CN104004772A - 一种杂交鹅掌楸LhPIN3基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种杂交鹅掌楸LhPIN3基因及其应用，该杂交鹅掌楸LhPIN3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明在建立成熟的杂交鹅掌楸体胚发生体系的基础上，克隆生长素运输蛋白基因LhPIN3，通过表达分析，证明了杂交鹅掌楸的LhPIN3基因在杂交鹅掌楸体胚发生过程中对胚性细胞发育和体胚苗生长有较大的影响，其过表达试验发现LhPIN3的过表达会影响植株的生长发育，另外LhPIN3的表达还可以部分拯救拟南芥LhPIN3基因功能完全丧失的pin1突变体，使其恢复表型，开花并结出荚果，因此可应用于植物体胚发生、不定根诱导、不定芽的诱导和分化等，具有很好的应用前景。

Description

一种杂交鹅掌楸 LhPIN3 基因及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种杂交鹅掌楸LhPIN3基因及其应用。

背景技术

20世纪生物技术在林木优良材料和新品种的发现与培育中的重要进步是体细胞胚胎发生技术及再生植株培育技术的应用。体胚发生技术由于其两极性、繁殖速度快、效率高等特点，已经成为优良林木资源快速无性繁殖的重要手段，并且它能和生物反应器结合实现大规模商业化生产。体细胞胚发生的本质是细胞分化的问题，细胞分化使体细胞发育成体细胞胚进而发育成一个完整植株。而细胞分化的分子基础则是基因差异表达与调控的结果。所以研究这些相关基因可以使我们更好的了解体细胞发生技术的原理。

杂交鹅掌楸是我国著名林木遗传育种家叶培忠教授利用分布在我国的中国鹅掌楸（Liriodendron chinensis （ Hemsl . ） Sarg .）和分布在北美的北美鹅掌楸（Liriodendron tulipifera Linn.）通过人工杂交育成的种间杂种。杂交鹅掌楸不仅具有生长快，抗性强，材质好，而且其树形美观，花色艳丽，是一种适用于庭院栽培，道路绿化，荒山荒地造林等多种用途的优良树种。杂交鹅掌楸虽然有许多优越性，但杂交制种受到季节和效率的限制，影响了杂交鹅掌楸的推广应用，由于植物体细胞胚具有数量多，一旦形成体细胞胚就能够快速发育成再生植株的特点，以体细胞胚胎发生技术快速繁殖种子来源困难的杂交鹅掌楸，具有重要的理论意义和应用价值。到目前为止，已经成功利用杂交种体细胞建立了杂交鹅掌楸体细胞胚胎发生技术和快速成苗体系，开辟了杂交鹅掌楸产业化开发的新途径。在杂交鹅掌楸体细胞胚胎发生体系的研究中发现，体细胞胚经过了球形胚、心形胚、鱼雷胚与子叶胚全过程，说明其发育过程与合子胚的发育完全相同，而且各个发育时期体细胞胚的形状与合子胚也非常接近。因此，在研究当中，利用体胚发生系统深入研究体细胞胚发生与发育的机制对于揭示细胞分化、发育、形态发生与胚胎发生发育过程等重大理论问题的机制，以及真核细胞中基因表达和调节控制等具有十分重要的意义。

植物生长调节剂的诱导和调节是离体培养条件下体细胞转化成胚性细胞的重要诱导因子。其中，生长素是诱导体细胞胚发生的关键因素。在体细胞胚的发生和发育过程中，生长素的极性运输和组织中心细胞与干细胞的形成起关键作用，它们通过启动胚性特征基因表达，最终决定体细胞原胚的产生，进而继续发育形成成熟体细胞胚。造成这种极性运输的原因是由于在运输生长素的细胞中生长素输出蛋白在质膜上的极性分布所致。很多研究已表明，生长素的运输蛋白在植物的胚后发育过程及植物的光形态建成和组织分化方面也起着非常重要的作用。生长素在植物组织中的极性分布很大程度上归功于高度调控、极性定位的输出载体PINs 蛋白。PINs 蛋白是生长素的输出载体，能使生长素从细胞内流出。PINs 蛋白家族各成员间存在功能冗余，并受多水平调节。在特异组织细胞中表达的各种PIN蛋白形成一个具有相同生化功能的PIN蛋白系统，此系统组成一个灵活的生长素分布网，对植物体生长发育相关事件作出应答。PIN蛋白是决定生长素流方向的基础，为植物体的各部分和细胞提供了特异的位置信息和方向信息。所以，PIN蛋白和生长素信号转导系统共同调节植物体的生长发育。

生长素的极性运输与植物的许多生长发育过程密切相关，但是生长素的调控机制有很多地方认识的都不够全面。最近几年，编码生长素运输蛋白的基因的克隆使人们对生长素极性运输的研究取得了很大的进展。截止目前为止，已经从拟南芥中至少克隆出来8个PIN基因，在水稻、玉米等植物中也得到了数个同源基因。根据这些基因在序列上的高度保守性说明在不同植物中也许在其生长发育过程中具有相同的功能。拟南芥中的PIN1 、 PIN2 、 PIN3 、 PIN4 、 PIN7已经被证实了在植物早期胚胎发育以及根的向地性、植物的伸长生长以及植物的向性反应中都具有一定的影响。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种杂交鹅掌楸LhPIN3基因。本发明的另一目的是提供杂交鹅掌楸LhPIN3基因在杂种鹅掌楸育种中的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种杂交鹅掌楸LhPIN3基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的杂交鹅掌楸LhPIN3基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的杂交鹅掌楸LhPIN3基因在杂交鹅掌楸育种中的应用。

含有杂交鹅掌楸LhPIN3基因的载体或宿主细胞。

PINs蛋白是生长素的输出载体，能使生长素从细胞内流出。在特异组织细胞中表达的各种PIN蛋白形成一个具有相同生化功能的PIN蛋白系统，此系统组成一个灵活的生长素分布网，对植物体生长发育相关事件作出应答。拟南芥与杂交鹅掌楸的PIN基因的过量表达都导致了植株生长缓慢、发育推迟。生长素对组织中心细胞与干细胞的形成起关键作用，通过启动胚性特征基因表达，最终决定体细胞原胚的产生，进而继续发育形成成熟体细胞胚。继而在植物的胚后发育过程及植物的光形态建成和组织分化方面也有重要的影响。

有益效果：与现有技术相比，本发明在建立成熟的杂交鹅掌楸体胚发生体系的基础上，克隆了生长素运输蛋白基因LhPIN3，通过表达分析，证明了杂交鹅掌楸的LhPIN3基因在杂交鹅掌楸体胚发生过程中对胚性细胞发育和体胚苗生长有较大的影响，其过表达试验发现LhPIN3的过表达会影响植株的生长发育，另外LhPIN3的表达还可以拯救拟南芥中功能完全丧失的pin1突变体，使其恢复表型，开花并结出荚果，因此可应用于植物体胚发生、不定根诱导、不定芽的诱导和分化等，具有很好的应用前景。

附图说明

图1是杂交鹅掌楸总RNA的1%琼脂糖凝胶电泳图；

图2是LhPIN3基因全长PCR产物的1%琼脂糖凝胶电泳图；

图3是双酶切反应结果的1%琼脂糖凝胶电泳图；

图4是LhPIN3表达载体酶切验证结果的1%琼脂糖凝胶电泳图；

图5是LhPIN3表达载体图；

图6是不同时期的杂交鹅掌楸材料图；

图7是LhPIN3基因在不同时期的实时定量结果图；

图8是T1代种子的筛选结果图；

图9是T1、T2代阳性植株检测结果图；

图10是LhPIN3过表达转基因拟南芥表型图；

图11是LhPIN3转拟南芥pin1突变体表型图；

图12是转LhPIN3基因拟南芥叶片组织培养表型图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

以杂交鹅掌楸为材料，提取总RNA，并反转成cDNA，设计相应引物进行PCR，琼脂糖凝胶电泳后，回收目的条带，与pMD19-T载体连接，转入大肠杆菌，测序并分析。挑取阳性克隆进行质粒抽提，加入酶切位点后与载体pBI121同时双酶切，在T4连接酶的作用下连接后，转入农杆菌GV3101中，待拟南芥适龄后，通过花器官浸泡转化法进行转化，观察T1，T2代和T3代转基因纯合体再生植株表型。

（1）总RNA的提取

以杂交鹅掌楸的侧芽为材料，按照NORGEN试剂盒（Norgen Biotek）的操作步骤进行RNA的提取，所使用的试剂和耗材均处理使其无RNA酶。杂交鹅掌楸总RNA的1%琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，条带清晰；测定总RNA的吸光度，OD₂₆₀/OD₂₈₀值为1.96，OD₂₆₀/OD₂₃₀为2.08，可见RNA质量较好。

RNA提取的具体过程为：加入600μL Lysis Solution磨样。将裂解液转移至新管中。混匀2min，使其彻底裂解，12000rpm离心2min，上清移至新管中。加入等体积的70%乙醇，涡旋混匀。将混合液移至柱子中（下接2mL收集管），离心1min，倒掉滤液，放回收集管。加入400μL Wash Solution ，离心1min，弃滤液，放回收集管。加入DNAI工作液，14000rpm离心1min，将滤液吸回柱子上，25℃-30℃静置15min。加入400μL Wash Solution，14000rpm离心1min，弃滤液。第三次加入400μL Wash Solution，14000rpm离心1min，弃滤液。将柱子放回收集管，14000rpm离心2min，弃收集管。将柱子放入1.7mL管子中加入50μL Elution Solution。200~2000rpm离心2min，14000rpm离心1min，体积不足50μL ，再用14000rpm离心1min。

（2）cDNA的获得

以所提RNA为模板，反转录获得cDNA，所使用的是Invitrogen公司的SuperScript® III First-Strand Synthesis Kit。实验中的RNA使用量为1μg，具体过程为：1）配置反应液（1μL RNA（≤5μg），1μL Primer（Oligo dT），1μL 10mM dNTP mix ，DEPC-Treated Water up to 10μL ），短暂低速离心后，65℃ 5min，立即置于冰上1~2min。2）向上一步的管中加入相应试剂（2μL 10×RT Buffer，4μL 25mM MgCl₂，2μL 0.1M DTT，1μL RNaseOUT （40U/μL），1μL SuperScript III RT），置于PCR仪上，反应程序为50℃ 50min，85℃ 5min。3）将上一步的反应液离心，每管中加入1μL 的RNase H ，37℃ 20min。

（3）基因全长的获得

设计引物，进行LhPIN3的克隆。引物如下：

PIN3-F：5'-ATTTACCACCCTTACCCCTCCCCT-3'；

PIN3-R：5'-CGTCGATCTACCTCTTTTGGAACT-3'。

20μL PCR扩增体系：2μL 10×PCR Buffer，0.4μL 10mM dNTPs，1.2μL MgSO₄（25mM），1μL Forward Primer，1μL Reverse Primer，2μL cDNA，0.1μL Platinum Taq，12.3μL ddH₂O。

PCR反应条件：94℃，4min；94℃，30s，58℃，30s，72℃，2min ，36 Cycles；72℃，10min；4℃，Forever。

LhPIN3基因全长PCR产物在1%琼脂糖凝胶进行电泳，结果如图2所示。

将上述PCR反应产物在1%琼脂糖凝胶进行电泳，使用AXYGEN公司的DNA凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化回收，具体过程为：在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体并切碎。计算凝胶重量（提前记录1.5mL离心管重量），该重量作为一个凝胶体积（如100mg=100mL）。加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75℃加热，间断混合（每2~3min），直至凝胶块完全熔化（约6~8min）。加1.5个凝胶体积的Buffer DE-B，混合均匀；当分离的DNA片段小于400bp时，加入1个凝胶体积的异丙醇。吸取上步中的混合液，转移到DNA制备管（置于2mL离心管）中，12000×g离心1min，弃滤液。将制备管重新置回2mL离心管，加500μL Buffer W1，12000×g离心30s，弃滤液。将制备管重新置回2mL离心管，加700μL Buffer W2，12000×g离心30s，弃滤液。以同样的方法再用700μL Buffer W2洗涤一次，12000×g离心1min。将制备管重新置回2mL离心管，12000×g离心1min。将制备管置于洁净的1.5mL离心管中，在DNA制备膜正中央加25~30μL ddH20，室温静置1min。12000×g离心1min洗脱DNA。

采用TaKaRa pMD19-T Vector （D102A）载体系统进行连接反应。反应体系如下：5μL Ligation Buffer，1μL PMD19-T Vector，4μL PCR纯化产物（50ng），dH₂O up to10μL 。用移液器吹打混匀，16℃孵育过夜。

将上述连接产物转入大肠杆菌中。具体过程如下：准备LB/Amp/X-gal/IPTG固体培养基（每板涂浓度为50mg/mL的IPTG溶液和20mg/mL的X-gal各40µl，室温下放置2-3小时）。从-70℃中取出感受态细胞，冰浴中融化。在无菌的1.5mL离心管中加入1~5µL连接产物。取100µL感受态细胞与连接产物轻轻混匀，冰浴中放置30min。42℃热激90秒，然后立即冰浴2min。加入800µL LB液体培养基（不含氨苄青霉素），37℃，100rpm振荡培养1.5小时。4000rpm离心3分钟，吸走800µL上清，沉淀在剩余的上清中重悬。取适量涂布于培养基上，37℃倒置培养12~16小时。

将得到的阳性克隆进行测序分析。测序发现，LhPIN3基因编码区长度为1917bp，序列如SEQ ID NO.1所示，所表达的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示，包括628个氨基酸的开放阅读框（ORF）。将测序所得到的序列在NCBI上进行比对。经比对发现，序列与拟南芥、杨树等的PIN基因同源性达到80%以上。

实施例2 基因功能验证

首先构建鹅掌楸LhPIN3表达载体，转入拟南芥pin1突变体中，观察鹅掌楸LhPIN3能否使突变体恢复表型，比较两者表型差异，推测鹅掌楸LhPIN3功能；构建35S﹕PIN3表达载体，转入拟南芥野生型中，观察表型，推测鹅掌楸LhPIN3功能。

1）载体的构建

本发明所用大肠杆菌菌株为E. coli JM109（宝生物工程（大连）有限公司购入）；表达载体为pBI 121（Biovector Co.,LTD公司购入）。

具体过程如下：

1、通过PCR在LhPIN3基因上下游分别添加XbaI和SmaI酶切位点。 PCR体系及反应条件同全长扩增，引物分别是：

PIN3-F+XbaI：5'-CCCCCGGGGGATTTACCACCCTTACCCCTCCCCT-3'；

PIN3-R+SmaI：5'-GCTCTAGAGCCGTCGATCTACCTCTTTTGGAACT-3'；

2、使用相应的内切酶进行酶切，得到含有粘性末端的并覆盖整个ORF的LhPIN3基因片段。用同样的酶切反应处理空的pBI121表达载体。

双酶切反应体系如下：

LhPIN3基因双酶切体系：2μL 10×T buffer，0.5μL XbaI，0.5μL SmaI，2μL 0.1%BSA，1μg回收产物，ddH₂O up to20μL。

37℃水浴，酶切4h。加入10×终止液停止酶切反应，1%琼脂糖凝胶电泳进行分离。

酶切结果如图3所示，根据条带大小判断出pBI121表达载体和LhPIN3基因已经被正确切开。

用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（AXYGEN）进行回收并纯化酶切产物，溶于20μL的TE缓冲液中。

3、检测所回收的酶切产物浓度，按连接体系加入各试剂（目的片段分子数：载体分子数=3:1~5:1），16℃过夜连接。连接反应体系如下：2.5μL T4 DNA ligase buffer（10×），5μL 酶切的表达载体，15.5μL 酶切的PCR产物，2μL T4 DNA ligase，ddH₂O up to25μL。

4、连接产物转化大肠杆菌JM109超感细胞，挑取单菌落接种到LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜；使用全长引物进行菌液PCR，以筛选阳性克隆，之后用AxyPrep Plasmid MiniprepKit（AXYGEN） 提取质粒进行酶切验证。同时测序检测载体构建过程中是否发生突变或者缺失现象。

酶切验证结果如图4，图中条带大小与之前完全相符，说明基因片段已成功插入pBI121中。

构建完成的表达载体如图5所示，从图中可清楚直观看出目的基因、启动子、终止子、标记基因的位置。

2）实时荧光定量PCR

选取固体培养的愈伤，悬浮培养的单细胞以及平板诱导的球形胚，子叶胚的材料和体胚苗的根、茎、叶、芽这8个时期进行LhPIN3的qRT-PCR，分析LhPIN3在不同培养条件以及不同生长时期的表达情况。具体过程如下：

实时定量PCR采用ABI公司的Power SYBR Green PCR Master Mix试剂盒，在ABI 7500 Real time PCR Systems（Applied Biosystems）上完成，每个样品反应三次重复，数据提取分析采用7500System SDS software （Applied Biosystems）。

1）RT-PCR引物的设计：根据RT-PCR的要求，设计了LhPIN3基因的引物，经过溶解曲线的分析，最终选择杂交鹅掌楸中的18S rRNA作为内参，引物如下：

PIN3 F-RT：5'-CGTCCCCCTTCTGTCATTCCACTTCATCTC-3'；

PIN3 R-RT：5'-GATCATCCATTCCAGGCTCCCGTTCCTCGT-3'；

2）RT-PCR反应体系：10µL 2 × Power SYBR Green PCR Master Mix，1µL Forward Primer，1µL Reverse Primer，1µL cDNA，7µL ddH₂O。

3）qRT-PCR反应条件：95℃，10min；95℃，15sec ，60℃，1min ，40 Cycles。

4）试验材料：所使用的材料为不同时期的杂交鹅掌楸材料，如图6所示，1-8依次为胚性愈伤组织，悬浮培养细胞，体胚诱导一周后的细胞，30天后的早期子叶胚，体胚苗的根尖（取根系茁壮的根系，从下往上取1-2厘米），茎（除去最幼嫩的叶子，由叶原基向下取1-2厘米），叶及侧芽。

5）试验结果：结果如图7所示，图中，1~8所对应的时期依次为1胚性愈伤，2悬浮培养的单细胞，3平板诱导一周的细胞，4子叶胚，5体胚苗的根，6体胚苗的茎，7体胚苗的叶子，8体胚苗的侧芽，根据实时定量PCR结果发现，LhPIN3基因在体胚苗的根中表达量明显高于其他部位。在体胚发生中以及早期子叶胚中的表达也出现了区别，这证明LhPIN3基因在杂交鹅掌楸胚性细胞发育和体胚苗生长过程中发挥了重要作用。

（4）农杆菌的转化

1、本发明使用的农杆菌菌株为GV3101（ Biovector Co.,LTD公司购入）。采用的是液氮冻融法将构建好的LhPIN3表达载体转入农杆菌。具体过程为：冰浴融化GV3101感受态细胞，加入至少100ng回收纯化的表达载体质粒，轻轻混匀，冰浴20~30min。液氮速冻lmin，37℃热击3min，迅速置于冰上1~2min。加入800μL无抗生素的LB培养基，28℃，200rpm复苏3.5h；4000rpm离心3min，吸掉培养基。混匀剩余菌液，涂抹于添加50mg.L^-1卡纳霉素的固体LB培基上。28℃倒置培养30~48h。PCR检测阳性克隆，4℃保存备用。

2、待种植的健康状态的拟南芥生长至开花。将PCR检测的阳性克隆，摇菌至OD0.8时，进行拟南芥花器官浸泡转化。具体过程为：将菌液5000rpm，5min离心，收集菌体，用5%蔗糖溶液悬浮；在浸泡前，加入SilwetL-77，浓度为0.05%（500μL/L）；将拟南芥的地上部分在农杆菌悬浮溶液中浸泡15~30sec，期间轻轻晃动，将浸过的拟南芥平躺在托盘里，用保鲜膜覆盖保湿，锡箔纸密封避光24h；揭开锡箔纸，正常条件下培养，当种子成熟时停止浇水；

（5）转基因植株表型观察

1、收获干燥的种子，将T1代种子用50mg.L^-1卡纳霉素的1/2MS培养基进行筛选。筛选结果如图8所示，图中可发现除了阳性植株仍然正常生长，其他的阴性植株无卡纳霉素抗性已经死亡。

2、将筛选出的可能的转基因阳性植株移栽到土里继续培养。提取转基因拟南芥的总DNA作模板进行PCR检测，确定其为阳性植株。T2代阳性植株检测方法也相同。检测结果如图9所示，图中发现阴性对照无条带，转基因植株PCR结果条带与阳性对照一致，确定为阳性植株。

3、分别移栽20棵COL、20棵LhPIN3过表达T2植株，生长30天，COL已经有17棵抽苔，都有12片莲座叶，抽苔比率为85%，而LhPIN3过表达T2植株仅有2棵抽苔，20棵植株都只有8片莲座叶，抽苔比率仅为10%。结果如下表：

	莲座叶叶片数	已抽苔数目	抽苔比率
				COL	12	12	85%
LhPIN3过表达-T2	8	2	10%

4、在生长40天、45天、50天时，对每棵植株的株高进行了测量。测量的平均值如下表：

	生长40天	生长45天	生长50天
				COL	25.7cm	31.3cm	35.8cm
LhPIN3过表达-T2	15.2cm	22,5cm	28.3cm

5、观察野生型和转LhPIN3过表达载体T2代拟南芥植株发现，结果如图10所示，图中，1为拟南芥野生型（COL）；2为转LhPIN3过表达载体后T2代拟南芥；3为拟南芥野生型（COL）的花；4为转LhPIN3过表达载体后T2代拟南芥的花。LhPIN3过表达-T2的花发育不完全，花序较小。而且植株矮小，分支数目少。荚果数量少。植株整体发育推迟且发育不良。

6、观察pin1突变体和转LhPIN3过表达载体的拟南芥pin1突变体发现，如图11所示，图中1为pin1突变体拟南芥；2~6为pin1突变体转LhPIN3过表达载体后T1代拟南芥。在生长30天的时候，与对照的针状性状相比，转基因植株的顶端出现了分生组织，形成了畸形花。生长40天后，开始形成类似于荚果状的东西，十分短小并且干瘪。部分拯救了pin1突变体的针型花序的性状。

由上可见，LhPIN3具有生长素运输的功能，拟南芥的过表达试验证明了LhPIN3基因的过表达载体能够影响植物的生长发育。此外LhPIN3基因的表达还可以部分拯救pin1突变体的表型。

（6）转LhPIN3基因拟南芥叶片离体培养表型

1、将筛选到的转LhPIN3基因纯合体种子用1/2MS培养基进行萌发培养，待长至8片真叶后取叶片进行离体培养。

2、图12所示，在培养基MS+IAA 0.4mg/L+6-BA 0.2mg/L（1、2）和MS+IAA 0.8mg/L+6-BA 0.2mg/L（3、4）上，转LhPIN3基因的拟南芥叶片与野生型拟南芥叶片生长表型不同。图中，野生型拟南芥叶片在MS+IAA 0.4mg/L+6-BA 0.2mg/L和MS+IAA 0.8mg/L+6-BA 0.2mg/L的培养基上（1，3）出现明显的愈伤化，而转LhPIN3基因拟南芥叶片则在愈伤化的基础上出现了不定芽的分化。由此可见， LhPIN3基因具有促进愈伤分化的功能，能够在植物组织培养中进行应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京林业大学

<120> 一种杂交鹅掌楸LhPIN3基因及其应用

<130> 100

<160> 24

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1917

<212> DNA

<213> 杂交鹅掌楸

<400> 1

atgatttcat ggaaggatct ttacacggtc ctgaccgccg tggtcccgct ctacgtggcc 60

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agggggaccc ttctccacgt ggcaatcgta caggcggctc ttccacaagg catcgttccc 1800

ttcgtttttg ccaaagaata caacgtccat cccgccattc tcagtacagc ggtcatattt 1860

ggaatgctga tcgctttacc gatcactctc gtttactaca tcattctcgg attatga 1917

<210> 2

<211> 628

<212> PRT

<213> 杂交鹅掌楸

<400> 2

Met Ile Ser Trp Lys Asp Leu Tyr Thr Val Leu Thr Ala Val Val Pro

1 5 10 15

Leu Tyr Val Ala Met Ile Leu Ala Tyr Gly Ser Val Arg Trp Trp Lys

20 25 30

Ile Phe Ser Pro Asp Gln Cys Ser Gly Ile Asn Arg Phe Val Ala Ile

35 40 45

Phe Ala Val Pro Leu Leu Ser Phe His Phe Ile Ser Thr Asn Asp Pro

50 55 60

Tyr Ser Met Asn Phe Arg Phe Ile Ala Ala Asp Thr Leu Gln Lys Ile

65 70 75 80

Ile Met Leu Val Val Leu Ala Leu Trp Thr Asn Leu Thr Arg Asn Gly

85 90 95

Ser Leu Glu Trp Met Ile Thr Ile Phe Ser Leu Ser Thr Leu Pro Asn

100 105 110

Thr Leu Val Met Gly Ile Pro Leu Leu Ile Ala Met Tyr Gly Glu Tyr

115 120 125

Ser Gly Ser Leu Met Val Gln Val Val Val Leu Gln Cys Ile Ile Trp

130 135 140

Tyr Thr Leu Leu Leu Phe Leu Phe Glu Tyr Arg Gly Ala Lys Met Leu

145 150 155 160

Ile Met Glu Gln Phe Pro Glu Thr Ala Ala Ser Ile Val Ser Phe Lys

165 170 175

Val Glu Ser Asp Val Met Ser Leu Asp Gly Arg Asp Phe Leu Gln Thr

180 185 190

Asp Ala Glu Ile Gly Asp Asp Gly Lys Val Thr Val Arg Lys Ser Thr

195 200 205

Ser Ser Arg Arg Ser Ile Gly Gly Gly Pro Cys Ser Ile Ser Gly Leu

210 215 220

Thr Pro Arg Pro Ser Asn Leu Thr Gly Ala Glu Ile Tyr Ser Leu Ser

225 230 235 240

Ser Ser Arg Asn Pro Thr Pro Arg Gly Ser Asn Phe Asn Asn Ser Asp

245 250 255

Cys Tyr Gly Met Cys Pro Thr Leu Gly Pro Arg Gln Ser Asn Phe Gly

260 265 270

Gln Ala Asp Leu Tyr Ser Leu Gln Ser Ser Arg Gly Pro Thr Pro Arg

275 280 285

Pro Ser Asn Phe Glu Glu Gln Met Ala Ser Ser Pro Arg Phe Gly Phe

290 295 300

Tyr Pro Thr Gln Ser Ala Gln Ala Ala Tyr Pro Ala Pro Asn Pro Glu

305 310 315 320

Ile Ser Ala Ile Gly Pro Lys Asn Ala Lys Thr His His Leu Gln Gln

325 330 335

Gln Gln Gln Gln Asn Lys Ala His His Asp Ala Lys Glu Met Phe Val

340 345 350

Trp Ser Ser Ser Ala Ser Pro Val Ser Glu Gly Gly Gly Val Phe Gly

355 360 365

Gly Thr Asp Phe Ser Gly Thr Glu Gln Ser Gly Arg Ser Asp His Gly

370 375 380

Ala Lys Glu Ile Arg Met Leu Val Ala Asp His Pro Gln Pro Glu Val

385 390 395 400

His Lys Ala Val Val Glu Gly Glu Asp Phe Val Gly Glu Asp Phe Ser

405 410 415

Phe Val Gly Arg Arg Gly Met Gly Glu Gly Glu Glu Asp Arg Asp Lys

420 425 430

Glu Gly Pro Ala Gly Leu Ser Lys Leu Gly Ser Ser Ser Thr Ala Glu

435 440 445

Pro Lys Gly Thr Ala Val Ser Asp Ser Gly Ala Gly Lys Gln Met Pro

450 455 460

Pro Ala Ser Val Met Thr Arg Leu Ile Leu Ile Met Val Trp Arg Lys

465 470 475 480

Leu Ile Arg Asn Pro Asn Thr Tyr Ser Ser Leu Ile Gly Leu Ile Trp

485 490 495

Ser Leu Val Ala Phe Arg Trp His Val Ser Met Pro Lys Ile Val Ala

500 505 510

Lys Ser Ile Ser Ile Leu Ser Asp Ala Gly Leu Gly Met Ala Met Phe

515 520 525

Ser Leu Gly Leu Phe Met Ala Leu Gln Pro Lys Ile Ile Ala Cys Gly

530 535 540

Asn Ser Ile Ala Ala Phe Ala Met Ala Val Arg Phe Leu Thr Gly Pro

545 550 555 560

Ala Val Met Ala Ala Ala Ser Ile Ala Val Gly Leu Arg Gly Thr Leu

565 570 575

Val Ala Ile Val Gln Ala Ala Leu Pro Gln Gly Ile Val Pro Phe Val

580 585 590

Phe Ala Lys Glu Tyr Asn Val His Pro Ala Ile Leu Ser Thr Ala Val

595 600 605

Ile Phe Gly Met Leu Ile Ala Leu Pro Ile Thr Leu Val Tyr Tyr Ile

610 615 620

Ile Leu Gly Leu

625

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PIN3-F

<400> 3

atttaccacc cttacccctc ccct 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PIN3-R

<400> 4

cgtcgatcta cctcttttgg aact 24

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PIN3-F+XbaI

<400> 5

cccccggggg atttaccacc cttacccctc ccct 34

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PIN3-R+SmaI

<400> 6

gctctagagc cgtcgatcta cctcttttgg aact 34

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PIN3 F-RT

<400> 7

cgtccccctt ctgtcattcc acttcatctc 30

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PIN3 R-RT

<400> 8

gatcatccat tccaggctcc cgttcctcgt 30

Claims (4)

1.一种杂交鹅掌楸LhPIN3基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的杂交鹅掌楸LhPIN3基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述的杂交鹅掌楸LhPIN3基因在杂交鹅掌楸育种中的应用。

4.含有杂交鹅掌楸LhPIN3基因的载体或宿主细胞。