CN102250943A - 一种农杆菌介导的大豆离体组织培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种农杆菌介导的大豆离体组织培养方法，包括步骤：将含重组载体的农杆菌与消毒后的大豆在发芽培养基上发芽1～4天的大豆子叶节外植体共侵染，在含有α-硫辛酸的共培养培养基中共培养3～5天，将大豆子叶节外植体转入含有筛选剂的固体芽诱导培养基上诱导芽的生长，然后转移到芽伸长培养基中培养至芽伸长为止，最后转移至生根培养基中生根。该方法利用抗氧化剂α-硫辛酸可减少外植体的褐化率，增加芽诱导率，增加GUS瞬时表达率，高效、稳定地提高大豆农杆菌介导转化效率。

Description

一种农杆菌介导的大豆离体组织培养方法

技术领域

本发明涉及生物工程领域中对植物进行基因转化的方法，具体涉及一种利用农杆菌介导的大豆离体组织培养方法。

背景技术

大豆(Glycine max(L.)Merr.)起源于我国，是植物蛋白质的主要来源，也是我国重要的油料作物和高蛋白粮饲兼用作物，种植面积仅次于水稻、玉米和小麦，居第四位。然而多年来，我国大豆生产一直停滞不前。大豆总产自五十年代初期的世界第一位，滑坡到现在的世界第四，同时也由世界大豆第一出口国变成世界第一进口国。我国自1995年开始大量进口大豆，1996年成为净进口国，之后进口量持续增加，逐步成为世界上最大的大豆进口国。2007年我国大豆进口量再创新高，达到3082.1万吨，是国产大豆的2倍，同年进口大豆油282.3万吨，其中绝大部分是转基因大豆及其产品。2009年全球转基因大豆种植面积达9000万公顷，占大豆种植面积的四分之三。美国转基因大豆种植面积已达81％，巴西64％，阿根廷几乎100％种植转基因大豆。尽管目前至少有9个国家大面积种植了转基因大豆，几乎包括了除我国以外的所有大豆主产国，但我国作为大豆的最大消费国和进口国却一直未能实现转基因大豆的商业化生产。与其它作物相比，大豆转化效率很低，低效率的大豆转基因体系极大地限制了我国大豆新功能基因的发掘和转基因大豆的产业化。

大豆的转基因方法主要有农杆菌介导法、基因枪法、电击法、PEG法、显微注射法、超声波辅助农杆菌转化法和花粉管通道法等。其中，农杆菌介导法仍为大豆常用的转基因方法。农杆菌介导转化过程中实际上是利用病原物侵染宿主这一过程。植物受到病原物侵染过程中，由于自身的防御反应，会产生大量的活性氧(ROS)，利用活性氧杀死病原菌或抑制病原菌生长。但活性氧经常在病原菌引起的过敏反应之后产生，可导致植物细胞组织迅速坏死(Greenberg et al.1994)。在农杆菌介导转化过程中常引起靶组织细胞褐变坏死，使靶组织细胞生活率下降。采用新霉素磷酸转移酶基因(NPTII)作为筛选标记，农杆菌介导转化常发生“嵌合体”的现象，在苹果、梨、香蕉、葡萄等果树作物中，嵌合体发生率可达40％-90％，而在花椰菜转化过程中，嵌合体发生率甚至可达95％；此外某些植物难以再生和转化，存在“离体顽拗”的现象。组织坏死或褐变、嵌合体产生和离体顽拗是限制植物农杆菌介导转化的三个主要因素，从表面上看，这三者之间没有本质的联系，但最近研究表明这三种现象的产生与农杆菌介导转化过程中活性氧的大量产生密切有关，活性氧使植物生长抑制、细胞死亡，影响植物代谢的过程，导致植物再生困难和产生嵌合体。抗氧化剂的应用可减少转化与非转化组织细胞的褐变与坏死，以及芽逃逸的数量。除此之外抗氧化剂还能增加双子叶植物转化的稳定效率。研究表明，在共培养培养基中添加抗硫化剂硫醇类化合物和L-半胱氨酸可以防止由农杆菌侵染而导致的组织坏死现象，从而提高转化频率。在固体共培养基中添加400mg/L L-半胱氨酸，农杆菌T-DNA瞬时转化效率从37％提高到91％，正在发育的芽原基T-DNA转化增加了35倍，且外植体组织褐变也有所减轻。

硫辛酸(LA)，亦称α-硫辛酸(α-LA)，是一种维生素，其化学名称是1，2-二硫戊环-3-戊酸，它既溶于水又溶于脂肪。α-LA是已知天然抗氧剂中效果最强的一种，能够再生内源性抗氧化剂，如维生素E(VE)、维生素C(VC)、辅酶Q10、谷胱甘肽(glutathione，GSH)以及LA本身，被称为“抗氧化剂的抗氧化剂”。LA是丙酮酸脱氢酶的辅助因子，它在丙酮酸转变为乙酰辅酶A、生成还原型黄素腺嘌呤二核苷酸(FADH)，参与三羧酸循环过程中是不可缺少的物质。LA是代谢性抗氧剂，在生物体内可以转化为还原型的不易溶于水但容易溶于酒精中的二氢硫辛酸(DHLA)。

在植物转化过程中，应用抗氧化剂可以解决植物转化过程中遇到的三大难题，即在植物转化过程中转化细胞或组织的坏死与褐变、转化组织或细胞的再生困难问题以及“芽逃离”的现象。Dan等(Dan Y H，Armstrong C L，Dong J等，Lipoic acid-a unique plant transformation enhancer，In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant，2009，6(45)630-638)发现在植物转化过程中应用LA可使大豆转化效率从0.6％提高到3.79％，蕃茄转化效率从29.8％提高到87.0％，小麦转化效率从2.8％提高到5.7％，抗草甘膦棉花的胚从41.4％提高到61.2％；植物转化在含筛选剂条件下，西红柿未转化芽的再生从91.5％下降到46.2％；大豆未转化芽再生从92.0％下降到72.0％。

发明内容

本发明提供了一种农杆菌介导的大豆离体组织培养方法，利用抗氧化剂α-硫辛酸可减少外植体的褐化率，增加芽诱导率，增加GUS瞬时表达率，高效、稳定地提高大豆农杆菌介导转化效率。

一种农杆菌介导的大豆离体组织培养方法，包括步骤：

将含重组载体的农杆菌与消毒后的大豆种子在发芽培养基(Germinationmedium，GM)上培养1～4天的大豆子叶节外植体共侵染，在含有α-硫辛酸的共培养培养基(Co-cultivation medium，CCM)中共培养3～5天，取出大豆子叶节外植体，清洗干净后转入含有筛选剂的固体芽诱导培养基(Shootinduction medium，SI)上诱导芽的生长，然后将外植体转移到芽伸长培养基(Shoot elongation medium，SE)中培养至芽伸长为止，最后转移至生根培养基(Rooting medium，RM)中生根。

所述的大豆品种选用由华南农业大学提供的大豆粤春04-5、大豆粤春03-3或黑龙江省农科院提供的大豆黑农37。

所述的大豆子叶节外植体选用发芽1天～4天的大豆子叶节。

所述的大豆子叶节外植体与农杆菌菌液一般先共侵染30min后，再放入含有α-硫辛酸的共培养培养基中培养3～5天。

所述农杆菌菌株选用胭脂碱LBA4404或农杆碱EHA101。

所述的重组载体选用载体pTF102(Frame et al.，Plant Physiol.129：13-22(2002))或载体pSOY22；所述的载体pTF102含有报告基因β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase，GUS)和草丁膦筛选标记基因；所述的载体pSOY22含有草丁膦筛选标记基因和二个抗虫目的基因，所述的二个抗虫目的基因分别为胰蛋白酶抑制剂基因和几丁质酶基因。

所述的载体pTF102是在现有pTF101.1(其物理结构图谱如图1，Paz etal.(2004)Euphytica 136：167-179)载体的基础上将pTF101.1的载体中插入GUS基因得到的，且GUS基因是由35S启动子启动，载体pTF102的物理结构图谱如图2。

所述的载体pSOY22是将现有pTF101.1的载体中插入二个抗虫目的基因分别为胰蛋白酶抑制剂基因和几丁质酶基因，这二个基因均由植物受伤诱导启动子启动，载体pSOY22的物理结构图谱如图3。

所述的抗氧化剂α-硫辛酸可采用市售产品，如Sigma公司代码T-1395的LA。将LA溶解于乙醇或KOH水溶液，配成100mg/ml的母液，过滤灭菌，贮藏在-20℃冰箱。用时将母液在冰浴中慢慢溶解，在培养基中加入不同质量的LA，如以1L培养基计，分别加入0mg，25mg，50mg，75mg，100mg的LA，分别得到LA浓度为0mg/L，25mg/L，50mg/L，75mg/L，100mg/L。

所述的发芽培养基可选用常用的发芽培养基，如以B5培养基为基本培养基添加2％蔗糖和0.8％琼脂的发芽培养基。

所述的共培养培养基的组成为：以1/10B5培养基(Gamborg O L，MillerR A and Ojima K(1986)Nutrient requirements of suspension cultures of soybeanroot cells.Exp.Cell Res.50：151-158)为基本培养基，添加3％(质量百分比)蔗糖、20mmol/L 2-(N-吗啉)乙烷磺酸(2-morpholinoethane-sulfonic acid，MES)、0.45％(质量百分比)琼脂、1.7mg/L 6-苄氨基嘌呤(N6-benzylaminopurine，BAP)、0.25mg/L赤霉酸(Gibberellic acid，GA3)和200μmol/L乙酰丁香酮(acetosyringone，AS)。

所述的固体芽诱导培养基的组成为：以B5培养基为基本培养基，添加3％(质量百分比)蔗糖、20mmol/L 2-(N-吗啉)乙烷磺酸(2-morpholinoethane-sulfonic acid，MES)、0.8％(质量百分比)琼脂和1.7mg/L 6-苄氨基嘌呤(N6-benzylaminopurine，BAP)。

所述的筛选剂选用草丁膦。

所述的芽伸长培养基的组成为：以MS培养基(Murashige，T.，Skoog，F.(1962)A revised medium for rapid growth and bioassays in tobacco tissueculture.Physiol.Plant.15：474-493)为基本培养基，添加1mg/L玉米素(zeartin，ZT)、0.1mg/L吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)、0.5mg/L赤霉素(GA3)、50mg/L谷氨酰胺、50mg/L天冬酰胺、3％(质量百分比)蔗糖和0.7％(质量百分比)的琼脂。

所述的生根培养基的组成为：以MS培养基为基本培养基，添加0.5mg/L萘乙酸(1-naphthlcetic acid，NAA)、2％(质量百分比)蔗糖和8g/L琼脂；或者，以MS培养基为基本培养基，添加0.1mg/L吲哚乙酸(indole-3-aceticacid，IAA)、2％(质量百分比)蔗糖和8g/L琼脂。

所述的琼脂均选用美国BD Difico公司的高纯度的琼脂。

每升共培养培养基中α-硫辛酸的添加量为25mg-50mg，优选为25mg。

所述采用的大豆农杆菌介导转化方法是根据Paz等(Paz MM，MartinezJC，Kalvig AB，Fonger TM，Wang K.Improved cotyledonary node method usingan alternative explants derived from mature seed for efficientAgrobacterium-mediated soybean transformation.Plant Cell Rep.2006，25：206-213)的方法略作修改，Paz等的方法是采用二硫苏糖醇和半胱氨酸为抗氧化剂研究大豆农杆菌介导转化效率。本发明的大豆农杆菌介导转化方法具体做法为：大豆种子先在氯气中灭菌15-20小时，灭菌后的种子在操净工作台上吹过夜以去除多余的氯气，然后直接播种在发芽培养基上；以大豆子叶节为外植体与农杆菌共侵染，在光照条件下与共培养培养基共培养3～5天；共培养后外植体先用液体芽诱导培养基清洗3-4次以洗去多余的农杆菌，然后直接将外植体转入含有筛选剂的固体芽诱导培养基上，共培养四周，每隔2周继代一次；芽诱导后的外植体转到芽伸长培养基上，每隔2周继代一次，直到芽伸长为止；伸长的芽在生根培养基上生根，生根后的大豆植株移入泥土种植。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明建立的农杆菌转化大豆的方法，添加新型抗氧化剂LA，已将胰蛋白酶抑制剂基因和几丁质酶基因采用农杆菌鉴定法转入大豆品种，并对转基因株系进行了PCR鉴定、筛选标记基因草丁膦涂抹试验和bar试纸条检测试验，已明确外源基因转入到大豆受体品种大豆粤春04-5、大豆粤春03-3或大豆黑农37品种中，且转化效率较稳定达到了1.5％，重复性好，个别转化事件转化效率可得到8.3％。

本发明方法利用抗氧化剂α-硫辛酸可减少外植体的褐化率，增加芽诱导率，增加GUS瞬时表达率，进而高效、稳定地提高大豆农杆菌介导转化效率。大豆转化效率的提高对研究大豆功能基因组学及我国大豆品种的遗传改良和创制转基因大豆品种具有十分重要的意义。

附图说明

图1为载体PTF101.1的物理结构图谱；

图2为载体PTF102的物理结构图谱；

图3为载体pSOY22的物理结构图谱；

图4为不同LA浓度对子叶节外植体褐化程度图；

图5为不同浓度LA对子叶节外植体GUS瞬时表达图，A、B、C、D、E分别代表LA浓度为0、25、50、75、100mg/L；

图6为不同浓度LA对大豆子叶节外植体芽再生影响图，A、B、C、D、E分别代表LA浓度为0、25、50、75、100mg/L；

图7为转基因苗多聚酶链反应(PCR)图；

图8为转基因苗草丁膦涂抹试验图；

图9为转基因苗bar试纸条检测试验图；

图10为转基因苗在温室的长势长相；

图11为转基因苗在温室的另一种长势长相。

具体实施方式

所使用的培养基的为：

GM：以B5培养基为基本培养基添加2％蔗糖，0.8％琼脂，pH5.8。

CCM：以1/10B5培养基为基本培养基，添加3％蔗糖、20mM(mmol/L)MES和0.45％DB Difico Nobal琼脂，pH 5.4。高温高压灭菌后添加1.7mg/LBAP、0.25mg/L GA3和200μM(μmol/L)乙酰丁香酮。

SI：以B5培养基为基本培养基添加添加3％蔗糖、20mM MES和0.8％DB Difico Nobal琼脂，pH 5.8。高温高压灭菌后添加1.7mg/L BAP和必要的筛选剂。

SE：以MS培养基为基本培养基添加1mg/L ZT，0.1mg/L IAA，0.5mg/L GA3，50mg/L glutamine，50mg/l asparagine，3％蔗糖，0.7％Nobal agar，pH5.8。

RM：以MS培养基为基本培养基添加0.5mg/L NAA or 0.1mg/L IAA，2％蔗糖，8g/L琼脂，pH5.8。

农杆菌介导的大豆离体组织培养方法为：将大豆种子先在氯气中灭菌15小时，灭菌后的种子在操净工作台上吹过夜以去除多余的氯气，然后直接播种在发芽培养基(Germination medium，GM)上；以子叶节为外植体与农杆菌或含重组载体的农杆菌共侵染，在光照条件下与含有α-硫辛酸的共培养培养基(Co-cultivation medium，CCM)共培养；共培养后外植体先用液体芽诱导培养基清洗4次以洗去多余的农杆菌，然后直接将外植体转入含有筛选剂的固体芽诱导培养基(Shoot induction medium，SI)上，共培养四周，每隔2周继代一次；芽诱导后的外植体转到芽伸长培养基(Shoot elongationmedium，SE)上，每隔2周继代一次，直到芽伸长为止；伸长的芽在生根培养基(Rooting medium，RM)上生根，生根后的大豆植株移入泥土种植。

实施例1、LA对大豆子叶节外植体GUS瞬时表达率影响

本试验通过采用大豆品种“粤春04-5”探索不同浓度(0mg/L；25mg/L；50mg/L；75mg/L；100mg/L)LA对大豆子叶节农杆菌介导GUS瞬时表达的影响。以发芽1天的大豆子叶节外植体在农杆菌EHA101含GUS基因和草丁膦筛选标记基因的pTF102载体侵染30分钟后，在共培养培养基中加入不同浓度LA，共培养3天后，统计农杆菌介导子叶节GUS瞬时表达率。当LA浓度为25mg/L和50mg/L时外植体的GUS瞬时表达率较高；而把LA浓度增加到75mg/L和100mg/L时GUS瞬时表达率显著下降且低于对照(0mg/LLA)。LA浓度为25mg/L时，GUS瞬时表达效率为64.58％，呈极显著差异。

实施例2、LA对大豆子叶节外植体褐变和芽诱导再生影响

采用大豆品种粤春04-5探索不同浓度LA对大豆子叶节外植体芽再生的影响。我们发现将发芽四天的大豆子叶节外植体，与不含质粒的农杆菌LBA4404侵染30min，在添加不同浓度LA(0mg/L；25mg/L；50mg/L；75mg/L；100mg/L)的共培养基共培养3天后，外植体的长势明显不同。如图4不同浓度的LA对子叶节外植体长势影响大，随着共培养基中LA浓度的升高，外植体的褐化程度明显下降，当LA浓度达50mg/L时，我们发现外植体下胚轴往内侧卷曲，且浓度越高卷曲程度越高同时下胚轴也越细弱。我们发现随着LA浓度的升高外植体褐化情况呈递减趋势。共培养培养基中不加LA时100％外植体褐化，加入浓度为25mg/L LA时褐化程度降低到93.99％，加入浓度为50mg/L LA时褐化程度显著降低到22.87％，加入浓度为75mg/LLA时褐化程度降低到5％，加入浓度为100mg/L LA时外植体不褐化，伤口处十分鲜嫩，且整个子叶与共培养前无明显差异。在芽诱导培养基中培养4周后，发现不同LA浓度对子叶节再生诱导率存在很大差异。随LA浓度的升高，芽诱导率降低，但低浓度的LA对大豆子叶节芽诱导影响不大。

实施例3、不同类型抗氧化剂对大豆子叶节外植体芽瞬时表达影响

以大豆品种粤春04-5发芽3天的大豆子叶节为外植体，农杆菌EHA101含GUS基因和草丁膦筛选标记基因的pTF102载体侵染30分钟后，共培养时分别加入不同的抗氧化剂如25mg/L LA(图5-A)；3.3mM半胱氨酸(CYS)+3.3mM二硫苏糖醇(DTT)(图5-B)；3.3mM CYS+3.3mM DTT+30μMAg₂S₂O₃(图5-C)和30μM Ag₂S₂O₃(图5-D)以及不加任何抗氧剂的对照组(图5-E)共培养3天后，通过测定GUS瞬时表达率来确定不同抗氧化剂对大豆转化的影响。由图5可知共培养基中添加25mg/L LA GUS瞬时表达率为75.56％，共培养基中添加3.3mM CYS+3.3mM DTT GUS瞬时表达率为61.27％，共培养基中添加3.3mM CYS+3.3mM DTT+30μM Ag₂S₂O₃GUS瞬时表达率为58.42％，显著高于共培养基中添加30μM Ag₂S₂O₃和不添加任何抗氧化剂的对照组，其中添加25mg/LLA的处理瞬时转化效率最高。

实施例4、不同类型抗氧化剂对大豆子叶节外植体芽诱导再生影响

以大豆品种粤春04-5发芽3天的大豆子叶节为外植体，农杆菌LBA4404空菌侵染30分钟，共培养时加入不同的抗氧化剂如25mg/L LA(图6-A)；3.3mM CYS+3.3mM DTT(图6-B)；3.3mM CYS+3.3mM DTT+30μMAg₂S₂O₃(图6-C)和30μM Ag₂S₂O₃(图6-D)以及不加任何抗氧剂的对照组(图6-E)来明确不同类型抗氧化剂大豆子叶节芽再生的影响。由图6可知，在芽诱导培养基中培养4周后各个处理间芽诱导率无显著差异，但加入抗氧化剂的处理都高于对照，且以LA浓度为25mg/L的处理芽再生率88.33％最高。培养3个月后，统计生根苗率，由数据可知，共培养基中加入浓度25mg/L LA时生根苗率高达43.21％，显著高于生根苗率为22.98％在共培养基中未加入抗氧化剂的对照组。

由此可知，应用新型的抗氧化剂对大豆再生和转化都是有效的，既可以降低外植体侵染的褐化状况，提高大豆再生成苗的能力又可以显著的增强农杆菌的侵染能力，提高大豆的转化效率，其中共培养基中加入浓度为25mg/L的LA作用效果尤为明显。

实施例5、LA应用于大豆农杆菌介导转化研究

以粤春04-5发芽4天的大豆子叶节为材料，以pSOY22为载体，该载体含有草丁膦筛选标记基因和二个抗虫目的基因即胰蛋白酶抑制剂基因和几丁质酶基因，在共培养培养基中添加25mg/l LA作为抗氧化剂，共转化外植体数1595，得到多聚酶链反应检测阳性和抗除草剂草丁膦转基因苗24株，转化效率为1.5％，在一些转化试验中，个别转化事件转化效率可得到8.3％。

Claims (10)

1.一种农杆菌介导的大豆离体组织培养方法，包括步骤：

将含重组载体的农杆菌与消毒后的大豆在发芽培养基上发芽1～4天的大豆子叶节外植体共侵染，在含有α-硫辛酸的共培养培养基中共培养3～5天，将大豆子叶节外植体转入含有筛选剂的固体芽诱导培养基上诱导芽的生长，然后转移到芽伸长培养基中培养至芽伸长为止，最后转移至生根培养基中生根。

2.根据权利要求1所述的农杆菌介导的大豆离体组织培养方法，其特征在于，所述的大豆品种为大豆粤春04-5、大豆粤春03-3或大豆黑农37。

3.根据权利要求1所述的农杆菌介导的大豆离体组织培养方法，其特征在于，所述的共培养培养基的组成为：以1/10B5培养基为基本培养基，添加3％蔗糖、20mmol/L 2-(N-吗啉)乙烷磺酸、0.45％琼脂、1.7mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.25mg/L赤霉酸和200μmol/L乙酰丁香酮。

4.根据权利要求1所述的农杆菌介导的大豆离体组织培养方法，其特征在于，所述的固体芽诱导培养基的组成为：以B5培养基为基本培养基，添加3％蔗糖、20mmol/L 2-(N-吗啉)乙烷磺酸、0.8％琼脂和1.7mg/L 6-苄氨基嘌呤。

5.根据权利要求1所述的农杆菌介导的大豆离体组织培养方法，其特征在于，所述的筛选剂为草丁膦。

6.根据权利要求1所述的农杆菌介导的大豆离体组织培养方法，其特征在于，所述的芽伸长培养基的组成为：以MS培养基为基本培养基，添加1mg/L玉米素、0.1mg/L吲哚乙酸、0.5mg/L赤霉素、50mg/L谷氨酰胺、50mg/L天冬酰胺、3％蔗糖和0.7％琼脂。

7.根据权利要求1所述的农杆菌介导的大豆离体组织培养方法，其特征在于，所述的生根培养基的组成为：以MS培养基为基本培养基，添加0.5mg/L萘乙酸、2％蔗糖和8g/L琼脂；或者，以MS培养基为基本培养基，添加0.1mg/L吲哚乙酸、2％蔗糖和8g/L琼脂。

8.根据权利要求1所述的农杆菌介导的大豆离体组织培养方法，其特征在于，所述的农杆菌菌株为LBA4404或EHA101。

9.根据权利要求1所述的农杆菌介导的大豆离体组织培养方法，其特征在于，每升共培养培养基中α-硫辛酸的添加量为25mg-50mg。

10.根据权利要求1所述的农杆菌介导的大豆离体组织培养方法，其特征在于，所述的重组载体为载体pTF102或载体pSOY22；所述的载体pTF102含有报告基因β-葡萄糖苷酸酶和草丁膦筛选标记基因；所述的载体pSOY22含有草丁膦筛选标记基因和二个抗虫目的基因，所述的二个抗虫目的基因分别为胰蛋白酶抑制剂基因和几丁质酶基因。

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