离心2min。

(9)将吸附柱移入新的1.5mL离心管(试剂盒内提供)中，在吸附柱膜中央加60μl去离子水(65℃预热)，室温静置2min。12,000×g离心1min。将洗脱下来的溶液重新加到吸附膜的中央，复洗一次，得到克隆质粒DNA。

7、对克隆载体的酶切鉴定

质粒DNA用限制性内切酶消化。电泳观察酶切片段的位置和大小，以判断所鉴定的质粒是否有外源片段插入以及插入片段的大小。酶切反应体系为20μl，组分如下：

上述各组分混匀后，置37℃反应2-4h。电泳观察酶切结果，如图2。

8、植物表达载体构建

根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中日本晴基因SAFE S1的CDS序列设计扩增引物；构建植物表达载体的引物如下：

SalI FP:GTCGACTGGCTGATAAGCATAAGGATAA

EcoRI RP:GAATTCAGTACTCTCTAGGCTTGTTTCT

分别以上面克隆正确的质粒为模板用带酶切位点的引物进行PCR扩增，扩增的体系和程序同用cDNA基因克隆，加A连T转化大肠杆菌，选取正确的T载体阳性克隆提取质粒。用限制性内切酶SalI和EcoRI对含目的片段的质粒和pCAMBIA1391质粒进行双酶切，分别回收目的片段和1391质粒的大片段进行连接。用Progema T4连接酶连接目的片段和1391载体大片段(10×T4ligase buffer 1μl，T4ligase 1μl，目的片段2μl，1391质粒大片段6μl)，4℃冰箱过夜连接16-18h，将连接产物转化大肠杆菌。经过菌落PCR筛选重组子和双酶切验证正确的，送北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序并将测序所得序列与NCBI中该基因序列比对。验证正确的克隆即为所要获得的启动子SAFE S1，其核酸序列如SEQ ID No:1所示，并提取其质粒用于转化农杆菌。

9、农杆菌感受态细胞的制备

(1)从-80℃超低温冰箱取出甘油冻存的农杆菌EHA105菌株，在含10μg/mL Rif的YEP培养基划线，28℃培养2～3d至长出单菌落。

(2)挑取单菌落接种于10mL含10μg/mL Rif的YEP培养基，28℃，210r/min过夜培养。

(3)将所得菌液全部转移至250mL含10μg/mL Rif的YEP培养基(1L三角瓶)中于28℃、210r/min继续培养4h左右，中间每隔一段时间测量一次OD值，培养OD600至0.5-0.7。

(4)将菌液均分于6支50mL(预冷的聚乙烯管)离心管，冰上静置30min，然后于4℃、4000r/min离心5min。

(5)弃上清，将离心管倒扣于无菌滤纸上，为除净剩余菌液。

(6)加入3mL预冷的100mM CaCl₂重悬菌体(可用移液枪轻轻吹打重悬)。

(7)将重悬菌液集中于2支离心管，配平，4℃4000r/min，离心5min。

(8)弃上清，将离心管倒扣于无菌滤纸上，以除净剩余菌液；

(9)加入5mL预冷的100mM CaCl₂重悬菌体(可用移液枪轻轻吹打重悬)。

(10)加入5mL预冷的50％甘油，混匀。

(11)冰浴10min，每管100μl分装于无菌Eppendorf管，液氮冷冻后，存于超低温冰箱，备用(枪头和Eppendorf管需4℃预冷)。

10、植物表达载体转化根癌农杆菌EHA105

(1)从-80℃超低温冰箱取出农杆菌感受态细胞，小心地用手心暖化，加入2μg表达载体质粒DNA混匀后，冰浴30min；

(2)迅速转入液氮速冻1min；

(3)从液氮中取出后再加入30℃预热的1mL YEP培养基(不含抗生素)，于30℃摇床120r/min培养4h；

(4)4000r/min离心1min，弃上清；

(5)加入150μl YEP培养基(不含抗生素)重悬，将菌液均匀涂布于含50μg/mL Kan和10μg/mL Rif的YEP固体平板培养基上；

(6)28℃恒温培养箱培养2～3d至长出单菌落，进行菌落PCR鉴定。

(7)挑取阳性的菌落摇菌，并用甘油保存菌液备用。

上文中回收的过程均采用AXYGEN回收试剂盒，利用回收试剂盒回收的步骤如下：

(1)将所获得的片段加入到琼脂糖凝胶中，在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体。计算凝胶重量(提前记录1.5mL离心管重量)，该重量作为一个凝胶体积(如100mg＝100μL体积)。

(2)加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75℃加热(低熔点琼脂糖凝胶于40℃加热)，期间不断晃动(每2-3min)，直至凝胶块完全熔化(约6-8min)。

(3)加入0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混匀。当分离的DNA片段小于400bp时，需再加入1个凝胶体积的异丙醇。

(4)吸取步骤3中的混合液，转移到DNA制备管中，DNA制备管置于2mL(试剂盒内提供)离心管中，12,000×g离心1min。弃滤液。

(5)将制备管重新置回2mL离心管中，加入500μl Buffer W1，12,000×g离心30s，弃滤液。

(6)将制备管置回2mL离心管，加700μl Buffer W2，12,000×g离心30s，弃滤液。以同样的方法再用500μl Buffer W2洗涤一次，12,000×g离心1min。

(7)将制备管置回2mL离心管质粒中，12,000×g离心2min。

(8)将制备管置于洁净的1.5mL离心管(试剂盒内提供)中，在制备膜中央加25-30μl Eluent或去离子水(65℃预热的更好)，室温静置2min。12,000×g离心1min洗脱DNA片段。

利用启动子SAFE S1驱动Gus报告基因在水稻中表达

步骤1：农杆菌介导的水稻遗传转化

(1)愈伤组织诱导消毒后的水稻种子用无菌水在30℃黑暗条件下浸泡过夜，用解剖刀将胚剥下置于诱导培养基上。每皿(规格为100×25mm的一次性塑料培养皿，内含50mL诱导培养基)均匀放置12个胚，在30℃黑暗条件下放置2～3周诱导愈伤组织，至长出淡黄色颗粒状愈伤。

(2)预培养从诱导培养基上挑选颗粒状、不带病斑的愈伤组织置于新的诱导培养基上，于30℃黑暗条件下培养3～5d。

(3)侵染及共培养将预培养的愈伤组织转移至50mL无菌管中，加入植物表达载体的农杆菌菌液浸泡20min，倒出菌液，并用无菌滤纸将残余菌液吸干。后将愈伤均匀撒在共培养培养基上，于23℃黑暗条件下培养2～3d。

(4)恢复将共培养的愈伤组织转移至恢复培养基上(愈伤组织之间尽量避免重叠)。23℃黑暗培养3～5d。

(5)筛选从筛选培养基上挑选不带菌斑颜色鲜亮呈淡黄色颗粒状的抗性胚性愈伤组织，每皿30粒接种于筛选培养基，30℃黑暗培养2～3周，至长出新的抗性颗粒状愈伤。

(6)分化每一转化事件(筛选时由一粒愈伤组织繁殖产生的所有愈伤组织)挑选三个独立的胚性愈伤组织到分化培养基某一区域，30℃光照培养室(16h光照/8h黑暗)条件下培养3～4周，待幼苗长出。

(7)生根每一区域挑选两棵健壮的幼苗移栽至生根培养基，30℃组织培养室光周期(16h光照/8h黑暗)培养三周左右，进行鉴定并移栽至田间。

步骤2、GUS组织化学染色

GUS能与显色底物X-gluc反应，显现蓝色，因而可以通过组织化学染色定性的研究GUS的表达水平和表达模式。

(1)GUS染色底物的配制

50ml 0.5M磷酸缓冲液(pH7.0)，50ul100mM铁氰化钾K₃Fe(CN)₆(将3.2924g铁氰化钾溶于水，定容至100ml，4℃保存。)，50ul100mM亚铁氰化钾K4〔Fe(CN)6〕.3H2O(将4.2239亚铁氰化钾溶于水，定容至100ml，4℃保存。)，1ml0.5MEDTA，250ul1mmg/mlX-Gluc(用二甲基甲酰胺溶解，-20℃避光保存，呈紫红色。)

(2)染色步骤

①染色：将待测样品浸到GUS染液中，37℃保温箱中放置24h-36h。

②脱色：加入100％乙醇浸泡直至完全脱色。可用含有30％甘油和70％乙醇的溶液保存。

③在显微镜下拍照记录。

按上述方法进行Gus染色，结果如图4所示，即SAFE S1：：gus转基因水稻植株各部位Gus染色结果，其中a表示根，b表示茎，c表示叶鞘，d表示叶，e表示胚乳横切面；从图中可以看出，GUS染色在转基因植株的非胚乳部位明显表达，而在胚乳部分则没有表达。(标尺＝1cm)。

因此，从该染色过程可以看出，本发明所获取的启动子能够特异地驱动外源基因在植物的非胚乳部位表达。

也就是说，本发明通过将本发明的启动子转入水稻基因中，对获得的转基因水稻进行GUS表达定量检测发现，转基因植株在非胚乳部位上的Gus基因表达水平提高，从而证明该2021bp的序列具有驱动基因表达的活性，而且该启动子驱动的Gus基因在水稻非胚乳部位表达，而不会在胚乳部分中表达。

本实施例中，缓冲液、试剂、细菌培养基配方、大肠杆菌感受态制备参见《分子克隆实验指南》(第三版)。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

序列表

SEQ ID No:1

TGGCTGATAAGCATAAGGATAAGCGAAAAGATGAGGCCCTAATCTCTCCAGCGGT

GTACACTAGACTCTAGATAGGTACCTACTCTGCTAGTGAATGATACGAGCGAATG

AACCTTACCAAATTTTGGTAATTTGGCAATATTACCAAATTTTAGCAGTATTTTTT

TATGTATTTACGAGAGTTTGGTAAAAAAAACTTCATGGATACACATATTTAGCAA

TTTTACTTTAAAAAATAGTATGGTTTAAAATGACATTAACCTGAACAACCCATAT

CTCTTTCAAAAAGCCAACATTAAGAAGTGGTAGCACTAGCATTTTTACCGTTCTTA

TGAACCGATTTATACAAGGTGAACGACGGGAATCATTATTGTTCTTGTGAGAGAG

ACACAAGGCAGCTGGGGGACTGGTAGCGAGTAGCTACAGCTTTCTTTTCATTTTT

TTTTGAGAATTACACAGTACAACGCAGACACTCATAACGCACGCGTACTCACCCC

TATGAACACACGCACGCAAACCCTACCCCTATAAGCTTTTTTTTCAATTTGACTAT

GTCAGGGAGCATATTTTATGGATATTAAAATGATAGGGCAGAATATACACGTGCA

TGTATTTCTTAGATTGAATGGGTGGGACCGTATTTCTCCGTGGAGTAAATAGGTG

GGGCTGGTCCATCCTGATCGTTTCTGATCGTTAGGTATGGCCGTACGAGTGAAGA

TAGTTTACTCCAATTTATATACATTCATTGTTCATAAAGTAGCACAATTGAGTAAA

TTTTGTAAAAACAACTAATACTATTGATTTCCTACAATTTTAAAGGCATATTAGAC

ACTGAAACAATAATAGCCATCACCCATAGATCCGCCGCTCCTGTTGCTGCAGGCA

AGGAATCCACCACTACCGTGATTATGGCTGTCACATGAAGCCTATTGTACCATTC

CTAAGGCCGTGGCCCTTGGGTCCACCACGTCTCCGTTCTAAGAAAGGGGAGAGGG

AAGGGGAAGAGGCAAGGAGCGGGAAAGGAGACGATGATGGCAGGCGGAGCGAA

TCAGCCCTGGGGGAGGCGGTGTGGAGGGGATGGTGGAGAGGAGAGGAGTGTCAA

GGGAAGAAGAGAAAAAGGGGAGGAATAGGATGAGATAAAAAGGTGGAGGTGCG

GGGAAAAGGGTTGCAGCCAATGGGGATGCACAGGATGGCTCGTCTAGCTTCATG

CAAAATATTAATGGTCCACTAGCTCTTCACGTATATTTTTGTAGACAGGTTCTTTT

ATAGCCCATTCATGAAAATAAGGGGGTGTGCGAAAATTATTTTTTTACAGTAGCA

ACAATTATCTAGATTCACCCATCAAACACACATGTTTCATGTTGGGCATACATGTC

AAATACACCTAGATGTGTCAACTTCTTATAAAATTGTGACACTAAGTAATAGTAG

TTACATGTTATCGTAGCAGTTTAATGACATGTTAGGTTAAAACTGTTGCAAAATG

ATAATTTTGACTAAATAATTATAATTTTACGAAAATTACTAATCATGATTAGTTTT

ATGCGTGCCAATTATCTAGCTCTCTGTTATTAGCTATCTATGCATCGATGGTTTGA

TTGGTTATGGCATTAATTTGATCAATCACCGTGGATGCCTGTTAGGACAAATTTGC

CTTGAACTAGACTGTTTACGTTACTACCTTTTCTTTGGGACTCCACATAATTAGAT

GCATAGTATTTATTAATTTGATATTAAGTTTCTTCTTAAAACTGCCTTCTTTTCACA

AAATGTTAACACTAAAAAAACACATACCTCAGGGTACCTCTTTAAGTACCATAAA

AATTCTCCATGAATTAACACTCAAAATTGTCATGCATGTTCCCTTGAAAAACCAT

AAAAAAGATGGAGAAGAATGAAAGGTCCATTCCTTTGCCTCTTGCCCACAACCTG

AGCCTATAAATACCCTCACAATGGTTGGGTAGCCAACCAACAAGCAAGAAGAAA

TTTCTCTCCTTGTAGAAACAAGCCTAGAGAGTACT

SEQ ID No:2

GTCGACTGGCTGATAAGCATAAGGATAA

SEQ ID No:3

GAATTCAGTACTCTCTAGGCTTGTTTCT

Claims (6)

1.一种植物非胚乳表达启动子SAFE S1，其特征在于，所述植物非胚乳表达启动子SAFE S1包含SEQ ID No:1所示的DNA序列。

2.一种植物非胚乳表达启动子，其特征在于，所述启动子包含SEQ IDNo:1所示的DNA序列的变体、同源物或衍生物。

3.一种表达盒、重组表达载体或转化子，其特征在于，所述表达盒、重组表达载体或转化子包含权利要求1或2中所述的植物非胚乳表达启动子SAFE S1。

4.一种权利要求1或2所述的植物非胚乳表达启动子SAFE S1的应用，其特征在于，所述植物非胚乳表达启动子SAFE S1用于驱动外源基因在植物的非胚乳部位表达。

5.根据权利要求1所述的植物非胚乳表达启动子SAFE S1，其特征在于，所述启动子采用如下方法获得：

步骤(1)制备正向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；

步骤(2)制备反向引物，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示；

步骤(3)以水稻品种日本晴的DNA序列为模板，利用所述正向引物和所述反向引物，采用KOD-plus高保真DNA聚合酶对日本晴的DNA序列中的一目的片段进行PCR扩增，该目的片段的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示；

步骤(4)对所述目的片段进行加A并连接PGEM-T-Easy载体；

步骤(5)，利用该载体转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞中；

步骤(6)挑取单克隆摇菌液提质粒，用SalI和EcoRI引物进行双酶切验证，将经过鉴定的阳性克隆进行测序，验证正确的克隆即为所要获得的目的片段——启动子SAFE S1，其核酸序列如SEQ ID No:1所示；

步骤(7)，利用AXYGEN胶回收试剂盒回收所述目的片段。

6.根据权利要求5所述的植物非胚乳表达启动子SAFE S1，其特征在于，所述扩增程序包括：步骤(3-1)在95℃下进行预变性5min；步骤(3-2)95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，(3-3)重复步骤(3-1)和步骤(3-2)35个循环，步骤(3-4)72℃延伸10min。