CN102229950B - 一种快速高效的籼稻转基因方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速高效的籼稻转基因方法，该方法包括以诱导愈伤组织5-10天后的籼稻成熟种子用于农杆菌浸染，共培养后经过10-20天抗性愈伤组织的筛选和10-20天的分化培养，以及5-10天的生根培养和二次抗性筛选等过程，在40-50天内即可获得籼稻转化植株，转化效率达20-30％。转化过程中的培养条件除了共培养阶段为25℃暗培养外，其余均为30-33℃高温和光照强度为80-120μmole m^-2 s^-1的持续光照条件。本发明方法极大地缩短了愈伤组织的离体培养时间，获得了较高的分化效率，同时也降低了体细胞的突变频率，简化了操作程序，节约了大量人力和物力。

Description

一种快速高效的籼稻转基因方法

技术领域

本发明涉及一种转基因方法，具体而言，涉及一种快速高效的籼稻转基因方法，特指以诱导愈伤组织5-10天的籼稻成熟种子用于农杆菌浸染，并结合后期的快速筛选和分化的籼稻转基因方法，属于生物技术领域。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是世界主要的粮食作物之一，世界上有将近二分之一的人口是以稻米为主食。尤其是籼稻，其产量占据了世界水稻产量的80％，对全球农业经济具有举足轻重的地位。然而在水稻的生产过程中由于各种病虫害、不良气候与环境的影响，严重制约了水稻的高产、稳产。随着转基因技术的兴起，转基因水稻的研究也成为了各国转基因技术研究的热点。

转基因技术是指将外源基因通过生物、物理或化学手段导入其它生物基因组，以获得外源基因稳定遗传和表达的遗传改良体。应用转基因技术将目的基因导入合适的受体获得稳定的转基因植株是转基因的重要环节。在水稻转基因研究上，已开拓建立了多种转基因技术，其中包括以原生质体为受体的聚乙二醇(PEG)转化法、电激法、脂质体转化法，以愈伤组织为受体的基因枪介导转化法和农杆菌介导转化法，以及花粉管通道和种子胚穿刺等in planta转化方法。这些方法适用于不同的受体品种，均取得了一定成效，成功培育了许多高产高抗逆性的转基因水稻。然而这些技术在受体选择、组织培养、转化效率和成本投入等方面还存在各种不同的缺陷，为实验操作带来了诸多不便。

农杆菌介导的转化法利用天然的转化载体系统，遗传稳定性好，且载体可容纳大片段的异源DNA，成为了目前最常用的水稻转基因方法。该方法就是将外源基因插入农杆菌的质粒上，通过愈伤组织与农杆菌的共培养由载体将外源基因转移并整合到水稻细胞基因组中。基本程序包括转化载体的构建、受体愈伤组织的建立、目的基因的转化、抗性愈伤组织的筛选和分化等过程。在传统方法中，即使是较易转化的粳稻也需要3个月，转化效率为30％左右。如果是较难分化的籼稻，其转化时间更长，转化效率更低，甚至有些籼稻品种无法转化成功。究其原因主要是受体愈伤组织建立过程太长，时间近1个月左右，加之后期冗长的筛选和分化过程，使愈伤组织部分丧失了分化活性。更为严重的是，由于长时间的愈伤组织离体培养导致体细胞突变频率显著增加，给后续的转化株系表型鉴定及生化分析带来了不可预知的困难。针对上述问题，通过优化转化流程和参数获得本发明。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种转化时间短、转化效率高、体细胞的突变频率低、操作程序简单的快速高效的水稻转基因方法。

本发明提供的技术方案是：一种水稻转基因的方法，包括如下步骤：

(1)愈伤组织的诱导

将水稻种子接种于诱导培养基中，培养条件为30-33℃，持续光照，培养至种子胚的盾片处诱导出愈伤组织；

(2)载体的选择和农杆菌的准备

将含有目的基因的表达载体转入农杆菌，选取阳性菌株，再将阳性菌株进行培养，然后将培养后的农杆菌震荡悬浮于含有浸染培养基的离心管中，作为愈伤组织的农杆菌浸染液；其中，所述表达载体还含有抗性基因，或者含有抗性基因和红色荧光蛋白基因；

(3)愈伤组织和农杆菌的共培养

将第(1)步诱导出愈伤组织的种子，浸泡于第(2)步得到的农杆菌浸染液，然后将浸染后的种子吸干，置于共培养基上于22-28℃黑暗培养2-5天；

(4)农杆菌的洗脱：洗涤共培养后的种子；

(5)抗性愈伤组织的筛选

首先进行愈伤组织的抗性筛选，将洗脱后的种子置于含有相应筛选剂的筛选培养基上，于30-33℃和持续光照条件下筛选培养10-20天，每7-10天继代一次；若第(2)中的表达载体含有红色荧光蛋白基因，则进一步进行愈伤组织的RFP筛选，将抗性筛选10-20天后的抗性愈伤组织置于绿光激发装置下，透过红色滤光膜筛选含RFP的愈伤组织用于后续的分化培养；

(6)抗性愈伤组织的分化

将筛选出的愈伤组织转移至不含抗生素的分化培养基上，于30-33℃和持续光照条件下进行分化培养10-20天，得到再生植株；

(7)再生植株的生根和二次抗性筛选

若第(5)步中只进行了愈伤组织的抗性筛选，则将再生植株移栽于含有筛选剂的生根培养基中，于30-33℃和持续光照条件下进行二次抗性筛选和生根培养5-10天，获得再生苗；若第(5)步中进行了愈伤组织的抗性筛选和RFP筛选，则将再生植株移栽于不含有筛选剂的生根培养基中，于30-33℃和持续光照条件下进行生根培养5-10天，获得再生苗；

(8)炼苗和移栽

将再生苗洗去培养基，然后移栽至培养土中，于30-33℃持续光照的培养室中炼苗3-5天。

所述的方法，其中，所述的持续光照强度为80-120μmole m^-2 s^-1。

所述的方法，第(2)步中，挑取划线培养的农杆菌震荡悬浮于AAM浸染培养基作为愈伤组织的浸染液，其菌液吸光度为OD₆₀₀＝0.05-0.15。

所述的方法，第(2)步中，所述表达载体含有抗性基因和红色荧光蛋白基因；第(5)中，进行愈伤组织的抗性筛选和RFP筛选；第(7)步中，将再生植株移栽于含有筛选剂的生根培养基中，于30-33℃和持续光照条件下进行生根培养5-10天。

所述的方法，所述抗性基因为潮霉素抗性基因或Basta抗性基因，所述红色荧光蛋白基因为AsRed。

所述的方法，第(1)步中，培养时间为5-10天。

上述的方法，所述水稻是籼稻或粳稻。

上述方法用到的培养基可以采用经典文献(Hiei Y，et al.Planta Journal，6：271-282，1994)中的培养基，但在本发明中采用的培养基成分适当进行了改进，具有更好的效果(参见实施例)。

本发明具有以下有益效果：

1.以诱导愈伤组织5-10天的籼稻种子代替传统方法中生长1个月左右并经过继代或预培养的愈伤组织作为遗传转化的受体材料，极大地缩短了转化时间，简化了操作程序，同时也有利于后期独立转化植株的分离和鉴定。

2.以划线培养的农杆菌代替传统方法中摇菌培养的农杆菌来进行转化，简化了操作程序，节约了实验成本。另外，本发明人发现在平板培养基上划线培养的农杆菌在4℃冰箱保存1周后仍可用于转化，其转化效率没有明显的下降趋势。该方法可以使实验人员自由选择转化时间。

3.采用愈伤组织的组合筛选模式，即阳性愈伤组织的筛选分为抗性筛选和红色荧光蛋白(RFP)的荧光筛选。通过RFP的筛选来降低较短时间(14天)的抗性筛选可能带来的高假阳性率。另外，在再生苗的生根培养过程中进行二次抗性筛选，完全杜绝了假阳性苗的逃逸现象。

4.除了共培养阶段外，愈伤组织的诱导、筛选、分化和生根(包括二次筛选)等过程均在30-33℃高温和持续光照(80-120μmole m^-2 s^-1)条件下进行，而传统转化法的培养条件一般为25℃，诱导和筛选过程为暗培养。该高温和持续光照培养条件也加快了转化进程。

5.转化周期短，转化效率高。从籼稻种子的接种到转化苗的获得仅需40-50天，转化效率可达20-30％。本方法所需时间较传统方法(3个月以上)缩短了一半以上，从而极大地缩短了愈伤组织的离体培养时间，获得了较高的分化效率，降低了体细胞的突变频率。

综上所述，本籼稻转化方法极大地缩短了愈伤组织的离体培养时间，获得了较高的分化效率，降低了体细胞的突变频率，同时也简化了操作程序，节约了大量人力和物力。

附图说明

图1 pCAMBIA1301-NcGDH表达载体T-DNA区段的图谱，其中，RB右边界；Tnos胭脂碱合酶基因(nos)终止子；HPT潮霉素抗性基因；35S花椰菜花叶病毒的35S启动子；FLAG FLAG标签基因；NcGDH粗糙脉孢杆菌(Neurospora crassa)的NADP(H)依赖型谷氨酸脱氢酶基因；TR烟草根部特异表达启动子(RB7启动子)；AsRed红色荧光蛋白基因；LB左边界。

图2转化程序，其中，A：从成熟胚中诱导7天的愈伤组织；B：潮霉素筛选14天后的愈伤组织(肉眼可见红色荧光)；C：愈伤组织的分化培养；D：生根培养中的二次潮霉素抗性筛选；R为抗性植株；S为敏感植株；E：再生苗的生根培养；F：炼苗。

图3 pCAMBIA1301-bZIP17-VP64表达载体及其籼稻转化，其中，A：pCAMBIA1301-bZIP17-VP64表达载体T-DNA区段的图谱；RB右边界；Tnos胭脂碱合酶基因(nos)终止子；bar Basta抗性基因；35S花椰菜花叶病毒的35S启动子；VP64-HA连接有HA标签的转录激活功能域基序VP64基因；bZIP17水稻转录因子基因bZIP17；Ubi玉米Ubiquitin启动子；AsRed红色荧光蛋白基因；LB左边界。B：Bialaphos筛选14天后的愈伤组织(无红色荧光)；C：生根培养中的Basta筛选，该转化株来自无红色荧光但具有Bialaphos抗性的愈伤组织。

图4转化植株的检测，其中，A：TR::NcGDH转化植株(T₀)的PCR检测，采用AsRed的特异性引物(正向引物：CACCATGGCCTCTTTGCTGAAG；反向引物：CCTCGTACTGCTTGTAGCACT)对基因组DNA进行扩增，可得到650bp的特异性扩增带，图中的TR::NcGDH转化株系从左至右分别为1，2，3，5，6号株系；B：未转化植株种子的红色荧光检测；C：TR::NcGDH-1转化植株(T₁)种子的红色荧光检测，所有种子在发芽2天后进行红色荧光检测，主要观察胚及由胚发育的根和芽中的红色荧光蛋白，深色箭头指示有红色荧光的种子，白色箭头指示无红色荧光的种子；D：TR::NcGDH-1转化植株(T₂)的潮霉素抗性筛选，图中的TR::NcGDH-1的所有幼苗都有抗性，为纯合子株系；E：TR::NcGDH转化植株(T₁)中NcGDH转录水平的半定量RT-PCR分析，RNA从幼苗中提取，肌动蛋白基因Actin(GeneBank accession no.X16280)用来作为对照；F：TR::NcGDH转化植株(T₁)的根、茎、叶中NcGDH转录水平的定量RT-PCR分析，RNA分别从TR::NcGDH-1转化株系的根、茎、叶中提取。

具体实施方式

本发明在具体应用时，根据受体籼稻品种的不同，某些培养阶段的时间可以作适当调整。同样，根据表达载体所含筛选标记基因的不同，采用不同的组合筛选方式。下面结合2个具体实施例加以说明。

下述实施例用到的培养基，具体成份如下表1。

表1培养基种类及成分

实施例1

1.愈伤组织的诱导

选取成熟良好、饱满、无霉变的籼稻品种湘陵628S种子，用糙米机去掉种子的内外粰。先用70％酒精消毒2min，再浸泡于30％ NaClO+0.1％ Tween 20溶液，并置于100rpm的摇床上消毒30min。在超净工作台上，消毒后的去粰种子用无菌水洗涤5次，然后转移至装有无菌吸水纸的培养皿中吸干水分，再将去粰种子接种于诱导培养基中。培养条件为32℃，持续光照(100μmole m^-2 s^-1)。7天后即可见种子胚的盾片处诱导出愈伤组织，然后将整粒种子用于转化(参见图2A)。

2.载体的选择和农杆菌的准备

所用的农杆菌菌株为EHA105，表达载体为改造后的pCAMBIA1301，含有潮霉素抗性基因HPT和红色荧光蛋白基因AsRed为筛选标记基因，并加入了Gateway的重组边界序列。目的基因为来自粗糙脉孢杆菌(Neurospora crassa)的NADP(H)依赖型谷氨酸脱氢酶基因(GDH)，通过Gateway方式亚克隆入pCAMBIA1301。筛选标记基因HPT和AsRed均由CaMV35S启动子驱动，而目的基因则由烟草根部特异表达启动子TR(RB7启动子)驱动(参见图1)。另外，pCAMBIA1301载体中还含有卡那霉素抗性基因(aadA)，该基因不在T-DNA区域，仅用于细菌的筛选。含目的基因GDH的表达载体由电激法转入农杆菌EHA105中，选取阳性菌株。再将阳性菌株划线于含利福平100mg/L和卡那霉素50mg/L的YEB固体平板培养基中，于28℃暗培养3天。3天后，用接种针挑取米粒大小的农杆菌震荡悬浮于装有30mL AAM浸染培养基的50mL灭菌离心管中，以此作为愈伤组织的农杆菌浸染液。

3.愈伤组织和农杆菌的共培养

挑取诱导7天并且愈伤组织生长良好的种子浸泡于装有30mL农杆菌浸染液的50mL灭菌离心管中2min，其间并不时摇动。同时，在NB共培养基平板上预先垫1张无菌滤纸，用1mL的AAM浸染培养基打湿，并除去气泡。然后将浸染2min后的种子用无菌滤纸吸干，置于垫了滤纸的NB共培养基上于25℃暗培养3天。通常每个基因或载体需要100粒左右愈伤组织诱导良好的种子。

4.农杆菌的洗脱

将共培养3天后的种子置于50mL灭菌离心管中，先用无菌水洗涤4-5次，直至洗液清澈透明为止。然后加入过滤灭菌的500mg/L羧苄青霉素溶液30mL，于摇床上100rpm震荡洗涤15min。倒掉洗液，用无菌滤纸将种子吸干。

5.抗性愈伤组织的组合筛选

阳性愈伤组织的筛选分为潮霉素抗性筛选和红色荧光蛋白(RFP)的荧光筛选。

a.愈伤组织的潮霉素抗性筛选：将农杆菌洗脱后的种子置于含50mg/L潮霉素和400mg/L羧苄青霉素的筛选培养基上筛选培养14天(图2B)，每7天继代一次。培养条件为32℃，持续光照(100μmole m^-2 s^-1)。

b.愈伤组织的RFP筛选：在超净工作台上，将抗性筛选14天后的抗性愈伤组织置于绿光激发装置下，透过红色滤光膜筛选含RFP的愈伤组织用于后续的分化培养。有些愈伤组织肉眼就可以看到红色荧光(参见图2B)。

研究发现，约30％左右的抗性愈伤组织检测不到RFP，但是其再生苗却是阳性转化株。为了避免在RFP筛选中误把阳性愈伤组织剔除，此筛选步骤也可以仅进行潮霉素抗性筛选，通过后面生根培养过程中的潮霉素二次抗性筛选来剔除假阳性植株。

6.抗性愈伤组织的分化

将含RFP的愈伤组织转移至不含潮霉素但仍含有400mg/L羧苄青霉素的分化培养基上进行分化培养14天，即可得到再生植株(参见图2C)。分化培养过程也是每7天继代一次。培养条件为32℃，持续光照。

7.再生植株的生根和二次筛选

将再生植株移栽于含50mg/L潮霉素的生根培养基中筛选培养7天。抗性植株的根生长正常，7天后即可得到再生苗，而假阳性植株生长受到抑制，甚至开始黄化死亡(参见图2D)。对于进行了愈伤组织RFP筛选后的再生植株可以不必再进行潮霉素二次抗性筛选(参见图2E)。

8.炼苗和移栽

将根生长良好的再生苗洗去培养基，然后移栽至含有生根壮苗剂的培养土中于28℃持续光照的培养室中炼苗5天(参见图2F)。5天后再生苗即可移栽于大田中。

在实施例1中，本发明人对97粒愈伤组织诱导良好的种子进行了转化，最终得到了30个转NcGDH的湘陵628S独立转化株系，其转化效率达到了30.9％。随后对这些株系进行了潮霉素抗性和相关的分子检测，发现在转化株系中可以通过PCR扩增出红色荧光蛋白基因AsRed的特异性条带(参见图4A)，并且在其后代中(T₁)可以看到红色荧光蛋白在发芽种子中的分离现象(参见图4C)，而未转化的对照株系未检测到AsRed和红色荧光蛋白(参见图4B)。同样，在潮霉素抗性检测中，发现转化植株的幼苗因具有潮霉素抗性而生长正常，而未转化的对照株系因没有抗性而生长受到抑制，甚至褐化坏死(参见图4D)。NcGDH的转录水平分析发现，在转化株系中该基因都得到了超强表达，并且因受烟草特异启动子TR驱动而在根中表达量很高，表现出了很高的组织器官表达特异性(参见图4E和F)。相反，在未转化的对照株系中没有检测到该异源基因。

实施例2

1.愈伤组织的诱导

选取成熟良好、饱满、无霉变的籼稻品种ZR02种子，愈伤组织的诱导具体步骤同实施例1。

2.载体的选择和农杆菌的准备

表达载体为含有转录激活功能域基序VP64的改造pCAMBIA1301。其T-DNA区域含有Basta抗性基因bar和红色荧光蛋白基因AsRed为筛选标记基因，并加入了Gateway的重组边界序列。目的基因为来自水稻的转录因子基因bZIP17，通过Gateway方式亚克隆入该载体，与转录激活功能域基序VP64构成合成型转录因子。筛选标记基因bar和AsRed均由CaMV35S启动子驱动，而目的基因则由Ubiquitin启动子驱动(参见图3A)。另外，该表达载体还含有卡那霉素抗性基因(aadA)，该基因不在T-DNA区域，仅用于细菌的筛选。具体愈伤组织的农杆菌浸染液的准备步骤同实施例1。

3.愈伤组织和农杆菌的共培养

同实施例1。

4.农杆菌的洗脱

同实施例1。

5.抗性愈伤组织的组合筛选

愈伤组织的筛选分为除草剂抗性筛选和红色荧光蛋白(RFP)的荧光筛选。

a.愈伤组织的除草剂抗性筛选：将农杆菌洗脱后的种子置于含4mg/L Bialaphos的筛选培养基上筛选培养14天，每7天继代一次。培养条件为32℃，持续光照(100μmole m^-2s^-1)。

抗性基因bar能够抗Basta和Bialaphos等2种除草剂。Basta能显著降低愈伤组织的分化效率，甚至导致不能分化，但是价格便宜。Bialaphos对愈伤组织的分化效率影响很小，但价格昂贵。因此，在本方法中，采用Bialaphos进行愈伤组织的抗性筛选，而生根培养过程中的抗性筛选则采用价格便宜的Basta。

b.愈伤组织的RFP筛选：同实施例1。

同实施例1一样，为了避免在RFP筛选中误把阳性愈伤组织剔除，此筛选步骤也可以仅进行除草剂抗性筛，通过后面生根培养过程中的Basta抗性筛选来剔除假阳性植株(参见图3C)。

6.抗性愈伤组织的分化

将具有除草剂抗性并含RFP或仅具有除草剂抗性的愈伤组织转移至不含Bialaphos但仍含有400mg/L羧苄青霉素的分化培养基上进行分化培养14天，即可得到再生植株。分化培养过程也是每7天继代一次。培养条件为32℃，持续光照(100μmole m^-2 s^-1)。

7.再生植株的生根和二次筛选

将再生植株移栽于含50mg/L Basta的生根培养基中筛选培养7天。Basta抗性植株的根生长正常，7天后即可得到再生苗，而假阳性植株3天后开始黄化死亡(图3C)。对于进行了愈伤组织RFP筛选后的再生植株可以不必再进行Basta抗性筛选。

8.炼苗和移栽

同实施例1。

在实施例2中，本发明人对80粒愈伤组织诱导良好的种子进行了转化，最终得到了17个独立转化株系，其转化效率达到了21.3％。

除了以上籼稻品种湘陵628S和ZR02外，本发明人还采用本发明方法对其它籼稻品种如株1S、华819、特青和IR64等进行了转化实验，均得到了阳性转基因植株，而且转化效率在20-30％。这些研究结果更进一步证明了本发明方法的可靠性和稳定性。

Claims (7)

1.一种水稻转基因的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）愈伤组织的诱导

将水稻种子接种于诱导培养基中，培养条件为30-33℃，持续光照，培养至种子胚的盾片处诱导出愈伤组织；

（2）载体的选择和农杆菌的准备

将含有目的基因的表达载体转入农杆菌，选取阳性菌株，再将阳性菌株进行培养，然后将培养后的农杆菌震荡悬浮于含有浸染培养基的离心管中，作为愈伤组织的农杆菌浸染液；其中，所述表达载体还含有抗性基因，或者含有抗性基因和红色荧光蛋白基因；

（3）愈伤组织和农杆菌的共培养

将第（1）步诱导出愈伤组织的种子，浸泡于第（2）步得到的农杆菌浸染液，然后将浸染后的种子吸干，置于共培养基上于22-28℃黑暗培养2-5天；

（4）农杆菌的洗脱：洗涤共培养后的种子；

（5）抗性愈伤组织的筛选

首先进行愈伤组织的抗性筛选，将洗脱后的种子置于含有相应筛选剂的筛选培养基上, 于30-33℃和持续光照条件下筛选培养10-20天，每7-10天继代一次；若第（2）中的表达载体含有红色荧光蛋白基因，则进一步进行愈伤组织的RFP筛选，将抗性筛选10-20天后的抗性愈伤组织置于绿光激发装置下，透过红色滤光膜筛选含RFP的愈伤组织用于后续的分化培养；

（6）抗性愈伤组织的分化

将筛选出的愈伤组织转移至含有羧苄青霉素的分化培养基上，于30-33℃和持续光照条件下进行分化培养10-20天，得到再生植株；

（7）再生植株的生根和二次抗性筛选

若第（5）步中只进行了愈伤组织的抗性筛选，则将再生植株移栽于含有筛选剂的生根培养基中，于30-33℃和持续光照条件下进行二次抗性筛选和生根培养5-10天，获得再生苗；若第（5）步中进行了愈伤组织的抗性筛选和RFP筛选，则将再生植株移栽于不含有筛选剂的生根培养基中，于30-33℃和持续光照条件下进行生根培养5-10天，获得再生苗；

（8）炼苗和移栽

将再生苗洗去培养基，然后移栽至培养土中，于30-33℃持续光照的培养室中炼苗3-5天。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的持续光照强度为80-120 μmole m^-2 s^-1 。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：第（2）步中，挑取划线培养的农杆菌震荡悬浮于AAM浸染培养基作为愈伤组织的浸染液，其菌液吸光度为OD₆₀₀=0.05-0.15。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：第（2）步中，所述表达载体含有抗性基因和红色荧光蛋白基因；第（5）中，进行愈伤组织的抗性筛选和RFP筛选；第（7）步中，将再生植株移栽于含有筛选剂的生根培养基中，于30-33℃和持续光照条件下进行生根培养5-10天。

5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于：所述抗性基因为潮霉素抗性基因或Basta抗性基因，所述红色荧光蛋白基因为AsRed。

6.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于：第（1）步培养时间为5—10天。

7.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于：所述水稻是籼稻或粳稻。

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