CN109880847A - 一种高效的高山离子芥转基因植株的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效的高山离子芥转基因植株的制备方法，所述的制备方法主要包括以下步骤：(1)载体构建和农杆菌转化，(2)农杆菌介导的压力侵染，(3)愈伤组织与农杆菌共培养及筛选，(4)GUS染色鉴定及后期培养。与普通转化方法相比，在转化过程中施加外源压力能够显著提高农杆菌介导的转基因的效率。该方法具有操作简便、转化效率高、稳定性好以及重复性强等特点。

Description

一种高效的高山离子芥转基因植株的制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效的高山离子芥转基因植株的制备方法。

背景技术

高山离子芥(Chorispora bungeana)是一种十字花科的高山冰缘植物，主要生长在海拔3600～3900m的乌鲁木齐河源区流石碓地区，该地区昼夜温差极大，并且年平均温度在-5～-7℃之间，6～8月平均气温仅为3.6℃，是一种伴随反复冻融现象的冰冻环境，因此高山离子芥是一种研究植物抗冻机制的特色冰缘植物，但是由于高山离子芥的转化体系尚不成熟，传统转化方法效率低且不稳定，这严重限制了对其抗逆基因的挖掘和功能的研究，也影响着抗逆基因在农牧业上的应用。对于其转基因方法的改进，可为研究包括高山离子芥在内的高山冰缘植物提供新的技术支持，具有良好的应用前景。

随着植物基因工程的迅速发展，转化方法也在不断的完善，为后期广泛深入的研究提供了实验基础。目前将外源基因导入受体细胞的方法主要包括农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法、组织电击法、PEG法等。其中以农杆菌介导的遗传转化方法应用最为广泛。农杆菌中含有Ti质粒，Ti质粒的T-DNA区能够向植物中转移并且整合到植物的基因组中。常用的几种植物实验材料包括烟草、拟南芥等都是通过将植物组织材料浸入农杆菌重悬液这种方法进行转化；花生、高粱等物种利用超声波法辅助农杆菌介导的转基因；非洲菊、棉花等物种通过真空渗透法提高农杆菌介导的转化效率。对于高山离子芥也有相关的探索实验，但是转化效率低且不稳定，并且没有相关实验证明转化后的基因能够在植株中稳定表达。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种高效的高山离子芥转基因植株的制备方法。

所述的高山离子芥转基因植株的制备方法是在常用的农杆菌侵染的基础上，调整农杆菌和乙酰丁香酮的浓度，并创造性的通过施加外源压力，得到了高效稳定且简便省时的高山离子芥转化方法。

本发明提供了一种高效的高山离子芥转基因植株的制备方法，通过以下技术方案实现：

(1)载体构建

首先克隆GUS基因，通过gateway的方法构建到目的载体PMDC32上，形成PMDC32-GUS融合表达载体，如图1所示。

(2)农杆菌转化

将构建好的PMDC32-GUS载体电击转化农杆菌GV3101。将转化成功的农杆菌接菌于YEP培养基上，230rpm摇菌16-20h，至OD值＝1.4左右，2500rpm离心8min，去上清得农杆菌菌体。加入适量的MS液体重悬液分别稀释农杆菌浓度至OD值＝0.4、0.6和0.8，并且在不同OD值的重悬液中分别加入0μM、50μM、100μM和150μM乙酰丁香酮备用。

优选地，YEP培养基含有50mg/L卡那霉素，20mg/L利福平和30mg/L庆大霉素；

优选地，所述用于步骤(3)侵染的转化后的农杆菌浓度范围为OD＝0.8(6.4×10⁸cells/ml)；

优选地，所述转化后的农杆菌加入乙酰丁香酮浓度为0-150μM。

优选地，所述转化后的农杆菌加入乙酰丁香酮浓度为50μM。

(3)农杆菌介导的压力侵染

将高山离子芥愈伤组织用无菌镊子分成小颗粒(直径3-5mm)，放入20ml容积的无菌注射器中(注射器的半径为0.01m)，并用注射器吸入(2)中的菌悬液10ml，使愈伤组织全部浸入农杆菌重悬液中4min，堵住注射器的头部端口，持续施压3min，压强为2.55×10⁵～2.64×10⁵Pa；松开头部的端口继续侵染3min，压力侵染结束。

优选地，所述外源施加压力为2.60×10⁵Pa。

(4)愈伤组织与农杆菌共培养

取出侵染后的材料，用无菌滤纸吸干。分别放置MS培养基(共培养培养基)上，黑暗条件下培养。

优选地，共培养培养基含有0.1mg/L 6-BA，0.5mg/L 2,4-D，0.5mg/L NAA外源激素。

(5)筛选

两天后将实验材料从共培养培养基上移到筛选培养基上继续生长，两周更换一次培养基，直至愈伤组织长出。

优选地，筛选培养基的配方为1mg/L的2,4-D，0.2mg/L 6-BA，0.2mg/L NAA，25mg/L潮霉素和250mg/L羧苄青霉素。

(6)GUS染色鉴定

选取在筛选培养基上正常生长的愈伤组织，通过GUS染色技术来进行鉴定，通过染色的结果来对转化效率进行判断和统计。

(7)后期培养

后期将转化成功的愈伤组织转移到诱导培养基上，诱导不定芽生成。

优选地，诱导培养基为含有0.5mg/L 6-BA的固体培养基。

本发明的有益效果是：

1.转化效率高。与常规转化技术相比，采用本发明的压力转化技术方案，在相同农杆菌浓度和乙酰丁香酮浓度的条件下，具有较高的转化效率；并通过后期诱导的不定芽和植株GUS染色表明，表达载体能够在完整植株中稳定表达。

2.转化操作流程简单。本发明技术方案直接选取愈伤诱导培养基上正常生长的淡黄色愈伤组织为实验材料，用灭菌后的镊子压碎即可进行侵染，不需要其他的处理；该转化方法不需要真空泵等仪器，只需无菌注射器即可施压；并且前期浸泡和施加压力的转化总时间只需要10min左右；相比于普通的转化方法，本发明提供的技术方案具有耗时少，操作简单的优点。

附图说明

图1构建的PMDC32-GUS表达载体示意图

图2农杆菌转化高山离子芥的过程

图3对转基因的高山离子芥不同组织部位进行GUS染色

图4施压转化和普通转化得转化效率统计结果

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。

实施例1

(1)载体构建

首先克隆GUS基因，通过gateway的方法构建到目的载体PMDC32上，形成PMDC32-GUS融合表达载体。

(2)农杆菌转化

将步骤(1)构建好的载体电击转化农杆菌，2天后挑取阳性克隆于230rpm，28℃摇床遮光培养约36h，培养基是含有50mg/L卡那霉素，20mg/L利福平和30mg/L庆大霉素的YEP培养基；吸取培养完毕的农杆菌菌液并按照1/500的比例接种于新的含有相应抗生素的YEP培养基中，230rpm，28℃遮光培养16-20h至OD值＝1.4；将菌液分装到50ml离心管中，2500rpm离心8min，倒掉上清得到农杆菌菌体；向离心管中加入MS液体重悬液，将菌体重悬后分别稀释至OD值＝0.4、0.6、0.8，并且在不同OD值的重悬液中分别加入0μM、50μM、100μM和150μM乙酰丁香酮备用。

(3)农杆菌介导的压力侵染

实验组：将高山离子芥愈伤组织用无菌镊子碾碎分成小颗粒(直径3-5mm)，放入20ml容积的无菌注射器中，用注射器中吸入10ml步骤(2)中的菌悬液，上下颠倒使愈伤组织全部浸入农杆菌重悬液中放置4min；拔掉注射器针头，堵住注射器的头部，持续施加2.60×10⁵Pa的压强3min；松开头部的端口，继续侵染3min。将针管倒置，挤出农杆菌重悬液，拔掉注射器塞子，将愈伤组织全部取出。

对照组不需要施加压力，只需要将愈伤颗粒浸入农杆菌重悬液中10min即可。

(4)愈伤组织与农杆菌共培养及筛选

将侵染后的愈伤组织全部取出后放到无菌滤纸吸干，之后用无菌镊子小心的将其分别放置在含有0.1mg/L 6-BA，0.5mg/L 2,4-D，0.5mg/L NAA外源激素的MS固体培养基(共培养培养基)上，遮光培养两天。然后用无菌镊子将实验材料从共培养培养基上移到筛选培养基上继续生长,筛选培养基的配方为加入1mg/L的2,4-D，0.2mg/L 6-BA，0.2mg/L NAA，25mg/L潮霉素和250mg/L羧苄青霉素的MS固体培养基。后期每2周更换一次新的筛选培养基，直至转化成功的愈伤组织能够正常生长。

(5)GUS染色鉴定及后期培养

随机选取在筛选培养基上能够正常生长的愈伤组织，通过GUS染色技术来进行鉴定，具体操作为：按照说明书配置GUS染液，将愈伤组织浸入染液中，37℃遮光放置3-4h，即可观察到已经染成蓝色的愈伤组织。通过染色的结果来对转化效率进行判断和统计。后期将转化成功的愈伤组织转移到含有0.5mg/L 6-BA的MS固体培养基上，每2周更换一次新的培养基，诱导不定芽的生成。然后对叶片和完整植株等部位进行GUS染色。

(6)结果

农杆菌侵染之后的表达载体能够在植株生长后期稳定表达，结果见图3。在相同农杆菌浓度和乙酰丁香酮含量的情况下，施加压力的转化率显著高于对照组，并且施压为2.60×10⁵Pa，农杆菌浓度为6.4×10⁸cells/ml(OD＝0.8)，乙酰丁香酮浓度为50μM时，转基因高山离子芥植株的转化效率最高，结果见图4。综上所述，本发明所公开的转基因高山离子芥转化方法，创造性的在现有转化方法的基础上，施加外源压力，显著的提高了转基因高山离子芥的转化效率。为后期研究包括高山离子芥在内的高山冰缘植物提供了新的思路，具有良好的应用前景。

Claims (9)

1.一种高效的高山离子芥转基因植株的制备方法，其特征在于，所述的转基因植株的制备方法包括以下步骤：

(1)载体构建；

(2)农杆菌转化；

(3)农杆菌介导压力侵染，所述的浸染是在施加外源压力条件下进行的；

(4)愈伤组织与农杆菌共培养及筛选；

(5)β-D-葡萄糖苷酸酶基因染色鉴定及后期培养。

2.如权利要求1所述的高山离子芥转基因植株的制备方法，其特征在于：所述的步骤(3)的侵染环境的压力范围是2.55×10⁵～2.64×10⁵Pa。

3.如权利要求2所述的高山离子芥转基因植株的制备方法，其特征在于，所述的步骤(3)中的侵染环境的压力为2.60×10⁵Pa。

4.如权利要求1所述的高山离子芥转基因植株的制备方法，其特征在于，所述的步骤(3)的压力侵染是通过注射器完成的，操作步骤如下：将高山离子芥愈伤组织用无菌镊子碾碎，放入注射器中，用注射器中吸入10ml步骤(2)中的菌悬液，上下颠倒使愈伤组织全部浸入农杆菌重悬液中放置4min；拔掉注射器针头，堵住注射器的头部端口，持续施压3min；松开注射器头部的端口，继续侵染3min，压力侵染结束。

5.如权利要求1所述的高山离子芥转基因植株的制备方法，其特征在于，步骤(2)中将转化完成的农杆菌加入MS液体重悬液进行稀释，并在稀释液中加入乙酰丁香酮备用。

6.如权利要求5所述的高山离子芥转基因植株的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中加入乙酰丁香酮浓度为0-150μM。

7.如权利要求6所述的高山离子芥转基因植株的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中加入乙酰丁香酮浓度为50μM。

8.如权利要求6或7所述的高山离子芥转基因植株的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中农杆菌稀释液的浓度范围为OD＝0.4-0.8。

9.如权利要求8所述的高山离子芥转基因植株的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中农杆菌稀释液的浓度为6.4×10⁸cells/ml(OD＝0.8)。