CN103333901B

CN103333901B - 一种杂交鹅掌楸LhWOX1基因及其应用

Info

Publication number: CN103333901B
Application number: CN201310273285.1A
Authority: CN
Inventors: 陈金慧; 吴霜; 张艳娟; 施季森; 王鹏凯
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2013-07-02
Filing date: 2013-07-02
Publication date: 2014-10-22
Anticipated expiration: 2033-07-02
Also published as: CN103333901A

Abstract

本发明公开了一种杂交鹅掌楸LhWOX1基因及其应用，LhWOX1基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。LhWOX1基因是SAM发育所必需的报告基因。在SAM的生长发育中，LhWOX1起到了非常重要作用，它与干细胞marker基因CLV3形成了负反馈调节。在杂交鹅掌楸LhWOX1基因过表达的T1代植株中，干细胞的数量增加并存在进一步分化。这对于干细胞以及胚胎发育的研究都具有重要意义。在杂交鹅掌楸的LhWOX1基因过量表达的T1代植株中，植株的主茎发生了不同程度的螺旋化，说明LhWOX1参与维管组织的发育调控网络。可见，杂交鹅掌楸的LhWOX1基因在杂种鹅掌楸育种中将具有广泛的应用。

Description

一种杂交鹅掌楸LhWOX1基因及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种杂交鹅掌楸LhWOX1基因及其应用。

背景技术

杂种鹅掌楸是我国著名林木育种家叶培忠教授利用分布在我国的中国马褂木（L.chinese （ HEMSL. ） Sarg）和分布在北美的北美鹅掌楸（L.tulipifera Linn.）通过人工杂交育成的种间杂种。杂种鹅掌楸不仅具有生长快、抗性强、材质好，而且其树形美观、花色美丽，是一种适用于庭园栽培、道路绿化、荒山荒地造林等多种用途的优良树种。目前杂交鹅掌楸主要通过人工杂交的有性繁殖及扦插、嫁接等传统方法进行繁殖。但杂交制种效率低、种子量少，F1代的种子发芽率很低，同时由于扦插生根难，而嫁接繁殖系数又低，很大程度上限制了优良杂种的快速繁殖和利用，因此以传统的繁殖方式育苗，速度缓慢，优良种苗数量远远供不应求。陈金慧等利用固体培养基培养杂交鹅掌楸未成熟胚成功诱导了杂交鹅掌楸体细胞胚胎发生取得了重大进展，并成功进入工厂化生产育苗，在很大程度上缓解了这一供需矛盾。在后续研究中李婷婷、吴淳等建立了杂交鹅掌楸悬浮培养体系，并且通过物理筛选等技术实现体胚的高频同步化发生，同步化调控后的细胞能够依次经过球形胚、心形胚、鱼雷胚、子叶胚时期最后萌发成苗。这样为分子机理研究提供大量发育同步化的材料，方便体胚发生的机理研究。

在模式植物拟南芥中有14个WOX（WUSCHEL-related homeobox）类同源异型盒基因，这些基因编码的蛋白在同源异型结构域的下游还有一个由8个氨基酸（TLPLFPMH）组成的保守的WUS-box结构域。另外，到目前为止，还没有在植物以外的物种中发现类似基因，因此WOX基因是植物所特有的一类转录因子基因。研究表明植物所特有的WOX类转录因子在顶端发育中起着非常重要的作用。

在拟南芥中的研究发现，WOX1基因是SAM发育所必需的报告基因。在拟南芥过表达的突变体wox1-D中，叶片会变的更小、更深绿色，并且抑制花粉囊的裂开而导致雄性不育。通过分析WOX1基因启动子的GUS染色以及荧光实时定量PCR，发现WOX1也在新形成的叶片和柱头中表达。在wox1-D中，过表达的WOX1很可能是通过减小了茎尖组织的大小导致了植株的矮小。分子生物学方面的研究验证了WOX1基因与干细胞marker基因CLV3是一种负反馈调节。研究结果表明WOX1在拟南芥的组织发育中起到了重要角色，很可能是通过SAMDC的活性和多聚胺的内稳态，或者是通过CLV3的表达来实现。WOX1基因可能与器官的次生发育相关。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种杂交鹅掌楸LhWOX1基因。本发明的另一目的是提供杂交鹅掌楸LhWOX1基因在杂种鹅掌楸育种中的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种杂交鹅掌楸LhWOX1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的杂交鹅掌楸LhWOX1基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的杂交鹅掌楸LhWOX1基因在杂交鹅掌楸育种中的应用。

所述的杂交鹅掌楸LhWOX1基因的表达载体。

所述的杂交鹅掌楸LhWOX1基因的表达细胞。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点有：LhWOX1基因是SAM发育所必需的报告基因。在SAM的生长发育中，LhWOX1起到了非常重要作用，它与干细胞marker基因CLV3形成了负反馈调节。在杂交鹅掌楸LhWOX1基因过表达的T1代植株中，干细胞的数量增加并存在进一步分化。这对于干细胞以及胚胎发育的研究都具有重要意义。在杂交鹅掌楸的LhWOX1基因过量表达的T1代植株中，植株的主茎发生了不同程度的螺旋化，说明LhWOX1参与维管组织的发育调控网络。可见，杂交鹅掌楸的LhWOX1基因在杂种鹅掌楸育种中将具有广泛的应用。

附图说明

图1是杂交鹅掌楸侧芽总RNA的1%琼脂糖凝胶电泳图；

图2是PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳图；

图3是酶切结果1%琼脂糖凝胶电泳图；

图4是构建的LhWOX1基因表达载体结构示意图；

图5是实验材料示意图；

图6是LhWOX1基因在不同时期的实时定量结果图；

图7是T1代种子示意图；

图8是T1表型示意图；其中， A主茎基部有器官增生表皮毛增多，B为X相应部位的野生型对照；C茎段侧枝发生扭曲和器官增生，表皮毛增多，D为野生型对照；

图9是T1代转基因植株茎段中间部位形成体细胞胚图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

以杂交鹅掌楸的侧芽为材料，提取总RNA，并反转成cDNA，设计相应引物进行PCR，琼脂糖凝胶电泳后，回收目的条带，与pMD19-T载体连接，转入大肠杆菌，测序并分析。

1）总RNA的提取

以杂交鹅掌楸的侧芽为材料，按照NORGEN试剂盒（Norgen Biotek）的操作步骤进行RNA的提取，所使用的试剂和耗材均处理使其无RNA酶。杂交鹅掌楸侧芽总RNA的1%琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，条带清晰；测定总RNA的吸光度，OD₂₆₀/OD₂₈₀值为2.07，OD₂₆₀/OD₂₃₀为2.09，可见RNA质量较好。

RNA提取的具体过程如下：

（1）加入600μL Lysis Solution磨样；（2）将裂解液转移至新管中；（3）混匀2min，使其彻底裂解，12000rpm离心2min，上清移至新管中；（4）加入等体积的70%乙醇，涡旋混匀；（5）将混合液移至柱子中（下接2μL收集管），离心1min，倒掉滤液，放回收集管；（6）加入400μL Wash Solution，离心1min，弃滤液，放回收集管；（7）加入DNA I工作液，14000rpm离心1min，将滤液吸回柱子上，25℃-30℃静置15min；（8）加入400μL Wash Solution，14000rpm离心1min，弃滤液；（9）第三次加入400μL Wash Solution，14000rpm离心1min，弃滤液；（10）将柱子放回收集管，14000rpm离心2min，弃收集管；（11）将柱子放入1.7μL管子中加入50μL Elution Solution；（12）200~2000rpm离心2min，14000rpm离心1min，体积补足50μL，再用14000rpm离心1min。

2）cDNA的获得

采用Invitrogen公司的SuperScript® III First-Strand Synthesis Kit，以获得的RNA为模板，反转录获得cDNA，具体过程如下：

（1）配置反应液体系，短暂低速离心后，65℃ 5min，立即置于冰上1~2min；10μL反应液体系为：1μL RNA（≤5μg），1μL Primer（Oligo dT），1μL 10mM dNTP mix，DEPC-Treated Water补足10μL。

（2）向上一步的管中加入以下相应试剂，置于PCR仪上，反应程序为50℃ 50min，85℃ 5min；相应试剂为：2μL 10×RT Buffer，4μL 25mM MgCl₂，2μL 0.1M DTT，1μL RNaseOUT （40U/μL），1μL SuperScript III RT。

（3）将上一步的反应液离心，每管中加入1μL的RNase H，37℃ 20min。

3）目的基因的同源克隆

利用Oligo设计兼并引物，进行降落PCR或梯度PCR，从而获得目的产物，进行转化测序，最后进行比对分析。

兼并引物为：Lhw1F：5’-GAGAGAGGTTCATCTACTTCATTGCA-3’，Lhw1R：5’-CATTAGGTCATTTGTACCGTGGA-3’。

20µL PCR扩增体系为：2µL 10×PCR Buffer，0.4µL 10mM dNTPs，1.2µL MgSO₄（25mM），1µL Lhw1F，1µL Lhw1R，2µL cDNA，0.1µL Platinum Taq，12.3µL ddH₂O。

PCR反应条件为：94℃，4min；94℃，30s，54℃，30s，72℃，45s，36 Cycles；72℃，10min；4℃，保持。

取PCR产物，进行1%琼脂糖凝胶电泳后，结果如图2所示。并切胶回收目的条带。

4）基因全长的获得

回收目的条带，进行TA克隆与pMD19-T连接后转入大肠杆菌，经过测序分析，LhWOX1基因的ORF完整，LhWOX1全长1100bp，序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2

本发明所用大肠杆菌菌株为E. coli JM109（宝生物工程（大连）有限公司购入）；表达载体为pBI 121（Biovector Co.,LTD公司购入）。

（1）鹅掌楸LhWOX1表达载体构建具体过程如下：

1）通过PCR向LhWOX1基因片段上下游分别添加BamH I和Sac I酶切位点，PCR体系及反应条件同全长扩增，引物分别是：

W1F+BamH I：5’-Agaggatccgagagaggttcatctacttcattgca-3’

W1R+Sac I：5’-TTCGAGCTCCATTAGGTCATTTGTACCGTGGA-3’。

2）测序正确后与载体同时进行双酶切。之后在T4连接酶的作用下，进行载体的构建。使用BamH I和Sac I内切酶进行酶切，得到含有粘性末端的并覆盖整个ORF的LhWOX1基因片段。用同样的酶切反应处理空的pBI 121表达载体。

双酶切反应体系如下：2µL 10×K buffer，0.5µL BamH I，0.5µL Sac I，1μg回收产物，ddH₂O补足20µL。

37℃水浴，酶切4h。加入10×终止液停止酶切反应，1%琼脂糖凝胶电泳进行分离。酶切结果如图3所示。

用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（AXYGEN）进行回收并纯化酶切产物，溶于20μl的TE缓冲液中。

3）检测所回收的酶切产物浓度，按连接体系加入各试剂（目的片段分子数：载体分子数=3~5:1），16℃过夜连接。连接反应体系为：2.5µL T4 DNA ligase buffer（10×），5µL酶切的表达载体，15.5µL酶切的PCR产物，2µL T4 DNA ligase，ddH₂O补足25µL。

4）连接产物转化大肠杆菌JM109超感细胞，挑取单菌落接种到LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜；进行菌液PCR，以筛选阳性克隆，之后用AxyPrep Plasmid MiniprepKit（AXYGEN）提取质粒进行酶切验证。同时测序检测载体构建过程中是否发生突变或者缺失现象。构建表达载体如图4所示。检测结果正确。

（2）实时荧光定量PCR

选取固体培养的愈伤，悬浮培养的单细胞以及平板诱导的早期原胚，球形胚，心形胚，子叶胚的材料，进行LhWOX1的qRT-PCR，分析LhWOX1在不同培养条件以及不同生长时期的表达情况。具体过程如下：

实时定量PCR采用ABI公司的Power SYBR Green PCR Master Mix试剂盒，在ABI 7500 Real time PCR Systems （Applied Biosystems）上完成，每个样品反应三次重复，数据提取分析采用7500 System SDS software （Applied Biosystems）。

qRT-PCR引物的设计：根据qRT-PCR的要求，设计LhWOX1基因的引物，经过溶解曲线的分析，最终选择杂交鹅掌楸中的18S rRNA作为内参，引物如下：

LhWOX1 F：5’-TACCCCACCACCCCACTTTC-3’，

LhWOX1 R：5’-AAACTGGATGAACTGGCGAGAAC-3’。

RT-PCR反应体系为：10µL 2 × Power SYBR Green PCR Master Mix，1µL LhWOX1 F，1µL LhWOX1 R，1µL cDNA， ddH₂O补足20µL。

qRT-PCR反应条件为：95℃，10min；95℃，15sec，60℃，1min，40 Cycles；

试验材料：所使用的材料，如图5所示，不同时期的杂交鹅掌楸材料包括：胚性愈伤（A），悬浮培养的细胞（B），液体过渡培养2天后的悬浮细胞（C），体胚诱导一周后的细胞（D），诱导2周后的鱼雷胚（E），30天后的早期子叶胚（F），45天后的子叶胚（G），体胚苗的根尖（H，取根系茁壮的根系，从下往上取1-2厘米）。

试验结果：实时定量PCR结果如图6所示，A~H所对应的时期依次为A胚性愈伤，B悬浮培养的细胞，C液体过渡培养2天后的悬浮细胞D平板诱导一周的细胞，E诱导2周后的早期球形胚，F 30天后的早期子叶胚子叶胚，G 45天后的早期子叶胚子叶胚，H体胚苗的根；根据该实时定量PCR结果发现，LhWOX1基因在体胚发生的过程中表达量出现了差异，与它所行使的功能相关。

实施例3

本发明使用的农杆菌菌株为GV3101（Biovector Co.，LTD公司购入）。采用的是液氮冻融法将构建好的LhWOX1表达载体转入农杆菌。具体过程为：1）冰浴融化GV3101感受态细胞，加入至少100ng回收纯化的表达载体质粒，轻轻混匀，冰浴20~30 min；2）液氮速冻l min，37℃热击3min，迅速置于冰上1~2min；3）加入800µL无抗生素的LB培养基，28℃，200 rpm复苏3.5h；4）4000rpm离心3min，吸掉培养基；5）混匀剩余菌液，涂抹于添加50mg·L^-1卡纳霉素的固体LB培基上；6）28℃倒置培养30~48h；7）PCR检测阳性克隆，4℃保存备用。

待种植的健康状态的拟南芥生长至开花。将PCR检测的阳性克隆，摇菌至OD 0.8时，进行拟南芥花器官浸泡转化。具体过程为：1）将菌液5000rpm，5min离心，收集菌体，用5%蔗糖溶液悬浮；2）在浸泡前，加入SilwetL-77，浓度为0.05%（500µL/L），晃出泡沫；3）将拟南芥的地上部分在农杆菌悬浮溶液中浸泡15~30 sec，期间轻轻晃动，4）将浸过的拟南芥平躺在托盘里，用保鲜膜覆盖保湿，锡箔纸密封避光24h；5）揭开锡箔纸，正常条件下培养，当种子成熟时停止浇水。

收获干燥的种子，将T1代种子利用50mg/L卡那霉素进行筛选。筛选结果如图7所示。再移至土里继续培养，观察T1代表型。如图8所示， LhWOX1基因在SAM发育中起到了重要的作用。与AtWOX1基因的过表达产生的表型不同的是，LhWOX1基因的过表达还导致了拟南芥主茎发生了不同程度的螺旋化，表明LhWOX1参与植物维管组织的发育。作为WOX基因家族的一员，LhWOX1基因在干细胞的产生和维持方面也起着一定的作用。从T1代的所产生的表型中可以看出，LhWOX1基因的过表达导致了干细胞数量的增加，产生了增生组织，并且这些增生组织在进一步分化。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京林业大学

<120> 一种杂交鹅掌楸LhWOX1基因及其应用

<130> 100

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1100

<212> DNA

<213> Liriodendron chinense × tulipifera

<400> 1

gcaggtcgac gattgagaga ggttcatcta cttcattgca acaatgtgga tgatgggttg 60

tagagatggg agtggtttaa acacttccga ttcgatcaac ggtcggaaac tccgccctct 120

gattccaagg cccagttctt cttcttcctc ctcttccaca cccagcacaa caactgcaac 180

cacatcgtct tcgagcttga gtcgaattca tggcaatgat cttctctcct tacataacca 240

tcttggaaca atggaacatg gaaaacgcga gttgagtact cagccggtga gttcacggtg 300

gaatccgacg cctgaacagc taaggacact cgaggatttg tatcgacgag gcacaaggac 360

cccaaccgca gatcaaatcc agtacatcac ggcgcagctt cggcgatatg gtaggattga 420

agggaagaac gtattctact ggtttcagaa ccacaaggcg agggagcggc agaagcgtaa 480

gcgtaggatt gaagtagccg ctgccgcgga gcgcaatgca gagagtgagg agaggaaaga 540

tttggagatg agcaggaaag ggtttgaagc tgaagggtgc aagagctggc catctcctac 600

aaactgcagt acccttgcag aggaatctgc tcctatgtct agaccagaaa gtaggagaga 660

tactgcatgg cttcagtgca gccgagagtt acaaaaccac ggctcttcag atgggaatgc 720

cacgtggcag atgatgcatc tctgctccct gccccacctc ataaacgcat accccaccac 780

cccactttca attcgaaccg tagccacagc cacagcagca gctatagtgg agtcaaagaa 840

tacagtcaat gaagattttg atgtgggtgg cccacccagt gggccatcac agactcttaa 900

gctgtttcct ctccgtagcg atggcatcgc ggtcgctgag aaggcgtcgg ccgcaccagc 960

gaatctaaat acagcggcga ccactgattt ctgttctcgc cagttcatcc agtttctccc 1020

attgaagaat tgaaggtcta ggctccaatc cacggtacaa atgacctaat gaatctctag 1080

aggatccccg ggtaccgagc 1100

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Lhw1F引物序列

<400> 2

gagagaggtt catctacttc attgca 26

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Lhw1R引物序列

<400> 3

cattaggtca tttgtaccgt gga 23

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> W1F+BamH I引物序列

<400> 4

agaggatccg agagaggttc atctacttca ttgca 35

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> W1R+Sac I引物序列

<400> 5

ttcgagctcc attaggtcat ttgtaccgtg ga 32

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> LhWOX1 F引物序列

<400> 6

taccccacca ccccactttc 20

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> LhWOX1 R引物序列

<400> 7

aaactggatg aactggcgag aac 23

Claims

1.一种杂交鹅掌楸LhWOX1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的杂交鹅掌楸LhWOX1基因在杂交鹅掌楸育种中的应用。

3.含有权利要求1所述的杂交鹅掌楸LhWOX1基因的表达载体。