CN107760721A - 一种基因枪介导的杂交鹅掌楸转化体系的构建方法 - Google Patents

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陈金慧
施季森
顾婧
李美平
王丹
成铁龙
杨立明
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Abstract

本发明公开了一种基因枪介导的杂交鹅掌楸转化体系的构建方法，包括：1）取杂交鹅掌楸胚性愈伤组织，进行高渗处理；2）提取质粒，制备金粉，制备微弹；3）基因枪轰击；4）将愈伤组织转移至恢复平日养鸡进行暗恢复培养；5）体胚诱导培养，长出体胚后进行光照培养，长出小苗后接种于生根培养基进行筛选培养；6）分子检测，获得杂交鹅掌楸转化体系。本发明的基因枪介导的杂交鹅掌楸转化体系的构建方法，不仅探索出了基因枪转化杂交鹅掌楸体系的可行性，还为今后用基因枪介导目的基因转化杂交鹅掌楸提供了可靠的实验基础，从而不仅为功能基因转化杂交鹅掌楸开创了一种新的技术，还为研究各功能基因在杂交鹅掌楸中的作用提供技术支持。

Description

一种基因枪介导的杂交鹅掌楸转化体系的构建方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种基因枪介导的杂交鹅掌楸转化体系的构建方法。
背景技术
目前植物转基因技术主要有农杆菌转化法、基因枪轰击法、花粉管通道法、PEG介导法、电击转化法、脂质体转化法、低能离子束介导法、超声波介导法、激光微束穿孔法等。其中，农杆菌介导的遗传转化应用最为广泛，处于主导地位，但不足之处在于它不适用于单子叶植物，然而基因枪轰击法能克服这一缺陷，不仅不受转化受体的限制，而且操作简单，因此，基因枪转化法在林木遗传育种上的应用研究将会变得越来越广泛。
基因枪法又称微弹轰击技术，基本原理是用金属微粒包裹外源目的基因，再借助高压作用力，将微粒高速射进受体材料，包裹在微粒上的质粒随之进入细胞并整合到染色体上后表达，最终实现目的基因的转化。1987年美国康奈尔大学John Sanford教授对基因枪的成功研制标志着基因枪转化技术应用的开始，并于20世纪80年代末期逐渐发展起来。这种方法可以直接导入外源基因，并克服农杆菌的寄主特异性等问题，目前在单子叶植物中应用最为广泛。
用于基因枪转化的受体材料来源非常广泛，目前主要以愈伤组织、胚性悬浮细胞、幼胚和成熟胚为主。目前很多植物如水稻、棉花、玉米、大豆等都已通过此方法得到转化。与其它转基因技术相比，基因枪转化法具有无宿主限制、靶受体类型广泛、可控程度高、操作简单快速等优点，其中该转化体系的最大优势是可以将目的基因导入到特定的植物受体细胞中，并且可以最大限度地避免因组织培养而造成的各种变异。但是，基因枪转化技术依旧存在着一些缺点需要进一步探讨改进，主要有：费用较高；转化效率低；稳定遗传的比例较低；转化后外源DNA的结构变化复杂，如DNA环化、甲基化和片断分离、丢失或重排等；外源基因序列经常多拷贝插入，嵌合体多，且不易排除；遗传稳定性差，且易产生基因沉默现象；外源基因的整合机制等理论问题也不是很清楚。因此利用此法进行遗传转化仍需解决很多问题，尤其是转化效率低的问题。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种基因枪介导的杂交鹅掌楸转化体系的构建方法，以杂交鹅掌楸的胚性愈伤组织和悬浮细胞系为基因枪遗传转化的受体材料，建立起高效和稳定的遗传转化体系，提高基因枪的转化效率。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种基因枪介导的杂交鹅掌楸转化体系的构建方法，步骤如下：
1)取杂交鹅掌楸胚性愈伤组织，进行高渗处理；
2)提取质粒，制备金粉，制备微弹；
3)基因枪轰击；
4)将愈伤组织转移至恢复平日养鸡进行暗恢复培养；
5)体胚诱导培养，长出体胚后进行光照培养，长出小苗后接种于生根培养基进行筛选培养；
6)分子检测，获得杂交鹅掌楸转化体系。
步骤1)中，将生长状态良好的杂交鹅掌楸胚性愈伤组织转移到含0.4M甘露醇的高渗培养基中，进行高渗处理，4-6h后用于基因枪的轰击。
步骤2)中，质粒载体为pJIT166-GFP。
步骤3)中，轰击时，金粉用量250-1000μg/枪。
步骤3)中，轰击时，真空度20-28inch Hg。
步骤3)中，轰击时，质粒用量1.0-1.5μg/枪。
步骤3)中，轰击时，轰击距离6-9cm。
步骤3)中，轰击时，轰击次数1-2次。
步骤3)中，轰击时，金粉用量750μg/枪、真空度28inch Hg、质粒用量1.5μg/枪、轰击距离9cm、轰击次数1次。
所述的基因枪介导的杂交鹅掌楸转化体系的构建方法所获得的杂交鹅掌楸转化体系在LhWOX1基因转化杂交鹅掌楸胚性愈伤组织中的应用。
有益效果：与现有技术相比，本发明的基因枪介导的杂交鹅掌楸转化体系的构建方法，通过基因枪介导的GUS基因转化杂交鹅掌楸胚性愈伤组织试验证实，GUS基因已成功整合到杂交鹅掌楸基因组中并能稳定表达。经过卡那霉素(kan)抗性筛选，获得了166株kan抗性的转GUS基因的再生植株，再随机抽取其中的33棵幼苗进行分子检测，结果表明GUS基因已经整合进入杂交鹅掌楸的基因组中，并且获得转GUS基因的体胚再生植株的阳性率为69.7％。通过对基因枪介导的LhWOX1基因转化杂交鹅掌楸胚性愈伤组织生长出的体胚苗进行卡那霉素(kan)抗性筛选，获得了135株kan抗性的转LhWOX1基因的再生植株，再从中随机抽取35棵幼苗进行分子检测，结果表明LhWOX1基因已经成功整合进入杂交鹅掌楸的基因组中，并且获得转LhWOX1基因的体胚再生植株的阳性率为65.7％。可见该方法不仅探索出了基因枪转化杂交鹅掌楸体系的可行性，还为今后用基因枪介导目的基因转化杂交鹅掌楸提供了可靠的实验基础，从而不仅为功能基因转化杂交鹅掌楸开创了一种新的技术，还为研究各功能基因在杂交鹅掌楸中的作用提供技术支持。
附图说明
图1是愈伤组织轰击后在荧光显微镜下的瞬时表达情况结果图；图中，a.阴性对照(低倍镜下)；b.低倍镜下的转化细胞；c-f.高倍镜下的转化细胞；g-i.低倍镜下的转化细胞，其中g在明场下，h在荧光下，i为合并后；j-l.高倍镜下的转化细胞，其中j在明场下，k在荧光下，l为合并后；
图2是部分转GUS基因的愈伤在不同诱导时期的体胚生长状态图；图中，
a.体胚诱导15d时的生长状态；b.体胚诱导20d时的生长状态；c.体胚诱导25d时的生长状态；d.体胚诱导30d时的生长状态；e.体胚诱导35d时的生长状态；
图3是体胚苗经kan抗性筛选后的转GUS基因阳性植株图；
图4是不同生长阶段的GUS染色结果图；图中，a-c：体胚苗的GUS染色；d和e：幼叶的GUS染色；
图5是转GUS基因杂交鹅掌楸植株基因组DNA的PCR检测结果图；图中，M：DNA分子量；CK+：质粒DNA(阳性对照)；CK-：未转化植株(阴性对照)；1～6：转基因阳性植株；7～8：转基因阴性植株；
图6是转LhWox1基因杂交鹅掌楸植株基因组DNA的PCR检测结果图；图中，M:DNA 分子量；CK+：质粒DNA(阳性对照)；CK-：未转化植株(阴性对照)；1～2，4～6，8:转基因阳性植株；3和7:转基因阴性植株。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
以下实施例中使用的主要材料和试剂如下：
胚性愈伤组织继代培养基：3/4MS+6-BA 0.25mg/L+2,4-D 2.0mg/L+VC5mg/L+LH0.5g/L+蔗糖30g/L+水晶洋菜2.4g/L pH5.7-5.8。
胚性愈伤组织高渗培养基：3/4MS+6-BA 0.25mg/L+2,4-D 2.0mg/L+VC 5mg/L+LH0.5g/L+蔗糖30g/L+水晶洋菜2.4g/L+甘露醇0.4M pH5.7-5.8。
LB培养基：NaCl 10g/L，Trytone 10g/L，Yeast Extract 5g/L，Agar 15g/L，pH7.0。
实施例1
本实施例使用的材料为：杂交鹅掌楸胚性愈伤组织，质粒载体为pJIT166-GFP。
1、采用QIAGEN Plasmid Midi and Maxi Kits试剂盒提取纯化质粒。
1)提取前的准备：将RNase A加入到Buffer P1中，使其最终浓度为100ug/mL，在2-8℃的条件下保存。将LyseBlue加入Buffer P1中，使用前要轻轻晃动瓶身以确保LyseBlue混匀。检查Buffer P2中SDS状态。Buffer P3要先进行预冷。
2)质粒提取过程：(1)用枪头从菌落培养基中挑取一个单菌落，然后接种到2mL含卡那霉素的LB培养基中，于37℃，300rpm条件下培养8h。其中，所用烧瓶的容量至少是培养基容量的4倍。(2)稀释起始培养物1/1000到1/500，然后接种到含卡那霉素的LB培养基中，一般接种的培养基用量为500mL，于37℃，300rpm条件下培养12-16h。其中，烧瓶的容量如上一步所述，并且培养物的浓度要在3×109到4×109个细胞/毫升之间，对应的沉淀物净重约为3克/升培养基。(3)将所得的菌液于4℃，6000×g的条件下离心15min，打开离心管，倒净上清液，直至所有培养基流净，收集获得菌体。(4)加入10mL Buffer P1，通过上下吹打使菌体充分重悬，直至无细胞团块。(5)加入10mL Buffer P2，上下缓慢颠倒混匀4-6次后出现蓝色的细菌悬液，若4-6次后悬液没有变蓝，则继续颠倒混匀直到显色，变色后室温下裂解5min。(6)加入10mL预冷的Buffer P3，立即轻轻颠倒混匀4-6次直至蓝色溶液变清而出现白色絮状沉淀，溶解产物变得不再粘稠。若混合物仍然粘稠，呈褐色，则需充分混匀以完全中和溶液，然后于冰上放置15min。(7)在温度为4℃，转速不小于20000×g的条件下离心30min，然后将含有质粒DNA的上清液迅速转移到新的离心管中，其中要确保离心后的上清液是清透的。(8)再次在温度为4℃，转速不小于20000×g的条件下离心15min，然后将含质粒DNA的上清液迅速转移。在此可以从上清液中取出120μL的样本，用于后续的凝胶分析。(9)加入10mLBuffer QBT以平衡一管QIAGEN-tip500，依靠重力作用使其完全流空。(10)将第8步中获得的上清液迅速加至QIAGEN-tip500中，借助重力作用使其进入树脂。此处可以从滤液中取120μL的样本，用于后续的凝胶分析，以便检测QIAGEN树脂的DNA结合效率。(11)用2×30mL Buffer QC冲洗QIAGEN-tip500。让Buffer QC经重力作用流过QIAGEN-tip500，第一遍冲洗去除大部分质粒DNA的污染物，第二遍冲洗大量的碳水化合物。此处可以从冲洗液中取出240μL样本，用于后续的凝胶分析。(12)用15mL Buffer QF洗脱DNA。用30mL离心管收集洗脱液。此处可以从洗脱液中取60μL样本，用于后续的凝胶分析。(13)加入10.5mL(0.7倍体积)室温异丙醇到洗脱液中使DNA沉淀，立即混匀后于温度为4℃，转速不小于15000×g的条件下离心30min，然后小心倒出上清液。(14)用5mL室温下的70％乙醇洗沉淀DNA，并于温度为4℃，转速不小于15000×g的条件下离心10min，小心倒出上清液，不要搅动底部沉淀。(15)空气中干燥DNA沉淀5-10min后用适量缓冲液(如TE Buffer，PH8.0或10mM Tris-Cl，PH8.5)或去离子水溶解DNA。(16)将提取的质粒DNA进行电泳分析。
2、高渗处理
将生长状态良好的杂交鹅掌楸胚性愈伤组织转移到含0.4M甘露醇的高渗培养基中间，进行高渗处理，4-6h后用于基因枪的轰击。
3、金粉的制备(以金粉浓度为60mg/mL为例)：(1)称取30mg直径为0.6μm的金粉，然后置于1.5mL灭菌的离心管中；(2)向称好的金粉中加入1mL 70％乙醇，用涡旋仪充分涡旋5min，然后在室温下静置15min；(3)在25℃，12000rpm的条件下离心3s,弃上清；(4)重复此步骤2次；(5)待乙醇挥发殆尽后，用灭过菌的去离子水冲洗2-3次；(6)加入500μL的50％甘油重悬金粉微粒；(7)4℃储存备用。
4、微弹的制备(6枪用量)：(1)将制备好的金粉悬浊液放在冰上，待其融化后充分涡旋5min，然后取50μL到新的离心管中备用；(2)取5-10μL质粒溶液(浓度为1ug/μL)，然后小心加到金粉悬液的管壁上，此时务必要注意保持离心管水平，以免DNA溶液滑入到金粉悬液中；(3)取50μL 20M CaCl2溶液和20μL 0.1M亚精胺溶液(现配现用)加到离心管盖子上吹打混匀；(4)小心盖上管盖，并迅速竖直涡旋1-10min，使溶液充分混匀；(5)室温静置1min后于25℃，12000rpm的条件下离心3-5s；(6)移除上清，并用150μL无水乙醇洗涤金粉沉淀；(7)用枪头刮下管壁上的金粉且尽量将结团的金粉打散，涡旋5-10min后于25℃，12000rpm的条件下离心3-5s并移除上清；(8)加入85μL无水乙醇，保证金粉沉淀完全重悬，最后置于冰上备用。
5、轰击转化：本实施例采用Bio-Rad公司生产的PDS-1000/He型基因枪对高渗处理后的杂交鹅掌楸愈伤组织进行基因枪介导的遗传转化研究，具体轰击过程为：(1)在超净工作台中，用70％的乙醇将基因枪表面和真空室消毒擦净，并将阻挡网、可裂膜和微弹载体等浸泡在无水乙醇中消毒10min，然后置于灭菌滤纸上，在超净台中吹干；(2)将可裂膜安装到托座上，然后将托座顺时针拧到气体加速器上，并用扳手拧紧；(3)取12.5μL包被质粒DNA的金粉悬液，均匀涂布于载体膜中心，然后置于超净工作台上吹干；(4)将载有微弹的载体膜嵌入到固定环中，使有颗粒的一面朝下，将阻挡网装入阻挡网托座上，并将托座和固定环安装好，然后将盖子旋紧后插入轰击室中的第一层；(5)将培养基放在托盘上，使待轰击的胚性愈伤组织集中于培养皿中央，轰击距离可设为6cm、9cm或12cm，关好仓门；(6)打开气瓶阀门，观察副表压力是否大于破裂膜破裂压力，如果小于则顺时针旋转氦气调节阀，保证氦气表指针的压力读数高于破裂膜压力200psi；(7)打开稳压电源和基因枪电源等开关；(8)打开真空泵开关，再打开VAC档进行抽真空；(9)待真空度达到26～28mmHg时，迅速把开关拨到Hold档，锁定真空；(10)待FIRE键亮起后，立即按住Fire键保持不动；(11)此时主机表头的压力开始缓缓上升，等达到破裂膜压力时会听见“啪”的一声，立即松开Fire键，转化完成；(12)按以下步骤取样：把真空开关拨到VENT档，释放真空，待真空度显示为0时，关闭主机电源、变压器、气瓶阀门，再打开仓门，取出样品，并清洁真空仓内的转化材料；(13)关机：将氦气瓶的总开关先旋紧，再逆时针旋松氦压表调节阀，打一次空枪，待氦气表指针回零后关闭基因枪的电源总开关。
本实施例采用直径为0.6μm的金粉作为微弹载体，选择1100psi的破裂膜，质粒的浓度为1μg/μL，以未包裹质粒DNA的金粉轰击相同的受体材料为阳性对照，以未经基因枪轰击的受体材料为阴性对照，并且对每种不同处理的轰击参数做3次重复实验。轰击后于23℃的培养箱中暗培养18h后对表达情况进行显微检测。
1)金粉用量设为250μg/枪、500μg/枪、750μg/枪、1000μg/枪四个浓度梯度，真空度选择28英寸汞柱，质粒用量选择10μL，轰击距离选择9cm，轰击次数选择轰击1次，对经高渗处理后的杂交鹅掌楸胚性愈伤组织进行基因枪轰击。通过荧光显微镜对绿色荧光蛋白表达情况的检测发现金粉用量与绿色荧光蛋白的瞬时表达之间有直接的关联作用。由表1可以看出：随着每枪金粉用量的不断增加，杂交鹅掌楸胚性愈伤组织的瞬时表达效率会不断提高，当金粉用量达到750μg/枪时GFP的瞬时表达率达到76.5％的最高值。但当金粉用量达到1000μg/枪时，GFP的瞬时表达率就直接下降到了53.3％。通过设定四个梯度的金粉用量，结合最终胚性愈伤组织绿色荧光蛋白的表达情况，分析得出用于基因枪介导的杂交鹅掌楸胚性愈伤组织遗传转化的最适金粉用量为每枪750μg。
表1金粉用量对GFP基因瞬时表达的影响
金粉用量(ug/枪) GFP瞬时表达效率(％)
250 55.3
500 62.7
750 76.5
1000 53.3
2)在金粉用量设为750μg/枪、质粒用量设为1.5μg/枪、轰击距离设为9cm、轰击次数设为1次的前提下，以20inch Hg、25inch Hg、28inch Hg三个真空度梯度，用基因枪对经高渗处理后的杂交鹅掌楸胚性愈伤组织进行轰击。结果表明经三个不同的真空度转化后的胚性愈伤组织的绿色荧光蛋白瞬时表达效率存在线性关系。由表2可以发现，随着真空度的不断增加，胚性愈伤组织GFP的瞬时表达效率也随之不断提高。当真空度为20inch Hg时，能检测到绿色荧光的亮点数很少，GFP的瞬时表达效率很低，仅为29.1％，但当真空度增加到25inch Hg时，GFP的瞬时表达效率也随之有所提高，当真空度达到28inch Hg时，胚性愈伤组织GFP的瞬时表达效率直线提高到76.3％，达到最高转化效率。可见用于基因枪介导的杂交鹅掌楸胚性愈伤组织遗传转化的最适真空度为28inch Hg。
表2真空度对GFP基因瞬时表达的影响
真空度(英寸汞柱) GFP瞬时表达效率(％)
20 29.1
25 52.5
28 76.3
3)在金粉用量设为750μg/枪、真空度设为28inch Hg、轰击距离设为9cm、轰击次数设为1次的前提下，将质粒用量设为0.5μg/枪、1.0μg/枪、1.5μg/枪、2.0μg/枪四个梯度，用基因枪对经高渗处理后的杂交鹅掌楸胚性愈伤组织进行轰击。结果表明用不同用量的质粒DNA对胚性愈伤组织进行轰击，经显微观察其绿色荧光蛋白的瞬时表达有明显区别。由表3可以发现，当质粒用量每枪在0.5μg到1.5μg之间时，GFP的瞬时表达效率会随着质粒DNA用量的不断增加而直线提高，但当质粒用量继续增加到2.0μg/枪时，GFP的瞬时表达效率下降到43.8％，由此说明质粒DNA用量过多反而会降低GFP的瞬时表达量。可见用于基因枪介导的杂交鹅掌楸胚性愈伤组织遗传转化的最适质粒用量是1.5μg/枪。
表3质粒DNA用量对GFP基因瞬时表达的影响
质粒用量(ug/枪) GFP瞬时表达效率(％)
0.5 45.3
1.0 65.2
1.5 78.4
2.0 43.8
4)在保证金粉用量为750μg/枪、真空度为28inch Hg、质粒用量为1.5μg/枪、轰击次数设为1次不变的前提下，将轰击距离设为6cm、9cm、12cm三个梯度，进行基因枪对杂交鹅掌楸胚性愈伤组织的轰击。由表4可以发现，轰击距离为9cm时胚性愈伤组织GFP的瞬时表达效率最高，达到75.3％，同时6cm的轰击距离获得的GFP瞬时表达效率要明显高于12cm的轰击距离获得的瞬时表达效率。可见用于基因枪介导的杂交鹅掌楸胚性愈伤组织遗传转化的最适轰击距离为9cm。
表4轰击距离对GFP基因瞬时表达的影响
轰击距离(cm) GFP瞬时表达效率(％)
6 63.1
9 75.3
12 43.5
5)以上述确定的金粉用量、真空度、质粒用量、轰击距离这四个最优参数，以此为依据，选择轰击1次、2次、3次作为梯度实验，并在轰击2次和3次时，轰击距离选择以6cm和9cm的组合为主进行基因枪介导的杂交鹅掌楸胚性愈伤组织的遗传转化。由表5可知，以6cm和9cm组合的轰击距离和两次都是9cm的轰击距离轰击两次比以9cm的轰击距离轰击一次略微好些，并且前者之间的GFP的瞬时表达效率差距很小，而轰击距离都是6cm时轰击两次的GFP瞬时表达效率较前者要低些，但和以6cm的轰击距离轰击一次的表达率相比相差不大。随后以6cm和9cm组合的轰击距离对胚性愈伤组织进行三次轰击，结果发现，其GFP的瞬时表达效率大大降低。由此可得出，轰击三次的方案不可行，而轰击两次的GFP表达率和轰击一次相比，只是略微高些，差距不是很大。因此，在考虑最佳性价比时，一般选择轰击一次作为最适轰击次数。
表5不同轰击次数、轰击距离组合对GFP基因瞬时表达的影响
可见，基因枪介导的杂交鹅掌楸胚性愈伤组织遗传转化的最佳轰击参数如下：金粉用量为750μg/枪、真空度为28inch Hg、质粒用量为1.5μg/枪、轰击距离为9cm、轰击次数为1次，以下实施例均采用该参数进行实施。
6)显微观察：利用Carl Zeiss荧光显微镜进行观察，借助ZEN显微图像分析软件观察绿色荧光蛋白的表达情况如图1所示。
实施例2基因枪介导的GUS基因转化杂交鹅掌楸体系的构建
本实施例以杂交鹅掌楸胚性愈伤组织作为基因枪转化的受体材料。质粒载体为pBI121-GUS，采用QIAGEN Plasmid Midi and Maxi Kits试剂盒提取纯化质粒，提取过程同实施例1。所使用的主要培养基如下：
胚性愈伤组织继代及恢复培养基：3/4MS+6-BA 0.25mg/L+2,4-D 2.0mg/L+VC5mg/L+LH 0.5g/L+蔗糖30g/L+水晶洋菜2.4g/L。
胚性愈伤组织高渗培养基：3/4MS+6-BA 0.25mg/L+2,4-D 2.0mg/L+VC 5mg/L+LH0.5g/L+蔗糖30g/L+水晶洋菜2.4g/L+甘露醇0.4M。
悬浮细胞系培养基：3/4MS+6-BA 0.25mg/L+2,4-D 2.0mg/L+VC 5mg/L+LH0.5g/L+蔗糖30g/L。
悬浮细胞体胚诱导培养基：3/4MS+ABA2.0mg/L+VC 5mg/L+CH0.2g/L+活性碳2g/L+蔗糖40g/L+水晶洋菜2.4g/L。
体胚再生植株生长培养基：3/4MS+VC 5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.8g/L。
体胚再生植株筛选培养基：3/4MS+VC 5mg/L+蔗糖30g/L+kan 50mg/L+琼脂6.8g/L。以上培养基除LB外，其余培养基的pH均为5.7-5.8，且均需经高温高压灭菌。
胚性悬浮细胞系的建立：在超净工作台中选取5g左右生长状态良好的胚性愈伤组织贴在无菌的三角瓶内壁上，用无菌的镊子轻轻将愈伤组织分散开，然后用50mL的液体悬浮培养基将贴在内壁上的愈伤组织冲到瓶底，摇晃使细胞团均匀分散，封好口后将三角瓶置于水平转速为95r/min，23℃的摇床上培养一周。
体胚的诱导：将上述培养两周后的胚性悬浮细胞系用直径为150um和400um的无菌不锈钢网筛进行过筛，细胞团直径介于两者之间的单细胞具有较多的内含物，可以作为较好的转化材料。将这些单细胞转移到悬浮细胞体胚诱导培养基上，在23℃的条件下进行暗培养，待单细胞经15-20d的培养后会长出小小的体胚，也可以作为基因枪轰击的良好材料。
基因枪介导的GUS基因转化杂交鹅掌楸体系，方法同实施例1。其中：
1)高渗处理：在基因枪轰击前将生长状态良好的杂交鹅掌楸胚性愈伤组织转移到高渗培养基中间直径为3cm的范围之内，再将材料放到23℃的培养箱中进行暗培养，4-6h后用于基因枪轰击。
2)胚性悬浮细胞系的轰击转化：采用Bio-Rad公司生产的PDS-1000/He型基因枪对杂交鹅掌楸胚性悬浮细胞系进行基因枪介导的遗传转化研究，具体轰击过程位：(1)在超净工作台中，用70％的乙醇将基因枪表面和真空室消毒擦净，并将阻挡网、可裂膜和微弹载体等浸泡在无水乙醇中消毒10min，然后置于灭菌滤纸上，在超净台中吹干；(2)将可裂膜安装到托座上，然后将托座顺时针拧到气体加速器上，并用扳手拧紧；(3)取12.5μL包被GUS质粒的DNA金粉悬液，均匀涂布于载体膜中心，然后置于超净工作台上吹干；(4)将载有微弹的载体膜嵌入到固定环中，使有颗粒的一面朝下，将阻挡网装入阻挡网托座上，并将托座和固定环安装好，然后将盖子旋紧后插入轰击室中的第一层；(5)将培养基放在托盘上，选择长势良好的并集中于培养皿直径3cm范围的杂交鹅掌楸胚性悬浮单细胞或活性强的幼胚作为轰击对象，轰击距离选择9cm，关好仓门，准备轰击；(6)打开气瓶阀门，观察副表压力是否大于破裂膜破裂压力，如果小于则顺时针旋转氦气调节阀，保证氦气表指针的压力读数高于破裂膜压力200psi；(7)打开稳压电源和基因枪电源等开关；(8)打开真空泵开关，再打开VAC档进行抽真空；(9)待真空度达到28inch Hg时，迅速把开关拨到Hold档，，锁定真空；(10)待FIRE键亮起后，立即按住Fire键保持不动；(11)此时主机表头的压力开始缓缓上升，等达到破裂膜压力时会听见“啪”的一声，立即松开Fire键，转化完成；(12)按以下步骤取样：把真空开关拨到VENT档，释放真空，待真空度显示为0时，关闭主机电源，变压器，气瓶阀门，再打开仓门，取出样品，并清洁真空仓内的转化材料；(13)关机：将氦气瓶的总开关先旋紧，再逆时针旋松氦压表调节阀，打一次空枪，待氦气表指针回零后关闭基因枪的电源总开关。
3)胚性愈伤组织的恢复培养：把基因枪轰击后的胚性愈伤组织放回23℃的培养箱中在原高渗培养基上继续进行16-18h的高渗培养，然后在高渗处理后的2h内，将胚性愈伤组织及时转移到愈伤组织恢复培养基上进行为期14d的暗恢复培养。
4)胚性悬浮细胞系的恢复培养：将基因枪轰击后的杂交鹅掌楸胚性悬浮单细胞和幼胚放回23℃的培养箱中继续暗培养，待长出体胚后挪到光照培养间进行光照培养。
5)体胚诱导：将恢复培养后的胚性愈伤组织建立悬浮细胞系，培养1～2周后进行体胚的诱导，等长出体胚后再进行光照培养。
6)筛选培养：经光照培养后的体胚经过一段时间会长出小苗，将这些小苗接种到体胚再生植株生长培养基中继续光照培养，待小苗长到2～3cm后转移到加有50mg/L卡那霉素(kan)的筛选培养基上进行筛选培养。
轰击后的愈伤经恢复培养和诱导培养后长出生长状态良好的体胚，再将体胚转移到光照条件下培养，体胚逐渐长成体胚苗，如图2所示。
将培养长出的体胚苗转移到生根培养基中，待长出幼苗后再经kan抗性筛选获得转GUS基因阳性植株，如图3所示。
7)GUS基因的检测
GUS组织化学染色检测：将转化后的愈伤组织浸泡在X-Gluc染液中，于37℃条件下温育一段时间，待组织染色后，用75％的乙醇使组织脱色，再用显微镜观察。其中，GUS染液：100mM磷酸盐缓冲液(pH7.2)，5mM铁氰化钾，5mM亚铁氰化钾，1mM EDTA，1％Triton-100，1mg/mL X-gluc。洗液：100mM磷酸盐缓冲液(pH7.2)，1mM EDTA。转GUS基因杂交鹅掌楸体胚和幼苗的染色结果如图4所示，染色结果表明GUS基因已经成功转化到杂交鹅掌楸体胚和幼苗中。
转GUS基因再生植株的分子检测：采用CTAB法提取转基因杂交鹅掌楸基因组DNA，对基因组DNA进行PCR检测。
经过卡那霉素(kan)抗性筛选后获得了166株转GUS基因的再生植株，再从中随机选取33棵幼苗进行分子检测，从检测结果(图5)看出，GUS基因已经整合到杂交鹅掌楸基因组中，并且阳性率为69.7％。
实施例3基因枪介导的LhWox1基因转化杂交鹅掌楸体系的构建
实施例1、实施例2的结果表明，利用基因枪介导的遗传转化技术，可成功地将GFP基因和GUS基因转化到杂交鹅掌楸体系中，不仅获得了此转化体系的最佳轰击参数，而且通过抗性筛选获得了转GUS基因的再生植株。
本实施例的LhWox1基因转化杂交鹅掌楸体系的构建方法同实施例2，其中，本实施例所用质粒为LhWOX1，成功获得LhWox1基因转化杂交鹅掌楸体系，具体结果如下：
轰击后的愈伤经恢复培养和诱导培养后长出生长状态良好的体胚，再将体胚转移到光照条件下培养，体胚逐渐长成体胚苗，将培养长出的体胚苗转移到生根培养基中，待长出幼苗后再经kan抗性筛选获得转LhWOX1基因阳性植株。经抗性筛选后，有135个幼胚培养成了再生植株，初步说明这135株再生植株成功导入了LhWOX1基因，再从中随机抽取35棵幼苗进行分子检测，从分子检测的图谱(图6)可以看出，LhWOX1基因已经成功整合进入杂交鹅掌楸的基因组中，并且转基因植株的阳性率为65.7％。
结果表明，本申请建立起来的体系，基因枪介导法不仅可以将LhWOX1基因成功导入到杂交鹅掌楸的基因组中，而且转化后的胚性愈伤和单细胞可以再生植株，为以后的表型观察提供可靠的实验材料。
实施例4基因枪介导的GUS基因转化杂交鹅掌楸体系的构建
基因枪介导的GUS基因转化杂交鹅掌楸体系的构建方法同实施例2，其中，
本实施例以杂交鹅掌楸的胚性悬浮细胞系作为基因枪转化的受体材料。所使用的主要培养基如下：
悬浮细胞系培养基：3/4MS+6-BA 0.25mg/L+2,4-D 2.0mg/L+VC 5mg/L+LH0.5g/L+蔗糖30g/L。
悬浮细胞体胚诱导培养基：3/4MS+ABA2.0mg/L+VC 5mg/L+CH0.2g/L+活性碳2g/L+蔗糖40g/L+水晶洋菜2.4g/L。
胚性悬浮细胞系的建立：在超净工作台中选取5g左右生长状态良好的胚性愈伤组织贴在无菌的三角瓶内壁上，用无菌的镊子轻轻将愈伤组织分散开，然后用50mL的液体悬浮培养基将贴在内壁上的愈伤组织冲到瓶底，摇晃使细胞团均匀分散，封好口后将三角瓶置于水平转速为95r/min，23℃的摇床上培养一周。
体胚的诱导：将上述培养两周后的胚性悬浮细胞系用直径为150μm和400μm的无菌不锈钢网筛进行过筛，细胞团直径介于两者之间的单细胞具有较多的内含物，可以作为较好的转化材料。将这些单细胞转移到悬浮细胞体胚诱导培养基上，在23℃的条件下进行暗培养，待单细胞经15-20d的培养后会长出小小的体胚，也可以作为基因枪轰击的良好材料。
胚性悬浮细胞系的轰击转化：采用Bio-Rad公司生产的PDS-1000/He型基因枪对杂交鹅掌楸胚性悬浮细胞系进行基因枪介导的遗传转化研究，具体轰击过程位：(1)在超净工作台中，用70％的乙醇将基因枪表面和真空室消毒擦净，并将阻挡网、可裂膜和微弹载体等浸泡在无水乙醇中消毒10min，然后置于灭菌滤纸上，在超净台中吹干；(2)将可裂膜安装到托座上，然后将托座顺时针拧到气体加速器上，并用扳手拧紧；(3)取12.5μL包被GUS质粒的DNA金粉悬液，均匀涂布于载体膜中心，然后置于超净工作台上吹干；(4)将载有微弹的载体膜嵌入到固定环中，使有颗粒的一面朝下，将阻挡网装入阻挡网托座上，并将托座和固定环安装好，然后将盖子旋紧后插入轰击室中的第一层；(5)将培养基放在托盘上，选择长势良好的并集中于培养皿直径3cm范围的杂交鹅掌楸胚性悬浮单细胞或活性强的幼胚作为轰击对象，轰击距离选择9cm，关好仓门，准备轰击；(6)打开气瓶阀门，观察副表压力是否大于破裂膜破裂压力，如果小于则顺时针旋转氦气调节阀，保证氦气表指针的压力读数高于破裂膜压力200psi；(7)打开稳压电源和基因枪电源等开关；(8)打开真空泵开关，再打开VAC档进行抽真空；(9)待真空度达到28inch Hg时，迅速把开关拨到Hold档，，锁定真空；(10)待FIRE键亮起后，立即按住Fire键保持不动；(11)此时主机表头的压力开始缓缓上升，等达到破裂膜压力时会听见“啪”的一声，立即松开Fire键，转化完成；(12)按以下步骤取样：把真空开关拨到VENT档，释放真空，待真空度显示为0时，关闭主机电源，变压器，气瓶阀门，再打开仓门，取出样品，并清洁真空仓内的转化材料；(13)关机：将氦气瓶的总开关先旋紧，再逆时针旋松氦压表调节阀，打一次空枪，待氦气表指针回零后关闭基因枪的电源总开关。
结果显示，相对于胚性愈伤组织的转化，基因枪介导的液体悬浮细胞的转化效果并不理想，由液体悬浮系建立起来的单细胞和幼胚比愈伤组织更脆弱，轰击受到的伤害程度更为严重，以致难以恢复和再生。

Claims (10)

1.一种基因枪介导的杂交鹅掌楸转化体系的构建方法，其特征在于，步骤如下：
1）取杂交鹅掌楸胚性愈伤组织，进行高渗处理；
2）提取质粒，制备金粉，制备微弹；
3）基因枪轰击；
4）将愈伤组织转移至恢复平日养鸡进行暗恢复培养；
5）体胚诱导培养，长出体胚后进行光照培养，长出小苗后接种于生根培养基进行筛选培养；
6）分子检测，获得杂交鹅掌楸转化体系。
2.根据权利要求1所述的基因枪介导的杂交鹅掌楸转化体系的构建方法，其特征在于，步骤1）中，将生长状态良好的杂交鹅掌楸胚性愈伤组织转移到含0.4M甘露醇的高渗培养基中，进行高渗处理，4-6h后用于基因枪的轰击。
3.根据权利要求1所述的基因枪介导的杂交鹅掌楸转化体系的构建方法，其特征在于，步骤2）中，质粒载体为pJIT166-GFP。
4.根据权利要求1所述的基因枪介导的杂交鹅掌楸转化体系的构建方法，其特征在于，步骤3）中，轰击时，金粉用量250-1000μg/枪。
5.根据权利要求1所述的基因枪介导的杂交鹅掌楸转化体系的构建方法，其特征在于，步骤3）中，轰击时，真空度20-28inch Hg。
6.根据权利要求1所述的基因枪介导的杂交鹅掌楸转化体系的构建方法，其特征在于，步骤3）中，轰击时，质粒用量1.0-1.5μg/枪。
7.根据权利要求1所述的基因枪介导的杂交鹅掌楸转化体系的构建方法，其特征在于，步骤3）中，轰击时，轰击距离6-9cm。
8.根据权利要求1所述的基因枪介导的杂交鹅掌楸转化体系的构建方法，其特征在于，步骤3）中，轰击时，轰击次数1-2次。
9.根据权利要求1所述的基因枪介导的杂交鹅掌楸转化体系的构建方法，其特征在于，步骤3）中，轰击时，金粉用量750μg/枪、真空度28inch Hg、质粒用量1.5μg/枪、轰击距离9cm、轰击次数1次。
10.权利要求1所述的基因枪介导的杂交鹅掌楸转化体系的构建方法所获得的杂交鹅掌楸转化体系在LhWOX1基因转化杂交鹅掌楸胚性愈伤组织中的应用。
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