CN104498514A

CN104498514A - 一种唐古特白刺NtCIPK9基因及其表达蛋白和应用

Info

Publication number: CN104498514A
Application number: CN201510026143.4A
Authority: CN
Inventors: 成铁龙; 鲁路; 陈金慧; 施季森; 周艳威; 郑晨; 盛宇; 史胜青; 杨秀艳; 李霞
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2015-01-20
Filing date: 2015-01-20
Publication date: 2015-04-08
Anticipated expiration: 2035-01-20
Also published as: CN104498514B

Abstract

本发明公开了一种唐古特白刺 NtCIPK9 基因及其表达蛋白和应用，所述 NtCIPK9 基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明根据唐古特白刺的抗逆特性，利用唐古特白刺的叶片组织，在已有的部分转录组数据的基础上，同源克隆了唐古特白刺抗逆相关的 CIPK 基因全长，依据拟南芥中的同源基因而命名为 NtCIPK9 。通过 NtCIPK9 基因纯合拟南芥植株的耐盐性分析，证明了唐古特白刺 NtCIPK9 基因在植物耐盐方面的功能，为植物抗逆基因库增加资源。

Description

一种唐古特白刺NtCIPK9基因及其表达蛋白和应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种唐古特白刺NtCIPK9基因及其表达蛋白和应用。

背景技术

唐古特白刺（Nitraria tangutorum）属于蒺藜科（ Zygophyllaceae）白刺属（Nitraria），强旱生落叶灌木，为中国特有白刺种类，主要分布于我国西北部地区。唐古特白刺抗旱、耐盐碱、防风沙、耐贫瘠，可改善盐碱质土壤，提高土壤肥力，防风固沙，维持绿洲，保护生态平衡。其浆果状核果富含维生素C、黄酮、蛋白质、以及19种氨基酸和21种微量元素，具有食用价值。此外，其果实还具有健脾胃，降血脂，降血糖以及抗氧化等药用价值。唐古特白刺作为一种生态和经济植物逐渐受到关注。目前，对唐古特白刺的研究主要集中在抗旱耐盐生理生化性质，果实营养成分分析以及育种等方面，为唐古特白刺的分子机理研究提供大量的数据支持，为抗性基因及其它功能基因的运用奠定基础。

CIPKs（CBL-interacting protein kinase），Ca²⁺信号途径中与上游CBL特异性相互作用的蛋白激酶，这类蛋白在N端含有保守的SNF激酶结构域和C端的NAF结构域。在模式植物拟南芥中有26个CIPK类同源异型盒基因，水稻中有30个CIPK类同源异型盒基因，杨树中有27个CIPK类同源异型基因。另外，到目前为止，还没有在植物以外的物种中发现类似基因，因此CIPK基因是植物所特有的Ca²⁺信号通路中的Ser/Thr类磷酸蛋白激酶基因。众多研究表明，植物所特有的CIPK类基因在植物耐盐，耐低钾，抗寒和抗旱等抗逆过程中发挥重要作用。

在拟南芥的研究中发现，AtCIPK9基因是植物响应低钾环境的一个关键调控基因。在拟南芥突变体cipk9-1和cipk9-2植株与野生型相比，其生长明显受到低钾环境的抑制。CIPK9基因启动子的GUS染色和荧光实时定量PCR分析表明，CIPK9基因在拟南芥的根茎叶中均有表达。根部的表达主要是在根部的成熟区，包括根毛，在根尖和伸长区并无CIPK9基因的表达。此外，在拟南芥的花瓣，萼片和荚果中也能检测到CIPK9基因的表达。分子生物学研究证明了CIPK9与CBL3共同作用，调节植物体内钾离子平衡。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种唐古特白刺NtCIPK9基因。本发明的另一目的是提供唐古特白刺NtCIPK9基因的表达蛋白。本发明还有一目的是提供唐古特白刺NtCIPK9基因在植物耐盐育种中的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种唐古特白刺NtCIPK9基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述的唐古特白刺NtCIPK9基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述的唐古特白刺NtCIPK9基因在植物耐盐育种中的应用。

含有唐古特白刺NtCIPK9基因的载体。

含有唐古特白刺NtCIPK9基因的宿主细胞。

有益效果：与现有技术相比，本发明根据唐古特白刺的抗逆特性，利用唐古特白刺的叶片组织，在已有的部分转录组数据的基础上，同源克隆了唐古特白刺抗逆相关的CIPK基因全长，依据拟南芥中的同源基因而命名为NtCIPK9。在正常培养环境中，唐古特白刺NtCIPK9基因过表达的拟南芥T3代纯合植株的生长发育与野生型无明显差异。在盐胁迫处理过程中，转NtCIPK9基因纯合株的耐盐性大于野生型拟南芥。通过NtCIPK9基因纯合拟南芥植株的耐盐性分析，证明了唐古特白刺NtCIPK9基因在植物耐盐方面的功能，为植物抗逆基因库增加资源，这对于提高植物的耐盐性研究具有重要意义。

附图说明

图1是唐古特白刺总RNA的1%琼脂糖凝胶电泳图；

图2是NtCIPK9基因片段克隆，5’RACE，3’RACE以及NtCIPK9基因全长克隆的PCR结果；

图3是NtCIPK9基因的表达载体图；

图4是T1代拟南芥植株筛选结果；

图5是转基因拟南芥种子子叶萌发率统计图；

图6是拟南芥种子在含盐培养基上萌发后两周的生长状态图；

图7是转基因拟南芥盐处理10天后生长表型图；

图8是转基因拟南芥盐处理10天后叶片及侧根数量统计结果图；

图9是转基因拟南芥盐处理10天后主根长度统计结果图；

图10是转基因拟南芥盐处理10天后植株整体干重统计结果图；

图11是盐溶液处理转基因拟南芥表型图；

图12是200mM盐水处理转基因拟南芥4天后的拟南芥表型图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

以唐古特白刺的叶片为材料，提取总RNA，并反转成cDNA，设计相应引物进行PCR，琼脂糖凝胶电泳后，回收目的条带，与pMD19-T载体连接，转入大肠杆菌，测序并分析。确定为目的序列后，依据该序列设计RACE引物，PCR获取5’和3’序列，测序分析后，拼接得到NtCIPK9全长序列。依据全长序列设计引物，PCR获得全长片段，与pMD19-T载体连接，转入大肠杆菌，再次测序和分析，确定为全长片段后，挑取阳性克隆进行质粒抽提，加入酶切位点后与载体pBI121同时双酶切，在T4连接酶的作用下连接后，转入农杆菌EHA105和GV3101中，待拟南芥适龄后，通过花器官浸泡转化法进行转化，获取T1代和T2代种子，筛选到纯合T3代后，进行盐处理，表型观察和耐盐性分析。具体如下：

（1）总RNA的提取

以唐古特白刺的叶片为材料，按照NORGEN试剂盒（Norgen Biotek）的操作步骤进行RNA的提取，所使用的试剂和耗材均处理使其无RNA酶。唐古特白刺叶片总RNA的1%琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，条带清晰；测定总RNA的吸光度，OD₂₆₀/OD₂₈₀值为2.01，OD₂₆₀/OD₂₃₀为1.98，可见RNA质量较好。

RNA提取的具体过程为：加入800μLLysis Solution磨样。匀浆后将裂解液转移至新管中。混匀2min使其彻底裂解，12000rpm离心2min，上清移至新管中。加入等体积的70%乙醇，涡旋混匀。将混合液移至柱子中（下接2ml收集管），离心1min，倒掉滤液，放回收集管。加入400μL Wash Solution ，离心1min，弃滤液，放回收集管。加入DNAI工作液，12000rpm离心1min，将滤液吸回柱子上，25-30℃静置15min。加入400μL Wash Solution，12000rpm离心1min，弃滤液。第三次加入400μL Wash Solution，12000rpm离心1min，弃滤液。将柱子放回收集管，12000rpm离心2min，弃收集管。将柱子放入1.7ml管子中加入50μLElution Solution。200~2000rpm离心2min，12000rpm离心1min，体积不足50μL，再用14000rpm离心1min。

（2） cDNA的获得

以所提RNA为模板，反转录获得cDNA，所使用的是Invitrogen公司的SuperScript? III First-Strand Synthesis Kit。实验中的RNA使用量为1μg，具体过程为：配置反应液（1μL RNA（≤5μg），1μLPrimer（OligodT），1μL 10mM dNTPmix，DEPC-TreatedWater，up to 10μL），短暂低速离心后，65℃ 5min，立即置于冰上1~2min。向上一步的管中加入试剂（2μL 1 0×RT Buffer，4μL 25mM MgCl₂，2μL 0.1M DTT，1μLRNaseOUT（40U/μL），1μLSuperScript III RT），置于PCR仪上，反应程序为50℃ 50min，85℃ 5min。将上一步的反应液离心，每管中加入1μL的RNase H ，37℃ 20min。

（3）目的基因的同源克隆

根据唐古特白刺的部分转录组数据，通过NCBI Blast进行保守的特异性序列分析，利用Oligo7设计引物，克隆NtCIPK9基因片段，然后进行连接转化测序和序列分析，确定为目的基因。克隆引物，PCR体系和PCR程序如下所示。克隆结果如图2-A所示。

NtCIPK9片段克隆引物为：

CIPK9 forward primer: 5'-GTGATCAAGTCCTGCGTCACAA-3'，

CIPK9 reverse primer: 5'-CTACCTCAAACACCTCAGTGGCTAC-3'。

PCR反应体系（20μL）为：2μL 10xPCR Buffer、1.2μL Mg²⁺（25mM/L）、0.4μL 10xdNTP、0.1μL Tag（5.0U/ul）、1μL Forward primer（10uM/L）、1μL Reverse primer（10uM/L）、1μL Template cDNA（100ng/ul）、13.3μL ddH₂O。

PCR反应程序为：95℃变性5min，55℃退火30s，72℃延长1min，35个循环。

（4）目的基因5’端和3’端序列克隆

利用Oligo7设计RACE引物，进行CIPK9基因3’末端和5’末端的克隆，切胶回收获得目的片段，然后与载体pMD19-T连接，转化大肠杆菌，挑取单克隆，测序和序列分析，确定获得NtCIPK9基因的两个末端序列后，拼接得到NtCIPK9基因全长序列。RACE引物，PCR反应体系和程序如下所示。克隆结果如图2-B~G所示。

RACE引物为：

CIPK9:3’race primer A：5’-GTGGATGCCGTTTTCAATGACTCGAAGG-3'，

CIPK9:3’race primer B：5'-CCTCGAGAACTTATTTGAGAAGCAGACGGG-3'，

CIPK9:3’race primer C 5'-GAGAAGCAGACGGGTCTTGTGAAGCGAG-3'，

CIPK9:5’race primer A 5’-CCGCACTTGCTGCGACAGCGCAC-3’，

CIPK9:5’race primer B 5’-TCTGTTCGACCATCTTGTGACGCAGGACTTG-3’，

CIPK9:5’race primer C 5’-CTCCGGTCTCAATCTTGGCGAATTTCACC-3’，

RACE A item 的PCR反应体系（20μL）为：2μL 10′PCR Buffer、1.2μL Mg²⁺（25mM/L）、0.4μL 10′dNTP、0.1μL Tag（5.0U/ul）、1μLCIPK9:3’/ 5’race primer A（10uM/L）、1μL10′Universal Primer A Mix、1μL Template cDNA（100ng/ul）、13.3μL ddH₂O。

RACE A item 的PCR反应程序：95℃变性5min，67℃/69℃退火（3’end/5’end）30s，72℃延长（3’end/5’end）40s/35s，35循环。

RACE B和C item 的PCR反应体系（20μL）为：2μL 10′PCR Buffer、1.2μL Mg²⁺（25mM/L）、2μL dNTP、0.4μLKode、0.6μL Universal Primer A Mix、0.6μLCIPK9:3’/ 5’race primer B/C、1μLDiluent of race A product、12.2μL ddH₂O。

RACE B和C item 的PCR反应程序：94℃预变性2min，98℃变性10s，67℃/66℃/68℃/68℃退火（3’race B /3’raceC/5’raceB/5’raceC）30s，68℃延长（3’end/5’end）40s/35s，35循环。

（5）基因全长获取

根据CIPK9基因全长序列，利用Oligo7设计全长引物，克隆得到NtCIPK9全长基因，切胶回收目的条带，与pMD19-T连接后转入大肠杆菌，经过测序分析，确定CIPK9基因的ORF是完整的。唐古特白刺的CIPK9基因全长为1735bp，命名为NtCIPK9，具体序列如SEQ ID NO.1所示，所表达的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示，包括443个氨基酸的开放阅读框（ORF）。全长基因克隆的引物，PCR反应体系、程序以及克隆结果具体如下：

全长基因克隆引物为：

CIPK9:wl forward primer：5' –GGATCCATGAATAAGGTACCGGGGAC-3'，

CIPK9:wl reverse primer：5' –CCCGGGCGTGATTTCTTTACAGC-3'，

Forward restricted site of BamHI：5' -G∧GATCC-3'，

Reverse restricted site of SmaI：5' -CCC∧GGG-3'，

PCR反应体系（20μL）为：2μL 10′PCR Buffer、1.2μL Mg²⁺（25mM/L）、0.4μL 10′dNTP、0.1μL Tag（5.0U/ul）、1μLForward primer（10uM/L）、1μLReverse primer（10uM/L）、1μL Template cDNA（100ng/ul）、13.3μL ddH₂O。

PCR反应程序：95℃变性5min，63℃退火30s，72℃延长1min30s，35循环。

NtCIPK9基因片段克隆，5’RACE，3’RACE以及NtCIPK9基因全长克隆的PCR结果如图2所示，其中，图2-A为从白刺叶片中克隆到的CIPK9基因片段；B为CIPK9基因3’RACE A引物克隆产物；C为CIPK9基因3’RACE B引物克隆产物；D为CIPK9基因3’RACE C引物克隆产物；E为CIPK9基因5’RACE A引物克隆产物；F为CIPK9基因5’RACE B引物克隆产物；G为CIPK9基因5’RACE C引物克隆产物；H为CIPK9基因全长引物克隆产物。

实施例2基因功能验证

构建35S：CIPK9表达载体，转入野生型哥伦比亚拟南芥中，观察唐古特白刺NtCIPK9基因是否能增强拟南芥的耐盐性，比较转基因拟南芥和野生型拟南芥的表型差异，推测唐古特白刺CIPK9基因的功能。

1）载体的构建

本发明所用大肠杆菌菌株为E. coli JM109（宝生物工程（大连）有限公司购入）；表达载体为pBI 121（Biovector Co.,LTD公司购入）。

具体过程如下：

1.通过PCR向CIPK9基因片段上下游分别添加BamH I和SmaI酶切位点，PCR体系及反应条件同全长扩增，引物分别是：

NtCIPK9F+BamH：5’-CGCGGATCCATGAATAAGGTACCGGGGAC-3’，

NtCIPK9R+SmaI：5’-TCCCCCGGGACGTGATTTCTTTACAGCTTTTTC-3’，

2.PCR产物测序正确后，在T4连接酶的作用下，可进行载体的构建。使用BamHI和SmaI内切酶进行酶切反应处理空的pBI 121表达载体。

双酶切反应体系（20μL）为：2μL 10×K buffer、0.5μLBamH I、0.5μLSmaI、1μg回收产物、ddH₂O补足20μL。

37℃水浴，酶切4h。加入10×终止液停止酶切反应，1%琼脂糖凝胶电泳进行分离。用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（AXYGEN）进行回收并纯化酶切产物，溶于20μL的TE缓冲液中。

3.检测所回收的酶切产物浓度，按连接体系加入各试剂（目的片段分子数：载体分子数=3:1~5:1），16℃过夜连接。25μL连接反应体系为：2.5μL T4 DNA ligase buffer（ 10×）、5μL酶切的表达载体、15.5μL酶切的PCR产物、2μL T4 DNA ligase、ddH₂O补足25μL。

4.连接产物转化大肠杆菌JM109超感细胞，挑取单菌落接种到LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜；使用全长引物进行菌液PCR，以筛选阳性克隆，之后用AxyPrep Plasmid MiniprepKit（AXYGEN）提取质粒进行酶切验证。同时测序检测载体构建过程中是否发生突变或者缺失现象。构建表达载体如图3所示。

2）农杆菌的转化

1.本发明使用的农杆菌菌株为GV3101（ Biovector Co.,LTD公司购入）。采用的是液氮冻融法将构建好的pBI121+NtCIPK9表达载体转入农杆菌。具体过程为：1）冰浴融化GV3101感受态细胞，加入至少100ng回收纯化的表达载体质粒，轻轻混匀，冰浴20~30 min；2）液氮速冻l min，37℃热击3 min，迅速置于冰上1~2min；3）加入800 μL无抗生素的LB培养基，28℃，200 rpm复苏3.5h；4） 4000 rpm离心3 min，吸掉培养基；5）混匀剩余菌液，涂抹于添加50 mg.L^-1卡纳霉素的固体LB培基上；6） 28℃倒置培养30~48h；7）PCR检测阳性克隆，4℃保存备用。

2.待种植的健康状态的拟南芥生长至开花。将PCR检测的阳性克隆，摇菌至OD₆₀₀0.8时，进行拟南芥花器官浸泡转化。具体过程如下：1）将菌液5000 rpm，5 min离心，收集菌体，用5%蔗糖溶液悬浮；2）在浸泡前，加入SilwetL-77，浓度为0.05%（500 μL/L），晃出泡沫；3）将拟南芥的地上部分在农杆菌悬浮溶液中浸泡15~30 sec，期间轻轻晃动，4）将浸过的拟南芥平躺在托盘里，用保鲜膜覆盖保湿，锡箔纸密封避光24h；5）揭开锡箔纸，正常条件下培养，当种子成熟时停止浇水。

3.收获干燥的种子，将T1代种子进行筛选，筛选培养基：1/2MS+卡那霉素100mg/L+头孢200mg/L。筛选结果如图4所示。

4.再移至土里继续培养，收取T1代拟南芥种子后，将种子继续进行筛选获得T2代植株。然后，收取T2代拟南芥植株后，将种子继续进行筛选，获得纯合筛选出T3代纯合株系。

3）转NtCIPK9基因拟南芥抗盐性试验

1.选择3个株系的纯合转基因拟南芥种子各50粒分别放在含有0mM，100mM和150mM NaCl的1/2MS培养基上萌发，种子春化后放于光照下，5天后统计子叶萌发率，三个过表达纯合转基因株系和野生型拟南芥株系分别命名为OX-1，OX-2，OX-3和WT。三次重复试验同时进行。萌发率统计结果如图5所示。

统计结果显示，在正常条件下相同时间内（0mM NaCl处理），转NtCIPK9基因的三个过表达株系种子的子叶萌发率与野生型拟南芥种子的子叶萌发率无明显差异。在100mM盐处理条件下，过表达株系OX-1，OX-2和OX-3分别比野生型的子叶萌发率高15.3%，11.3%和14.6%，呈极显著性差异（P<0.01）。在150mM盐处理条件下，三个过表达株系分别比野生型高139.2%，60.7%和296.4%，其中OX-3与野生型之间差异极显著（P<0.01）。从萌发实验结果可知，NtCIPK9可以增强拟南芥种子萌发对盐的耐受性。

种子在含盐培养上萌发生长两周后，观察转基因植株和野生型植株的表型。三次重复试验同时进行。生长表型如图6所示。观察转基因拟南芥和野生型拟南芥的生长状态，可知NtCIPK9在正常条件下不会影响植株的生长发育，在100mM和150mM盐处理条件下，可以增强植物对盐的耐受性，表现出比野生型更好的生长状态。

2.将三个纯合株系拟南芥种子和野生型拟南芥种子正常萌发生长10天后，转移到分别含有0mM（未处理组）和150mM NaCl（处理组）的培养基上，生长10天后，观察其生长状态，并统计生物量。三次重复试验同时进行。试验植株生长表型如图7所示；试验植株生物量统计结果如图8、9和10所示，其中每个数据均来自于6个以上平行试验的平均值。

盐处理拟南芥幼苗的实验结果显示，NtCIPK9不会影响植株的正常生长，在盐处理条件下可以增强幼苗的抗盐能力。由统计数据可知，在正常生长条件下（0mM NaCl处理），转基因株系OX-1，OX-2和OX-3的叶片数量分别比野生型多27.9%，16.3%和27.9%，呈差异显著性（P<0.05）；在正常生长条件下，转基因株系OX-1，OX-2和OX-3的侧根数量分别野生型多-22.9%，4.9%和-18.0%；转基因株系OX-1，OX-2和OX-3的主根长度分别比野生型长-12.8%，21.5%和20.5%，其中OX-2与野生型之间差异显著（P<0.05）；转基因株系OX-1，OX-2和OX-3的植株整体干重比野生型重23.5%，13.0%和78.3%，其中OX-1与野生型之间差异显著（P<0.05）。在150mM NaCl处理条件下，转基因株系OX-1，OX-2和OX-3的叶片数量分别比野生型多-4.1%，4.1%和8.2%；转基因株系OX-1，OX-2和OX-3的侧根数量分别野生型多20.5%，44.1%和38.2%，其中OX-2与野生型之间呈差异显著性（P<0.05）；转基因株系OX-1，OX-2和OX-3的主根长度分别比野生型长61.1%，148%和70.3%，其中OX-2和OX-3与野生型之间呈差异极显著性（P<0.01）；转基因株系OX-1，OX-2和OX-3的植株整体干重比野生型重157.7%，76.3%和48.4%，OX-1和OX-2与野生型之间呈差异极显著性。综上分析可知，在盐环境中，转NtCIPK9基因的拟南芥植株与野生型相比，叶片数多，侧根数量多，主根长度长以及植株整体干重高，进一步证明了NtCIPK9基因可以增强拟南芥耐盐性的功能。

3.拟南芥种子萌发一周后，将转基因株系和野生型拟南芥各20株转移到泥炭土中生长，每盆种一株，两周后，配制200mM的盐水进行浇灌处理，处理周期为4天。三次重复试验同时进行。

盐水浇灌1天后，野生型拟南芥叶片轻微萎焉，转基因拟南芥为发生明显变化；第2天后，野生型叶片明显萎焉，转基因拟南芥叶片开始卷曲；第3天后，野生型拟南芥叶片出现枯死斑点，转基因拟南芥开始明显萎焉；第4天后，野生型拟南芥枯死，转基因拟南芥明显萎焉；其表型如图11所示。盐水浇灌处理4天后，用清水恢复，并观察后期生长。

200mM盐水处理4天后的拟南芥表型如图12所示，其中，A为清水恢复盐处理拟南芥1天后的表型图；B、C为清水恢复10后的表型图，可知，转基因拟南芥在清水恢复后，仍正常生长，并开花结果；野生型拟南芥在盐水浇灌处理4天后无法恢复，最终死亡。盐水浇灌试验结果进一步证明了NtCIPK9增强植株耐盐性的功能。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京林业大学

<120> 一种唐古特白刺NtCIPK9基因及其表达蛋白和应用

<130> 100

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1735

<212> DNA

<213> Nitraria tangutorum

<400> 1

gggcgaccta gaaacgtctt cactccgtcc ctccttccct ctgtatttac cacccaaact 60

ctgcaaagaa aaaacaacgt ttgcagagat tagataaaac caactttgtg cgcgtcgttt 120

tcgacagtta tccgaattgc ttccgattag ttataagtat cgtcagccgg tgtcgtctgg 180

caacgggaga ttttcgtcgt acttactgat cggacggcgg tgtcggaacg attgaaagca 240

tgaataaggt accggggacg aggacacgtg tggggaaata tgaaatagga aggacaattg 300

gtgagggtag ctttgccaag gtgaaattcg ccaagattga gaccggagag tttttcgcca 360

ttaaagtgct tgaccgtgat caagtcctgc gtcacaagat ggtcgaacag ataaagagag 420

agatatcaac aatgaagctg atcaagcatc ctaatgtcgt gaaaatgatt gaggttatgg 480

caagcaaaac aaagatctac attgttcttg agtttgtcga tgggggtgag ctctttgaca 540

aaattgcaag gactgggaaa ctcaaagaag atgaagcaag aagatatttc caccagctca 600

ttaatgctgt ggactattgt cacagtagag gggtgttcca cagagatttg aaaccggaga 660

atcttcttct tgacagatct ggcgctctga aaatttcaga tttcggttta agtgcgctgt 720

cgcagcaagt gcgggaagat gggctgcttc acacagcttg tgggactcca aattatgttg 780

ctcctgaggt gcttaatgac aaaggctatg atggtactgc atcggatgtt tggtcctgtg 840

gagtcattct ctttgtcctg atggcaggat acttaccttt tgatgagcca agtctaatgt 900

ccttatacag aaaaatatgc aaggctgagt tctcttgtcc atcatggttc tcatctggtg 960

ctaagaaatt gatcaagcgt attcttgacc caaatcctca tactcgaata actattttgg 1020

aaatattaga ggatgaatgg tttaagaagg ggtacaagcc accacaattt gataaggagg 1080

aagatgttaa tctagatgat gtggatgccg ttttcaatga ctcgaaggaa tatctcgtaa 1140

cagaaaggaa ggagaaacct gtatcaatga atgcttttga gctaatctcg aggtcacgga 1200

gttttaacct tgagaactta tttgagaagc aaacgggtct tgtgaagcga gaaacgcgtt 1260

ttacttccca acgcccggca aatgagatca tgtctaaaat tgaggaaact gcaaagcctt 1320

tgggcttcaa cgttcgcaaa ggaaactata agatgaagtt gcaaggtgac aaaagtggaa 1380

ggaaaggcca gctctctgta gccactgagg tgtttgaggt agctccctct gtgcacatgg 1440

tggaggtccg taaaactggt ggcgacacac tagaatttca caagttctac aaaactttct 1500

catcaggatt gaaagatgta gtctggcaaa cagaagaaaa tgacgaaaaa gctgtaaaga 1560

aatcacgtta ggaggatcgt gctgcttatc ctttccttct gattttttta catgccattg 1620

tccatacaaa cataccatac ccatagaaag tttgaagggt agggatgctt gactagcaca 1680

ggccatagtt gtgaaaaacg aactgaaaag cccacccaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1735

<210> 2

<211> 443

<212> PRT

<213> Nitraria tangutorum

<400> 2

Met Asn Lys Val Pro Gly Thr Arg Thr Arg Val Gly Lys Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Gly Arg Thr Ile Gly Glu Gly Ser Phe Ala Lys Val Lys Phe Ala Lys

20 25 30

Ile Glu Thr Gly Glu Phe Phe Ala Ile Lys Val Leu Asp Arg Asp Gln

35 40 45

Val Leu Arg His Lys Met Val Glu Gln Ile Lys Arg Glu Ile Ser Thr

50 55 60

Met Lys Leu Ile Lys His Pro Asn Val Val Lys Met Ile Glu Val Met

65 70 75 80

Ala Ser Lys Thr Lys Ile Tyr Ile Val Leu Glu Phe Val Asp Gly Gly

85 90 95

Glu Leu Phe Asp Lys Ile Ala Arg Thr Gly Lys Leu Lys Glu Asp Glu

100 105 110

Ala Arg Arg Tyr Phe His Gln Leu Ile Asn Ala Val Asp Tyr Cys His

115 120 125

Ser Arg Gly Val Phe His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Leu Leu Leu

130 135 140

Asp Arg Ser Gly Ala Leu Lys Ile Ser Asp Phe Gly Leu Ser Ala Leu

145 150 155 160

Ser Gln Gln Val Arg Glu Asp Gly Leu Leu His Thr Ala Cys Gly Thr

165 170 175

Pro Asn Tyr Val Ala Pro Glu Val Leu Asn Asp Lys Gly Tyr Asp Gly

180 185 190

Thr Ala Ser Asp Val Trp Ser Cys Gly Val Ile Leu Phe Val Leu Met

195 200 205

Ala Gly Tyr Leu Pro Phe Asp Glu Pro Ser Leu Met Ser Leu Tyr Arg

210 215 220

Lys Ile Cys Lys Ala Glu Phe Ser Cys Pro Ser Trp Phe Ser Ser Gly

225 230 235 240

Ala Lys Lys Leu Ile Lys Arg Ile Leu Asp Pro Asn Pro His Thr Arg

245 250 255

Ile Thr Ile Leu Glu Ile Leu Glu Asp Glu Trp Phe Lys Lys Gly Tyr

260 265 270

Lys Pro Pro Gln Phe Asp Lys Glu Glu Asp Val Asn Leu Asp Asp Val

275 280 285

Asp Ala Val Phe Asn Asp Ser Lys Glu Tyr Leu Val Thr Glu Arg Lys

290 295 300

Glu Lys Pro Val Ser Met Asn Ala Phe Glu Leu Ile Ser Arg Ser Arg

305 310 315 320

Ser Phe Asn Leu Glu Asn Leu Phe Glu Lys Gln Thr Gly Leu Val Lys

325 330 335

Arg Glu Thr Arg Phe Thr Ser Gln Arg Pro Ala Asn Glu Ile Met Ser

340 345 350

Lys Ile Glu Glu Thr Ala Lys Pro Leu Gly Phe Asn Val Arg Lys Gly

355 360 365

Asn Tyr Lys Met Lys Leu Gln Gly Asp Lys Ser Gly Arg Lys Gly Gln

370 375 380

Leu Ser Val Ala Thr Glu Val Phe Glu Val Ala Pro Ser Val His Met

385 390 395 400

Val Glu Val Arg Lys Thr Gly Gly Asp Thr Leu Glu Phe His Lys Phe

405 410 415

Tyr Lys Thr Phe Ser Ser Gly Leu Lys Asp Val Val Trp Gln Thr Glu

420 425 430

Glu Asn Asp Glu Lys Ala Val Lys Lys Ser Arg

435 440

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CIPK9 forward primer

<400> 3

gtgatcaagt cctgcgtcac aa 22

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CIPK9 reverse primer引物序列

<400> 4

ctacctcaaa cacctcagtg gctac 25

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CIPK9:3'race primer A引物序列

<400> 5

gtggatgccg ttttcaatga ctcgaagg 28

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CIPK9:3'race primer B引物序列

<400> 6

cctcgagaac ttatttgaga agcagacggg 30

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CIPK9:3'race primer C引物序列

<400> 7

gagaagcaga cgggtcttgt gaagcgag 28

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CIPK9:5'race primer A引物序列

<400> 8

ccgcacttgc tgcgacagcg cac 23

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CIPK9:5'race primer B

<400> 9

tctgttcgac catcttgtga cgcaggactt g 31

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CIPK9:5'race primer C引物序列

<400> 10

ctccggtctc aatcttggcg aatttcacc 29

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CIPK9:wl forward primer引物序列

<400> 11

ggatccatga ataaggtacc ggggac 26

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CIPK9:wl reverse primer

<400> 12

cccgggcgtg atttctttac agc 23

<210> 13

<211> 6

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Forward restricted site of BamHI引物序列

<400> 13

g∧gatcc 6

<210> 14

<211> 6

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Reverse restricted site of SmaI引物序列

<400> 14

ccc∧ggg 6

<210> 15

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> NtCIPK9F+BamH引物序列

<400> 15

cgcggatcca tgaataaggt accggggac 29

<210> 16

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> NtCIPK9R+SmaI引物序列

<400> 16

tcccccggga cgtgatttct ttacagcttt ttc 33

Claims

1.一种唐古特白刺NtCIPK9基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的唐古特白刺NtCIPK9基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述的唐古特白刺NtCIPK9基因在提高植物耐盐性中的应用。

4.含有权利要求1所述的唐古特白刺NtCIPK9基因的载体。

5.含有权利要求1所述的唐古特白刺NtCIPK9基因的宿主细胞。