CN102242136A - 一种影响水稻根系发育和稻谷产量的基因及其应用 - Google Patents

Abstract

一种影响水稻根系发育和稻谷产量的基因及其应用，该基因具有序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。将SEQ ID NO：1所述基因片段正向和反向插入真核表达载体，获得本发明所述真核重组质粒。将上述真核重组质粒转化水稻，获得转基因植株。实验表明：本发明所述SEQ ID NO：1基因的下调能够促进水稻根系发育，提高水稻产量；与野生型水稻相比，转基因水稻的根长增加，谷粒明显增大粒重增加。因此，本发明所述的基因可在水稻根系发育和植株产量改良中应用。

Description

一种影响水稻根系发育和稻谷产量的基因及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，特别涉及一种提高水稻根系发育和稻谷产量的基因、真核重组质粒及其制备方法与应用。

背景技术

随着我国社会经济的快速发展，人均耕地逐年减少，粮食安全问题日益突出，水稻单产的进一步提高成为备受关注的重大课题。在水稻的高产育种理论上，20世纪90年代提出了塑造水稻新株型的理念(Dingkuhn M，et al.，1991，Concepts for a new plant type fordirect seeded flooded tropical rice.International Rice Research Conference，27-31)。按照这一概念，更高产的水稻品种集中表现为少蘖、大穗、矮秆和根系强壮这4个方面。

水稻根系是植株吸收水分、营养物质和感受土壤环境的桥梁，又是氨基酸、多种激素等物质同化、合成的场所，根系状况直接影响着地上部分的生长发育及产量的形成，是制约水稻产量潜力进一步发挥的关键因素。同时，根系的强壮与水稻抗倒伏能力、机械收割效率也有密切关系。但由于植物根系隐藏于地下，其发育的形态和生理学观察不易进行，相应分子机制的研究也较其他植物器官滞后。虽然，近年在双子叶模式植物拟南芥根的发育方面有了比较大的进展(Benfey PN，et al.，2010，Getting to the root of plant biology-impactof the Arabidopsis genome sequence on root research.Plant Journal，61：992-1000)，但由于单、双子叶植物根系的不同，如在拟南芥中有主根，然后顺序分生出侧根，而水稻、玉米等则是形成庞大而复杂的不定根系。所以，谷类作物还没有一套具体的根系形态、生理特征改良指标，对根系发育的分子调控机制也所知甚少。

在已知的水稻根发育相关基因研究中，OsWOX11通过介导生长素、细胞分裂素的信号传递调控水稻不定根的生长发育，它的过量表达可以使不定根数量明显增加(Zhao Y,etal.，2009，The WUSCHEL-related homeobox gene WOX11 is required to activate shoot-bornecrown root development in rice.Plant Cell，21：736-748)；OsRMC通过茉莉酸信号途径促进水稻根的发育、弯曲和卷曲(Jang J，et al.，2007，RNAi knockdown of Oryza sativa root meandercurling gene led to altered root development and coiling which were mediated by jasmonic acidsignalling in rices.Plant，cell & Environment，30：690-699)。但总体来说，对于如何利用根系改良在水稻这种重要粮食作物的生产实践中克服水分、养分和气象条件限制，充分发挥水稻增产潜力，人们已发现和掌握的知识、技术手段还极为有限。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种新的基因、重组真核质粒及其制备方法，本发明的目的之二是将所述基因和真核重组质粒应用于促进水稻根系生长和提高稻谷产量。

本发明的技术方案如下：

利用生物信息学方法分析本发明所述提高水稻根系和稻谷产量的基因，预测其具有液泡ATP酶A亚基(Vacuolar H+-ATPase subunit A)结构特征，命名为OsVHA。序列分析显示OsVHA基因的mRNA包含1863个碱基的开放阅读框，其核苷酸序列如序列表中SEQID NO：1所示，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

本发明所述真核重组质粒，由序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中的基因片段和真核表达载体构成，所述基因片段是位于起始密码子下游1815bp至2152bp的核苷酸序列，将所述基因片段正向和反向插入真核表达载体，正向插入的基因片段与反向插入的基因片段之间存在有150bp的内含子序列。

本发明所述真核重组质粒的制备方法，其特征在于制备步骤如下：

(1)在序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中选择一段基因片段，所选择的基因片段是位于起始密码子下游1815bp至2152bp的核苷酸序列，将所述基因片段正向插入到质粒pSK载体上形成中间载体，再将该基因片段反向插入已含正向插入基因片段的pSK中间载体，正向插入的基因片段与反向插入的基因片段之间存在有150bp的内含子序列；

(2)利用限制性内切酶切下pSK中间载体上含有正向插入与反向插入的基因片段的部分，然后连接到真核表达载体上，即获真核重组质粒。

本发明所述真核重组质粒及其制备方法中，所述真核表达载体为pHB、pCAMBIA1301、pTCK303中的一种。

将本发明所述重组质粒转化水稻，获得水稻转基因植株。实验表明：所述转基因水稻植株可以促进水稻根系生长发育，使水稻的根长增加；与野生型水稻相比，转基因稻谷粒长、粒宽也增大，千粒重明显增加。因此，本发明所述的基因和真核重组质粒可在水稻根系发育和产量改良中应用。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明克隆了OsVHA基因，并从该基因的核苷酸序列中选择了一段基因片段与真核表达载体构建真核重组质粒，为促进水稻根系生长发育和提高稻谷产量提供了一种新的基因资源和重组质粒制备方法，有利于水稻的增产增收。

2、本发明所用的基因为水稻本身自有的基因，所以转基因水稻的安全性能高。

3、本发明所述基因的克隆和水稻转基因均为常规方法，所需材料易于获取。

附图说明

图1是本发明所述OsVHA基因的扩增产物电泳图。图中，M泳道：分子量标记(DL2000plus)；1泳道：OsVHA基因全长序列。

图2是本发明所述真核重组质粒(pHB-VHARi)的结构示意图。其中，标注VHARi为OsVHA基因选择片段。

图3是转基因水稻植株中抗性筛选标记潮霉素抗性基因(HPT)的PCR扩增产物电泳图。图中，1泳道：阳性对照，PCR模板为真核重组质粒pHB-VHARi；2泳道：阴性对照，PCR模板为野生型水稻植株DNA；3-8泳道：PCR模板为转基因水稻阳性植株DNA。

图4是转基因水稻阳性植株RT-PCR鉴定。图中，WT：野生型水稻植株；1泳道：pHB-VHARi转基因水稻1号植株(VHARi-1)；2泳道：pHB-VHARi转基因水稻2号植株(VHARi-2)；3泳道：pHB-VHARi转基因水稻3号植株(VHARi-3)。

图5是pHB-VHARi转基因水稻谷粒生长情况。其中，A为野生型(WT)和1号转基因(VHARi-1)水稻谷粒照片；B、C、D分别为野生型(WT)和转基因(VHARi-1、VHARi-2、VHARi-3)水稻千粒重、粒长、粒宽统计结果。

图6是pHB-VHARi转基因水稻植株根系生长情况。其中，A，B分别为野生型(WT)和1号转基因(VHARi-1)水稻生长10天、60天时的生长情况；C为野生型(WT)和转基因(VHARi-1、VHARi-2、VHARi-3)水稻种子萌发后第6、8和10天时的根长统计结果。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步说明。下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook，Russell的分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：OsVHA基因的克隆

1、试剂与材料

限制性内切酶、DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、pMD18-T克隆载体等购自大连宝生物工程公司；pBLUNT-EASY克隆载体、质粒提取、DNA提取及DNA回收试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；RNA提取试剂盒购自北京天根生物有限公司；反转录酶、反转录抑制剂购自Toyobo公司；大肠杆菌感受态制备试剂盒购自北京鼎国公司；PCR引物合成、测序由上海英骏生物公司完成；其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。

大肠杆菌克隆菌株为E.coli JM109，购自Clontech公司。水稻野生型品种为日本晴，由实验室保存。

2、培养基

LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。

SOB培养基：胰蛋白胨20g/L，酵母粉5g/L，NaCl 0.58g/L，KCl 0.19g/L，100×Mg²⁺10mL。用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。

SOC培养基：SOB+20mM葡萄糖。

3、实验方法

3.1水稻RNA提取

RNA提取试剂盒购自北京天根生物有限公司，RNA提取过程按照生产商建议程序进行。

1)将50-100mg水稻叶片在液氮中迅速研磨成粉末，加入450μL RL(使用前加入β-巯基乙醇)，涡旋剧烈震荡混匀。在56℃孵育1-3分钟使水稻组织裂解；

2)将所有溶液转移至过滤柱CS上，12000rpm离心5分钟，小心吸取收集管中的上清至RNase-free的离心管中，洗头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀；

3)缓慢加入0.5倍上清体积的无水乙醇，混匀，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，12000rpm离心60秒，弃去收集液，将吸附柱CS3放回收集管中；

4)向吸附柱CS3中加入350μL去蛋白液RW1，12000rpm离心60秒，弃去收集液，将吸附柱CS3放回收集管中；

5)DNase I工作液的配置：取10μL DNase I储存液于RNase-free离心管中，加入70μLRDD溶液，轻柔混匀；

6)向吸附柱CS3中央加入80μL的DNase I工作液，室温放置15分钟；

7)向吸附柱CR3加入350μL去蛋白液RW1，12000rpm离心60秒，弃去收集液，将吸附柱CR3放回收集管中；

8)向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW(使用前加入乙醇)。室温静置2分钟，12000rpm离心60秒，弃去收集液，将吸附柱CS3放回收集管中；

9)重复步骤8；

10)12000rpm离心2分钟，弃去收集液。将吸附柱CS3置于室温数分钟，彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液；

11)将吸附柱CR3放入一个新的RNase-free离心管，在柱的中央加入30-100μL洗脱缓冲液，室温放置2分钟。12000rpm离心2分钟，洗脱RNA。RNA样品在-70℃中保存。

3.2RT-PCR

3.2.1第一链cDNA的合成

1)取1μg总RNA与1μL 25pmol oligo dT引物混合，用RNase-free ddH₂O补足到12.75μL，轻轻混匀；

2)65℃保温5分钟，立即转移至冰浴中，放置2分钟；

3)加入5×反应缓冲液4μL，10mM dNTP 2μL，RNA抑制剂0.25μL(40U/μL)，ReverTraAce反转录酶1μL(100U/μL)，42℃保温30分钟，合成第一链cDNA；

4)95℃加热5分钟，失活反转录酶，终止合成反应。

3.2.2PCR

冰上在一个200μL EP管中加入以下组分：

按以下程序进行扩增：98℃3min(预变性)；98℃10s(变性)，57℃15s(复性)，72℃2min(延伸)，所述变性-复性-延伸30个循环；72℃5min(终延伸)。

引物序列如下：

VHAF：5’-ATCGAGCGAGAGAGCCGTCT-3’

VHAR：5’-GATGTTCAAGTAGATGGTCATCGT-3’

通过上述操作，获得2278bp水稻OsVHA基因全长序列。

3.3PCR产物和克隆载体pBLUNT-EASY载体连接

PCR产物与克隆载体pBLUNT-EASY载体连接，反应体系如下：

PCR产物(～150μg/μL)      3.5μL

pBLUNT-EASY载体            1μL

25℃连接15分钟。

3.4大肠杆菌转化

3.4.1感受态细胞的制备

大肠杆菌感受态制备试剂盒购自北京鼎国公司，制备过程按照生产商建议程序进行。

1)接种大肠杆菌单菌落于2mL SOB培养液中，37℃过夜培养；

2)转接0.5mL过夜培养物至50mL SOB培养液中，18℃剧烈震荡18-24小时，至A₆₀₀约为0.55；

3)将培养液转入50mL离心管中，冰浴10分钟，4℃4000rpm离心10分钟；

4)去上清，加入16mL预冷的TB缓冲液悬浮细胞，轻轻旋转，冰浴10分钟，然后4℃4000rpm离心10分钟；

5)去上清，加入4mL预冷的TB缓冲液悬浮细胞，然后加入280μL DMSO，轻轻混匀，冰浴10分钟；

6)分装于预冷的1.5mL EP管中，液氮中冻存。

3.4.2转化

1)从液氮中取出一管大肠杆菌感受态细胞，冰浴解冻；

2)将连接产物与感受态细胞轻轻混匀，冰浴30分钟；

3)42℃热激90秒，立即冰浴1-2分钟；

4)加入0.8mL的SOC，混匀，37℃温和振荡培养1小时。

5)室温13000rpm离心1分钟，弃去部分上清液，留约200μL，用枪头将上清液与细胞混匀，涂布LB+Amp(50μg/mL)平板，37℃培养过夜。

3.5细胞快速裂解法鉴定重组子

1)挑取单个转化子接种于500μL含相应抗生素的LB培养液中，37℃振荡培养至A600为0.6-0.8；

2)取200μL菌液至0.5mL EP管中，13000rpm离心1分钟，弃去大部分上清，留约20μL；

3)加入20μL的2×快速裂解液(0.2mol/L NaOH 50mL，SDS 0.5g，蔗糖27.2g，加双蒸水至200mL)，剧烈振荡；

4)13000rpm离心15分钟；

5)取5μL上清直接进行琼脂糖凝胶电泳。与阴性对照相比，电泳带滞后的即可能是重组质粒。

3.6菌落PCR鉴定重组质粒

经过快速裂解法鉴定的重组载体再进行菌落PCR以确定插入目标片段，反应体系及PCR程序如实施例1中3.2.2。

对菌落PCR鉴定的重组载体进行测序，测序结果为序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列。

实施例2：真核重组质粒的构建

1、试剂与材料

常规试剂与实施例1相同。

用于转基因的农杆菌菌株为EHA105(购自Clontech公司)；真核表达载体pHB由实验室保存。

2、培养基

与实施例1相同。

3、方法

3.1OsVHA基因片段的获得

3.1.1PCR

根据SEQ ID NO：1所示核苷酸序列起始密码子下游1815bp至2152bp的基因片段设计构建真核重组质粒的引物如下：

VHARiF1：5’-CTCGAGGATCCTGATGACCTCACAACCGGAT-3’

VHARiR1：5’-AAGCTTGATGTTCAAGTAGATGGTCATCGT-3’

VHARiF2：5’-GAGCTCTGATGACCTCACAACCGGAT-3’

VHARiR2：5’-CTGCAGATGTTCAAGTAGATGGTCATCGT-3’

以VHARiF1和VHARiR1为正向扩增引物，以VHARiF2和VHARiR2为反向扩增引物，按下面的PCR反应体系以及以下程序进行扩增：预变性94℃4min，变性94℃30s，退火温度58℃20s延伸72℃21s，所述变性-复性-延伸30个循环；72℃10min(终延伸)。

3.1.2目的基因片段与克隆载体pMD18-T的连接

PCR产物与pMD18-T载体连接反应体系如下：

16℃连接过夜。

3.1.3连接产物的转化(操作步骤见实施例1中3.4)

3.1.4菌落PCR鉴定重组质粒(操作步骤见实施例1中3.6)

对菌落PCR确定的重组质粒进行测序，对测序结果与基因片段进行比对，确定所扩增片段为目的基因片段。

3.2pSK中间载体的构建

3.2.1质粒微量提取

质粒提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，质粒提取过程按照生产商建议程序进行。

1)将带有克隆载体质粒的E.coli JM109接种于装有5mL LB培养液(含适量抗生素)的试管中，37℃培养12-16小时；

2)取1.5-5mL菌液，室温下10000×g离心1分钟。尽量吸尽上清。加入250μL无色溶液RB(含RNase A)，漩涡振荡使细胞完全重新悬浮；

3)加入250μL蓝色溶液LB，温和翻转混合4-6次，使菌体充分裂解，形成蓝色透亮溶液；

4)加入350μL黄色溶液NB，轻轻混合5-6次，直至形成紧实的黄色凝集块，室温静置2分钟；

5)15000×g离心5分钟，小心吸取上清加入吸附柱中；

6)15000×g离心1分钟，弃去收集液；

7)加入650μL溶液WB，15000×g离心1分钟，弃去收集液；

8)15000×g离心2分钟，彻底去除残留的WB；

9)将吸附柱置于一干净的离心管中，在柱的中央加入30-50μL EB溶液，室温静置1分钟；

10)10000×g离心1分钟，洗脱DNA。DNA溶液于-20℃保存。

3.2.2DNA片段回收

DNA回收试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，DNA回收过程按照生产商建议程序进行。

1)切取琼脂糖凝胶中的DNA片段，放入干净的离心管中；

2)加入3倍体积溶液GSB，于55℃水浴6-10分钟确保胶块完全融化。当胶块完全融化后，观察溶液颜色，如颜色为紫色，加入适量3M醋酸钠(pH5.2)，调整颜色和GSB颜色相同(黄色)；

3)待融化的凝胶溶液降至室温(高温时吸附柱结合DNA能力弱)，加入吸附柱中静置1分钟，10000×g离心1分钟，弃去收集液；

4)加入650μL溶液WB，10000×g离心1分钟，弃去收集液；

5)10000×g离心2分钟，去除残留的WB；

6)将吸附柱开盖静置1分钟，使残留乙醇挥发干净，在柱的中央加入60-70℃预热30-50μL EB溶液，室温静置1分钟；

7)10000×g离心1分钟，洗脱DNA。将洗脱出的DNA于-20℃保存。

3.2.3正向基因片段与pSK载体的连接

将测序正确的正向基因片段和pSK载体，分别以Xho I、Hind III进行双酶切后，反应体系如下：

37℃反应3小时后，琼脂糖凝胶电泳，回收正向基因片段和pSK载体。

将正向基因片段、pSK载体酶切回收产物进行连接，连接反应体系如下：

16℃反应12小时后进行转化。转化操作步骤见实施例1中3.4。

3.2.4反向基因片段与已连有正向基因片段的pSK载体的连接

将测序正确的反向基因片段和已连有正向基因片段的pSK载体，以Sac I、Pst I进行双酶切后，反应体系如下：

37℃反应3小时后，琼脂糖凝胶电泳，回收反向基因片段和已连有正向基因片段的pSK载体。

将反向基因片段、已连有正向基因片段的pSK载体的酶切回收产物进行连接，连接反应体系如下：

16℃温育12小时后进行转化。转化操作步骤见实施例1中3.4。

3.2.5真核重组质粒的获得

将含有正向基因片段和反向基因片段的pSK中间载体用BamH I和Sac I酶切，同时将pHB真核载体用BamH I和Sac I酶切。酶切反应的反应体系如下：

37℃反应3小时，琼脂糖凝胶电泳，回收pSK中间载体、pHB载体片段，并进行连接，连接反应体系如下：

16℃温育12小时，进行转化。转化操作步骤见实施例1中3.4。

通过以上操作，获得真核重组质粒，命名为pHB-VHARi(如图2所示)。

3.3农杆菌的转化

3.3.1农杆菌感受态细胞的制备

1)挑取农杆菌单菌落于2mL的YEB液体培养基(含Rif 50μg/mL)中，28℃振荡培养过夜；

2)取过夜培养液500μL转接于50mL YEB(含Rif 50μg/mL)液体培养基中，28℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.5；

3)4℃5000rpm离心5分钟收集菌体，加入10mL 0.15M NaCl溶液悬浮菌体，冰浴10分钟；

4)4℃5000rpm离心5分钟收集菌体，用1mL预冷的20mM CaCl₂溶液悬浮菌体，冰浴10分钟；

5)制备的感受态细胞立即使用，或分装200μL/管，液氮中速冻1分钟，置于-70℃保存备用。

3.3.2农杆菌的转化

1)取200μL感受态细胞，冰上解冻；

2)加入1μg pHB-VHARi重组载体，轻弹混匀，冰浴30分钟；

3)液氮中速冻1分钟，37℃水浴5分钟，然后加入1mL YEB培养基，28℃振荡培养4小时；

4)将培养物涂布于含50μg/mL Kan和50μg/mL Rif的YEB平板上，28℃培养约48h。

3.3.3农杆菌阳性克隆的鉴定

挑取平板上长出的单菌落，接种于含50μg/mL Kan和50μg/mL Rif的YEB液体培养基中，28℃振荡培养过夜，以菌液为模板进行PCR扩增鉴定。

实施例3：转基因水稻的获得与表型分析

1、试剂与材料

常规试剂与实施例1相同。

2、培养基

YEB培养基：酵母提取物1g/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨5g/L，蔗糖5g/L，MgSO₄.7H₂O0.5g/L。用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。

YEP培养基：酵母提取物10g/L，蛋白胨10g/L，NaC15g/L。用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。

常规组织培养基：

3、方法

3.1农杆菌介导法转化水稻

3.1.1胚性愈伤组织诱导与继代

水稻日本晴成熟种子去壳，75％乙醇消毒1分钟，25％次氯酸钠溶液中振荡消毒25分钟，灭菌蒸馏水再冲洗3次，然后接种到诱导培养基上，27℃暗培养条件下诱导愈伤组织形成。

3.1.2愈伤组织预培养

选取自然分散、颜色鲜黄、直径约为2-3mm的颗粒状愈伤，转接到预培养培养基中27℃暗培养。每两周以预培养培养基继代，继代培养2次后进行农杆菌侵染。

3.1.3农杆菌的培养及处理

1)从-80℃低温冻存管中刮取少量含有pHB-VHARi载体的菌液于含有卡那霉素(Kan)50mg/L和利福平(Rif)50mg/L的YEB固体培养基上划线，28℃培养36-72小时进行活化；

2)取活化平板上的单菌落转接划菌，28℃培养48小时；

3)用含有100μM/L乙酰丁香酮的AAM培养基洗脱农杆菌，悬浮于含有100μM乙酰丁香酮的20ml AAM培养基中，剧烈摇动1分钟，调整菌液浓度至OD₆₀₀＝0.8-1.0。静置1小时，使农杆菌形成悬浮液。

3.1.4共培养

取经预培养的愈伤于灭菌的培养瓶中，加入上述处理的农杆菌菌液，略微摇动后静置15分钟，于无菌滤纸上晾干愈伤后接种于共培养基。27℃暗培养2天。

3.1.5洗除农杆菌

挑取共培养后的愈伤于培养瓶中，用无菌水冲洗3-5次，每次摇动数次，直至水中不见丝状菌体。然后用含250mg/L羧卞青霉素的无菌水静置1小时，再置于无菌滤纸上晾干。

3.1.6愈伤组织的筛选

将愈伤转移至含有潮霉素的选择培养基中筛选抗性愈伤，每2周转接1次。

3.1.7抗性愈伤组织的继代与植株的再生

愈伤在选择培养基上约三周后可见瘤状鲜黄色抗性愈伤从褐化干瘪的愈伤中长出。待愈伤长大后挑选抗性愈伤的一部分转移至分化培养基上，约2周后愈伤开始转绿，3周后开始分化。将分化幼苗移至生根培养基上，待幼苗长成后移至温室盆栽。

3.2转基因植株的鉴定

3.2.1基因组DNA的提取

DNA提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，DNA提取过程按照生产商建议程序进行。

1)取新鲜水稻组织100mg，加入液氮充分研磨；

2)加入250μL溶液RB1，振荡混匀，使样品完全悬浮；

3)加入30μL 10％SDS，15μL RNase A至裂解液中，充分混匀；

4)55℃水浴孵育15分钟；

5)12000rpm离心15分钟，轻轻吸取上清于干净的离心管中；

6)加入100μL溶液PB1中，充分混匀，冰浴5分钟，12000rpm离心5分钟；

7)轻轻吸取上清于干净的离心管中，加入375μL溶液BB1(使用前加入无水乙醇)，充分混匀；

8)取全部混合液加入吸附柱中，12000rpm离心30秒，弃去收集液；

9)加入500μL溶液CB，12000rpm离心30秒，弃去收集液；

10)加入500μL溶液WB(使用前加入无水乙醇)，12000rpm离心30秒，弃去收集液；

11)重复步骤10；

12)12000rpm离心2分钟，彻底去除残留的WB；

13)将吸附柱置于一个干净的离心管中，在柱的中央加入100μL预热(60℃)的EB溶液，室温静置1分钟，12000rpm离心1分钟，洗脱DNA。DNA溶液于-20℃保存。

3.2.2水稻基因组DNA的PCR检测

为了检测载体序列是否已整合到基因组，以转基因水稻基因组DNA为模板，对水稻潮霉素抗性标记基因(HPT)进行PCR扩增。引物为：

HPT-F：5′-TCGTTATGTTTATCGGCACTTTG-3′

HPT-R：5′-GCGTCTGCTGCTCCATACAAG-3′

按以下程序进行扩增：94℃5min(预变性)；94℃40s(变性)，58℃40s(复性)，72℃30s(延伸)，所述变性-复性-延伸30个循环；72℃5min(终延伸)

3.3.3转基因水稻阳性植株半定量分析

分别提取野生型、转基因水稻植株叶片的RNA，反转录后，进行RT-PCR分析，同时以水稻内参基因(ACTIN)做为对照。

OsVHA基因RT-PCR扩增引物为：

RT-VHAF：5’-TGATGACCTCACAACCGGAT-3’

RT-VHAR：5’-GATGTTCAAGTAGATGGTCATCGT-3’

按以下程序进行扩增：94℃4min(预变性)；94℃30s(变性)，58℃20s(复性)，72℃21s(延伸)，所述变性-复性-延伸29个循环；72℃10min(终延伸)。

ACTIN基因RT-PCR扩增引物为：

RT-ACTF：5’-AAGATCCTGACGGAGCGTGGTTAC-3′

RT-ACTR：5′-CTTCCTAATATCCACGTCGCACTTC-3′

按以下程序进行扩增：94℃5min(预变性)；94℃30s(变性)，59℃30s(复性)，72℃20s(延伸)，所述变性-复性-延伸29个循环；72℃10min(终延伸)。

3.3.4转基因植株稻谷粒长、粒宽和千粒重测定

取三个独立转基因株系(VHA-1、VHA-2、VHA-3)和野生型水稻种子测量其千粒重。每株系各随机取20粒，分别测量其粒长、粒宽。

3.3.5转基因水稻根系生长

将三个独立转基因株系(VHA-1、VHA-2、VHA-3)种子各20粒分别与野生型种子放于同一个带有双层滤纸的培养皿中，加入适量蒸馏水，在光照培养箱中生长(27℃，14h光照，10h黑暗)。在培养第6、8、10天分别测量野生型、转基因株系幼苗的根长。

4、结果

4.1转基因植株的鉴定

4.1.1转基因水稻阳性筛选植株PCR鉴定结果

经组织培养和抗性筛选获得20株再生水稻植株，经PCR鉴定获得了12株阳性转基因水稻，图3为部分阳性植株潮霉素抗性筛选标记基因(HPT)PCR扩增结果。在阳性植株中均有与阳性对照大小一致的扩增产物条带，表明植物表达载体序列已整合到转化水稻的基因组中。

4.1.2转基因水稻阳性植株半定量分析

经RT-PCR分析，已鉴定OsVHA基因表达量明显下调的5个独立转基因水稻植株。图4显示其中三个转基因株系(VHA-1、VHA-2和VHA-3)的半定量分析结果。

4.2转基因植株稻谷粒长、粒宽和千粒重测定结果

对转基因株系VHA-1、VHA-2和VHA-3的测量结果表明，与野生型相比，转基因稻谷粒长、粒宽均增大，千粒重增高(图5)，显示OsVHA基因参与水稻的产量调控。

4.3转基因水稻根系生长检测结果

对转基因株系VHA-1、VHA-2和VHA-3幼苗的统计结果显示，转基因水稻幼苗的根长较野生型增加(图6)，表明OsVHA基因可以影响水稻根系的生长发育。

序列表

<110>重庆大学

<120>一种影响水稻根系发育和稻谷产量的基因及其应用

<160>2

<170>PatentIn Version 3.2

<210>1

<211>2278

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<221>mRNA

<222>(1).....(2278)

<223>一种影响水稻根系发育和稻谷产量的基因

<400>1

atcgagcgag agagccgtct ccctcttcgc ttctcctctc ccccccgtga tctgaccgcc     60

ggcgacgacc ccctcccacc acccgccgcc gccgccgcgc ccccgccccc gccggcgacg    120

accaccatgt cgtacgatcg cgtcacgacc ttcgaggact cggagaagga gagcgagtac    180

ggctacgtcc gcaaggtttc tggacctgtg gtcgtggctg atggaatggg tggtgctgcc    240

atgtatgaac ttgtccgagt tggtaatgat aacctcattg gggaaattat tcgtcttgag    300

ggtgattcag ccaccattca agtttatgag gaaacagctg ggttgatggt caatgatcca    360

gtgttgagaa caagaaagcc tctttcagtt gaattgggac ctggtatcct tggaaatatc    420

tttgatggaa tccagcgccc tctaaaaact attgctataa agtctggaga tgtgtacata    480

ccacgtggtg tttcagtccc tgctcttgac aaagatcagt tgtgggattt tgagccaaag    520

aagctaggtg ttggagatgc catcactggt ggagatctat atgctactgt gtttgagaat    600

acgctgatga aacatcatgt tgcccttcct cctggttcta tggggaaaat tagttacatt    660

gcaccagctg gccagtatag cttgcaggat acagttctgg aactggaatt ccagggcatc    720

aaaaagcaat ttactatgct ccagacatgg cctgtccggt caccaaggcc tgtttcatca    780

aagcttgctg ctgacacgcc tcttctaaca ggacagcgtg tacttgatgc actatttccc    840

tcagttcttg gaggaacttg tgctattcct ggagcatttg gttgtggaaa aactgtcatt    900

agtcaggcac tttcaaagta ctccaattct gaagctgtgg tttatgtggg ctgcggggaa    960

agaggaaacg agatggctga ggtccttatg gacttcccac aattgacaat gacattgcct    1020

gatggacgtg aagagtctgt catgaaaaga actacacttg ttgctaacac atccaacatg    1080

cctgttgctg ctcgtgaagc ctccatttat acaggaatta caattgctga atacttccgt    1140

gacatgggct ataatgtcag tatgatggct gattctactt ctcggtgggc tgaagctttg    1200

cgtgagattt caggacgtct ggctgaaatg cctgcggata gtggttaccc tgcatatttg    1260

gctgcacgtt tggcatcctt ttacgaacgt gctggtaagg tgaaatgtct cggcagtcca    1320

gatcggacag gcagtgtcac aattgttggt gctgtctctc cacctggagg tgatttttca    1380

gatcctgtta cctctgcaac tcttagtatt gtgcaggtct tttggggatt ggataagaag    1440

ctggctcaaa gaaagcattt cccatctgtc aattggctca tctcttactc aaaatactca    1500

aaggctctgg aatccttcta tgagaagttt gatcaagatt tcattgatat tagaacaaaa    1560

gctcgtgaag tgttacagag agaggacgat ctaaatgaaa ttgtccagct tgttggtaaa    1620

gatgcactgg cagaatctga taagattaca ttggaaacag ccaagctact aagggaagat    1680

tacttggcac agaatgcatt taccccatat gacaagttct gtccattcta caagtctgtt    1720

tggatgatgc gcaacattat tcatttcaat acattagcaa atcaggctgt ggagcgtgca    1800

gctaatgctg atggacaaaa aataacatac agtgtcataa agcatcgtat gggtgatcta    1860

ttttatcgcc tagtatctca aaagtttgag gaccctgcag agggtgaaga tgtcctagtc    1920

gcaaaattcc agaaattgta tgatgacctc acaaccggat tccgcaacct agaagatgaa    1980

gctaggtgaa gtgctgtaaa ttgaggatca cattcgtgta aacaataaaa tatcaccaga    2040

tattcgaagc gagttggggc aatttatttt gcttcgcgtg aggttgtaga tgtgaattac    2100

gtttcagaat catcatattt tccttctgca tcgacactgc tgctgctttt tgtagcttcc    2160

tgtttgacct ccggtgctcg atgaaggcat tctttttggt gtacaattat ttatattgta    2220

agatacctgt gcacatgttg atagttgaat aagcacgatg accatctact tgaacatc      2280

<210>2

<211>620

<212>PRT

<213>水稻(Oryza sativa)

<223>一种影响水稻根系发育和产量的多肽

<400>2

MET Ser Tyr Asp Arg Val Thr Thr Phe Glu Asp Ser Glu Lys Glu

 1               5                  10                  15

Ser Glu Tyr Gly Tyr Val Arg Lys Val Ser Gly Pro Val Val Val

                 20                 25                  30

Ala Asp Gly MET Gly Gly Ala Ala MET Tyr Glu Leu Val Arg Val

                 35                 40                  45

Gly Asn Asp Asn Leu Ile Gly Glu Ile Ile Arg Leu Glu Gly Asp

                50                  55                  60

Ser Ala Thr Ile Gln Val Tyr Glu Glu Thr Ala Gly Leu MET Val

                65                  70                  75

Asn Asp Pro Val Leu Arg Thr Arg Lys Pro Leu Ser Val Glu Leu

                80                  85                  90

Gly Pro Gly Ile Leu Gly Asn Ile Phe Asp Gly Ile Gln Arg Pro

                95                  100                 105

Leu Lys Thr Ile Ala Ile Lys Ser Gly Asp Val Tyr Ile Pro Arg

                110                 115                 120

Gly Val Ser Val Pro Ala Leu Asp Lys Asp Gln Leu Trp Asp Phe

                125                 130                 135

Glu Pro Lys Lys Leu Gly Val Gly Asp Ala Ile Thr Gly Gly Asp

                140                 145                 150

Leu Tyr Ala Thr Val Phe Glu Asn Thr Leu MET Lys His His Val

                155                 160                 165

Ala Leu Pro Pro Gly Ser MET Gly Lys Ile Ser Tyr Ile Ala Pro

                170                 175                 180

Ala Gly Gln Tyr Ser Leu Gln Asp Thr Val Leu Glu Leu Glu Phe

                185                 190                 195

Gln Gly Ile Lys Lys Gln Phe Thr MET Leu Gln Thr Trp Pro Val

                200                 205                 210

Arg Ser Pro Arg Pro Val Ser Ser Lys Leu Ala Ala Asp Thr Pro

                215                 220                 225

Leu Leu Thr Gly Gln Arg Val Leu Asp Ala Leu Phe Pro Ser Val

                230                 235                 240

Leu Gly Gly Thr Cys Ala Ile Pro Gly Ala Phe Gly Cys Gly Lys

                245                 250                 255

Thr Val Ile Ser Gln Ala Leu Ser Lys Tyr Ser Asn Ser Glu Ala

                260                 265                 270

Val Val Tyr Val Gly Cys Gly Glu Arg Gly Asn Glu MET Ala Glu

                275                 280                 285

Val Leu MET Asp Phe Pro Gln Leu Thr MET Thr Leu Pro Asp Gly

                290                 295                 300

Arg Glu Glu Ser Val MET Lys Arg Thr Thr Leu Val Ala Asn Thr

                305                 310                 315

Ser Asn MET Pro Val Ala Ala Arg Glu Ala Ser Ile Tyr Thr Gly

                320                 325                 330

Ile Thr Ile Ala Glu Tyr Phe Arg Asp MET Gly Tyr Asn Val Ser

                335                 340                 345

MET MET Ala Asp Ser Thr Ser Arg Trp Ala Glu Ala Leu Arg Glu

                350                 355                 360

Ile Ser Gly Arg Leu Ala Glu MET Pro Ala Asp Ser Gly Tyr Pro

                365                 370                 375

Ala Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ala Ser Phe Tyr Glu Arg Ala Gly

                380                 385                 390

Lys Val Lys Cys Leu Gly Ser Pro Asp Arg Thr Gly Ser Val Thr

                395                 400                 405

Ile Val Gly Ala Val Ser Pro Pro Gly Gly Asp Phe Ser Asp Pro

                410                 415                 420

Val Thr Ser Ala Thr Leu Ser Ile Val Gln Val Phe Trp Gly Leu

                425                 430                 435

Asp Lys Lys Leu Ala Gln Arg Lys His Phe Pro Ser Val Asn Trp

                440                 445                 450

Leu Ile Ser Tyr Ser Lys Tyr Ser Lys Ala Leu Glu Ser Phe Tyr

                455                 460                 465

Glu Lys Phe Asp Gln Asp Phe Ile Asp Ile Arg Thr Lys Ala Arg

                470                 475                 480

Glu Val Leu Gln Arg Glu Asp Asp Leu Asn Glu Ile Val Gln Leu

                485                 490                 495

Val Gly Lys Asp Ala Leu Ala Glu Ser Asp Lys Ile Thr Leu Glu

                500                 505                 510

Thr Ala Lys Leu Leu Arg Glu Asp Tyr Leu Ala Gln Asn Ala Phe

                515                 520                 525

Thr Pro Tyr Asp Lys Phe Cys Pro Phe Tyr Lys Ser Val Trp MET

                530                 535                 540

MET Arg Asn Ile Ile His Phe Asn Thr Leu Ala Asn Gln Ala Val

                545                 550                 555

Glu Arg Ala Ala Asn Ala Asp Gly Gln Lys Ile Thr Tyr Ser Val

                560                 565                 570

Ile Lys His Arg MET Gly Asp Leu Phe Tyr Arg Leu Val Ser Gln

                575                 580                 585

Lys Phe Glu Asp Pro Ala Glu Gly Glu Asp Val Leu Val Ala Lys

                590                 595                 600

Phe Gln Lys Leu Tyr Asp Asp Leu Thr Thr Gly Phe Arg Asn Leu

                605                 610                 615

Glu Asp Glu Ala Arg

                620

Claims (8)

1.一种影响水稻根系发育和稻谷产量的基因，其特征在于它具有序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

2.一种真核重组质粒，其特征在于由序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中的基因片段和真核表达载体构成，所述基因片段是起始密码子下游1815bp至2152bp的核苷酸序列，所述基因片段正向和反向插入真核表达载体，正向插入的基因片段与反向插入的基因片段之间存在有150bp的内含子。

3.根据权利要求2所述的真核重组质粒，其特征在于所述真核表达载体为pHB、pCAMBIA1301、pTCK303中的一种。

4.一种真核重组质粒的制备方法，其特征在于步骤如下：

(1)在序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中选择一段基因片段，所选择的基因片段是起始密码子下游1815bp至2152bp的核苷酸序列，将所述基因片段正向插入到质粒pSK载体上形成中间载体，再将该基因片段反向插入已含正向插入基因片段的pSK中间载体，正向插入的基因片段与反向插入的基因片段之间存在有150bp的内含子序列；

(2)利用限制性内切酶切下pSK中间载体上含有正向插入与反向插入的基因片段的部分，然后连接到真核表达载体上，即获真核重组质粒。

5.根据权利要求4所述的真核重组质粒的制备方法，其特征在于所述真核表达载体为pHB、pCAMBIA1301、pTCK303中的一种。

6.一种影响水稻根系发育的方法，其特征在于将上述2或3真核重组质粒转化水稻，获得转基因植株。

7.一种提高水稻产量的方法，其特征在于将上述2或3真核重组质粒转化水稻，获得转基因植株。

8.权利要求1所述基因在水稻根系发育和产量改良中的应用。

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