CN102559747B - 一种利用调节异黄酮生物合成提高大豆遗传转化效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用调节异黄酮生物合成提高大豆遗传转化效率的方法，其特征在于包括以下步骤：①种子的消毒、②种子的萌发培养、③外植体制备、④固体共培养基的制备、⑤农杆菌侵染液的制备、⑥农杆菌侵染和共培养、⑦芽诱导和抗性植株的获得。本发明在农杆菌介导大豆子叶节外植体的侵染过程中，在外植体与农杆菌的共培养期的固体培养基中添加苯丙氨酸解氨酶PAL活性的抑制剂，抑制大豆异黄酮合成的关键酶PAL，减少大豆异黄酮类次生代谢产物的合成和积累，从而降低大豆外植体的“免疫力”，提高农杆菌的被侵染力，通过改善这种植物/农杆菌互作关系大大提高了大豆抗性植株的数量和遗传转化效率。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域，涉及一种利用调节异黄酮生物合成提高大豆遗传转化效率的方法，更具体的说是一种通过抑制大豆异黄酮生物合成途径的关键酶-苯丙氨酸解氨酶PAL的活性，克服大豆遗传转化障碍、提高其农杆菌转化效率的方法。
背景技术
作物遗传转化常用的方法是基因枪法和农杆菌法。基因枪法由于穿透力强，包被在微弹中的外源基因借助轰击压力直接穿过细胞壁和细胞膜而进入植物基因组，从而实现外源基因转化的目的，因此基因枪法具有转化时间短、无宿主限制等优点。但适宜基因枪法的受体大多需要经过愈伤诱导、绿苗分化再生等繁琐的组织培养过程，而大豆的愈伤诱导、绿苗分化再生较难，因此目前很少用基因枪法转化大豆。农杆菌法是利用根癌农杆菌对植物的侵染特性把外源基因导入植物基因组的方法，因其拷贝数少、整合完整、遗传稳定以及受目的基因分子量限制小而广泛应用于植物的遗传转化。双子叶植物虽然是农杆菌的天然宿主，但直到1983年才由Pederson等证明了大豆可作为农杆菌的合适宿主。Hinchee等(1988)首次报告了农杆菌成功转化大豆的事例。自Hinchee等(1988)首次报道利用农杆菌转化大豆子叶节成功以来，因其不必经过愈伤组织的诱导过程，直接从子叶节部位的分生组织分化出芽，解决了大豆的离体再生难问题，使得农杆菌转化子叶节法成为最常用的大豆遗传转化方法。目前对农杆菌转化大豆的研究主要集中在选用强毒力菌株、构建高效表达载体、添加化学物质诱导VIR基因的高效表达、以及防止组织坏死提高T-DNA转移效率等方面，这些都是通过研究农杆菌转化大豆的外源物质或农杆菌本身等大豆外部因素来实现大豆遗传转化的，转化率低，而对于通过调节大豆内源物质降低对农杆菌侵染的抑制作用方面的研究未见报道。
大豆富含异黄酮，大豆异黄酮可调节复杂的植物/微生物互作(马君兰等，2007)，在动物上具有提高机体免疫力的功效。异黄酮类物质是由苯丙烷类代谢途径的一个分支所合成的，而苯丙氨酸解氨酶PAL是其生物合成途径的第一个关键酶，能够在转录和转录后水平对异黄酮的生物合成进行调控。有研究表明，苯丙氨酸解氨酶PAL抑制剂处理甘薯后几个小时内就可以检测到PAL酶活性的降低及下游代谢产物合成积累的受阻(王敬文等，1981)，而农杆菌一般在附着外植体16个小时后才开始T-DNA的转移(王关林等，1998)，这就为农杆菌转化大豆过程中人为调控PAL酶活性提供可能性和时机。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述技术缺陷提供一种利用调节异黄酮生物合成提高大豆遗传转化效率的方法。本发明的原理是通过苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂，抑制大豆异黄酮合成的关键酶PAL，减少大豆异黄酮类次生代谢产物的合成和积累，从而降低大豆外植体的“免疫力”，提高农杆菌的被侵染力，也就是说从改善植物/农杆菌互作关系方面提供了一种提高大豆遗传转化效率的方法。
本发明提供了一种利用调节异黄酮生物合成提高大豆遗传转化效率的方法，其特征在于包括如下步骤：
①种子的消毒：取健康饱满大豆种子，放入含有100ml 30％次氯酸钠和4ml浓盐酸的密闭容器内，利用反应生成的氯气消毒24～36小时；
②种子的萌发培养：将步骤①中的种子接种到B5萌苗培养基中进行为期5～6天的25℃、16/8h光暗周期的培养；
③外植体制备：将步骤②中的种子在无菌条件下去掉种皮、切掉幼叶和上胚轴，保留0.5～2.0cm的下胚轴，用手术刀片对子叶节部位进行创伤处理；
④固体共培养基的制备：向经过121℃高压灭菌15min后的含有B5大量元素、B5微量元素、6-BA、IBA、MES、蔗糖、琼脂，PH 5.4的培养基中，再加入抽滤灭菌的硫代硫酸钠，DTT，半胱氨酸，B5有机成分、乙酰丁香酮AS及苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂，混匀后按30ml/皿分装到φ90mm的灭菌培养皿中；
⑤农杆菌侵染液的制备：将含有外源基因的重组农杆菌悬于含有1/10×B5大量元素、1/10×B5微量元素、1×B5有机成分6-BA1.0mgL-1、IBA 0.2mg L-1、MES 3.9g L-1、蔗糖30g L-1，乙酰丁香酮AS200μM，PH 5.4的培养基中，调节菌液浓度到OD600≈0.5，室温静置半小时备用；
⑥农杆菌侵染和共培养：将步骤③中的外植体放入100ml三角瓶中，加入步骤⑤制备的农杆菌侵染液中，摇床上80rpm低速转动30分钟后，取出外植体，用灭菌滤纸吸掉多余菌液，摆放到步骤④中固体共培养培养基上，暗培养3～5天；
⑦芽诱导和抗性植株的获得：将步骤⑥中的外植体转移到恢复培养基上培养7天后，转移到带有筛选压的芽诱导培养基上培养14～21天，然后将诱导出抗性芽的外植体转移到芽伸长培养基上进行芽伸长，芽长4～5cm时转移到生根培养基中，获得转化再生植株移栽到花盆中获得转化的抗性植株。
所述一种利用调节异黄酮生物合成提高大豆遗传转化效率的方法，其特征在于步骤④固体共培养基的制备中所述的苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂为α-氨氧基乙酸AOA、放线菌素D、激酶抑制剂K252a其中的一种。
所述一种利用调节异黄酮生物合成提高大豆遗传转化效率的方法，其特征在于骤④中所述固体共培养基的制备为向经过121℃高压灭菌15min后的含有1/10×B5大量元素、1/10×B5微量元素、6-BA1.0mg L-1、IBA 0.2mg L-1、MES 3.9g L-1、蔗糖30g L-1、琼脂5g L-1，PH 5.4的培养基中，再加入抽滤灭菌的硫代硫酸钠158mg L-1，DTT 154mg L-1，半胱氨酸1gL-1，1×B5有机成分，AS 200μM及20～50μmolL-1α-氨氧基乙酸AOA苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂，混匀后按30ml/皿分装到φ90mm的灭菌培养皿中。
所述一种利用调节异黄酮生物合成提高大豆遗传转化效率的方法，其特征在于骤④中所述固体共培养基的制备为向经过121℃高压灭菌15min后的含有1/10×B5大量元素、1/10×B5微量元素、6-BA1.0mg L-1、IBA 0.2mg L-1、MES 3.9g L-1、蔗糖30g L-1、琼脂5g L-1，PH 5.4的培养基中，再加入抽滤灭菌的硫代硫酸钠158mg L-1，DTT 154mg L-1，半胱氨酸1gL-1，1×B5有机成分，AS 200μM及2.39μmo l L-1放线菌素D苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂，混匀后按30ml/皿分装到φ90mm的灭菌培养皿中。
所述一种利用调节异黄酮生物合成提高大豆遗传转化效率的方法，其特征在于骤④中所述固体共培养基的制备为向经过121℃高压灭菌15min后的含有1/10×B5大量元素、1/10×B5微量元素、6-BA1.0mg L-1、IBA 0.2mg L-1、MES 3.9g L-1、蔗糖30g L-1、琼脂5gL-1，PH 5.4的培养基中，再加入抽滤灭菌的硫代硫酸钠158mg L-1，DTT 154mg L-1，半胱氨酸1gL-1，1×B5有机成分，AS 200μM及0.01～0.2μmol L-1激酶抑制剂K252a苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂，混匀后按30ml/皿分装到φ90mm的灭菌培养皿中。
所述一种利用调节异黄酮生物合成提高大豆遗传转化效率的方法，其特征在于步骤④固体共培养基的制备中所述的苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂α-氨氧基乙酸AOA使用浓度为30μmo l L-1。
所述一种利用调节异黄酮生物合成提高大豆遗传转化效率的方法，其特征在于步骤⑤农杆菌侵染液的制备中所述的含有外源基因的重组农杆菌是利用热击法将含有PPT抗性基因的质粒PCAMBIA3301导入到根癌农杆菌EHA105所得到的重组农杆菌。
本发明在农杆菌介导大豆子叶节外植体的侵染过程中，在外植体与农杆菌的共培养期的固体培养基中添加苯丙氨酸解氨酶PAL活性的抑制剂，其目的是降低大豆异黄酮等次生代谢产物对农杆菌侵染的抑制作用，提高了农杆菌侵染频率，侵染后的外植体经不定芽诱导、伸长、生根，明显增加了获得大豆抗性植株的数量，如在外植体与农杆菌的共培养期的固体培养基中添加30μmol L-1苯丙氨酸解氨酶PAL活性的抑制剂α-氨氧基乙酸AOA后，大豆抗性植株获得率为10.29％，而空白对照组获得抗性植株率仅为1.68％；同样在外植体与农杆菌的固体共培养期的培养基中添加2.39μmol L-1苯丙氨酸解氨酶PAL活性的抑制剂放线菌素D后，大豆抗性植株获得率为14.0％，而空白对照组获得抗性植株率仅为0.78％，获得大豆抗性植株的数量增加了13.22％，明显的提高了大豆农杆菌介导遗传转化效率。
附图说明
图1是在固体共培养基中添加不同浓度的苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂α-氨氧基乙酸AOA对大豆遗传转化效率影响效果图
图中
抗性植株获得率＝生根良好的移栽植株数/处理的外植体总数*100％；
CK表示在固体共性培养基中不添加苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂
α-氨氧基乙酸AOA。
图2是在固体共培养集中添加2.39μmo l L-1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂放线菌素D对大豆遗传转化效率影响效果图
图中
抗性植株获得率＝生根良好的移栽植株数/处理的外植体总数*100％；
CK表示在固体培养基中不添加苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂放线菌素D。
图3是在固体共培养基中添加不同浓度的苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂K252a对大豆遗传转化效率影响效果图
图中
抗性植株获得率＝生根良好的移栽植株数/处理的外植体总数*100％；
CK表示在固体培养基中不添加苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂K252a。
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不以任何方式限制本发明的范围。
具体实施方式
实施例中所使用的培养基配方如无特殊说明，均为常规培养基，所用试剂如无特殊说明均购自上海生工生物工程技术有限公司，所用农杆菌菌株EHA105购买自北京天思泽基因科技有限公司，质粒PCAMBIA3301购买自澳大利亚CAMBIA公司。
实施例1：在固体共培养基中添加20μmol L-1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂α-氨氧基乙酸AOA对大豆遗传转化效率的影响
1.种子消毒：取健康饱满的冀黄13大豆种子，放入含有100ml 30％次氯酸钠和4ml浓盐酸的密闭容器内，利用反应生成的氯气消毒36小时；
2.种子的萌发培养：将步骤1中的种子接种到B5培养基中进行6天25℃、16/8h光暗周期的培养；
3.外植体制备：将步骤2中萌发好的种子，无菌条件下去掉种皮，切掉幼叶和上胚轴，保留0.5cm长的下胚轴，用手术刀片对子叶节部位进行创伤处理；
4.农杆菌侵染液的制备：利用热击法将含有PPT抗性基因的质粒PCAMBIA3301导入到根癌农杆菌EHA105得到的重组农杆菌。将该重组农杆菌接种在含有50mg L-1利福平、50mg L-1卡那霉素的YEP液体培养基中，28℃、200rpm振荡培养至对数增长期，OD600在0.8-1.0左右。将菌液移至50ml无菌离心管中，4℃、5000rpm离心10min，弃上清，收集管底菌体部分。将含有1/10×B5大量元素、1/10×B5微量元素、1×B5有机成分6-BA1.0mg L-1、IBA 0.2mg L-1、MES 3.9g L-1、蔗糖30g L-1，乙酰丁香酮AS 200μM，PH 5.4的培养基导入离心管中，颠倒摇晃使菌体悬浮均匀，调节菌液浓度到OD600≈0.5，室温静置半小时备用；
5.固体共培养基制备：向经过121℃高压灭菌15min后的含有1/10×B5大量元素、1/10×B5微量元素、6-BA1.0mg L-1、IBA 0.2mg L-1、MES 3.9g L-1、蔗糖30g L-1、琼脂5g L-1，PH 5.4的培养基中，加入抽滤灭菌的硫代硫酸钠158mg L-1，DTT 154mg L-1，半胱氨酸1gL-1，1×B5有机成分，AS 200μM，然后再分别加入20μmolL-1的苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂α-氨氧基乙酸AOA，以不加α-氨氧基乙酸AOA的处理为对照，混匀后按30ml/皿分装到φ90mm的灭菌培养皿中；
6.农杆菌侵染和共培养：将步骤3中的外植体放入100ml三角瓶中，加入按步骤4制备好的农杆菌侵染液，摇床上低速转动(80～100rpm)30分钟。将外植体取出，用灭菌滤纸吸掉多余菌液，摆放到步骤5制备的固体共培养基上，暗处共培养3天；
7.芽诱导及抗性植株获得：将步骤6中的外植体转移到恢复培养基(MS大量元素+MS微量元素+铁盐+B5有机+6-BA 1.5-3.0mg L-1+IBA0.2mg L-+Cef 250mg L-1+Ticar 200mg L-1+蔗糖30g L-1+琼脂5.5gL-1，PH 5.8)上培养7天，然后转移到含有5mg/L PPT的芽诱导培养基(成分同恢复培养基)上筛选培养18天，然后将诱导出抗性芽的外植体转移到芽伸长培养基(MS大量元素+MS微量元素+铁盐+B5有机+Cefotaxime 250mg L-1+Ticar 200mg L-1+PPT 3mg L-1+蔗糖30g L-1+琼脂5.5g L-1，PH 5.8)上进行芽伸长。芽长4cm时转移到添加有1mg/L PPT的生根培养基(1/2MS大量元素+MS微量元素+铁盐+B5有机NAA 0.4mg L-1+Cef 250mg L-1+Ticar 200mg L-1+PPT 1mg L-1+蔗糖20g L-1+琼脂5.0g L-1，PH 5.8)中，获得可移栽的转化再生植株。生根植株移栽到花盆中获得转化植株产生的种子。
统计处理组和对照组的抗性植株获得率(生根良好的移栽植株数/处理的外植体总数*100％)。结果见图1：20μmol L-1 AOA处理的113个外植体，获得8个生根良好可移栽的PPT抗性植株，抗性植株获得率为7.1％；对照组处理的119个外植体，获得2个生根良好可移栽的PPT抗性植株株，抗性植株率为1.68％。因此在步骤5固体共培养基中添加20μmol L-1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂α-氨氧基乙酸AOA比对照明显提高了大豆抗性植株的获得率。
实施例2：在固体共培养基中添加30μmol L-1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂α-氨氧基乙酸AOA对大豆遗传转化效率的影响
在实施例1步骤5固体共培养基制备中添加30μmol L-1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂α-氨氧基乙酸AOA代替20μmol L-苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂α-氨氧基乙酸AOA，以不加AOA为对照；其余步骤与实施例1相同。
统计处理组和对照组的抗性植株获得率(生根良好的移栽植株数/处理的外植体总数*100％)。结果见图1：30μmol L-1AOA处理的175个外植体，获得18个生根良好可移栽的PPT抗性植株，抗性植株获得率为10.29％；对照组处理的119个外植体，获得2个生根良好可移栽的PPT抗性植株株，抗性植株率为1.68％。因此在实施例1步骤5固体共培养基中添加30μmol L-1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂α-氨氧基乙酸AOA比对照明显提高了大豆抗性植株的获得率。
实施例3：在固体共培养基中添加50μmol L-1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂α-氨氧基乙酸AOA对大豆遗传转化效率的影响
在实施例1步骤5固体共培养基制备中添加50μmol L-1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂α-氨氧基乙酸AOA代替20μmol L-1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂α-氨氧基乙酸AOA，以不加AOA为对照；其余步骤与实施例1相同。
统计处理组和对照组的抗性植株获得率(生根良好的移栽植株数/处理的外植体总数*100％)。结果见图1：50μmol L-1AOA处理的152个外植体，获得3个生根良好可移栽的PPT抗性植株，抗性植株获得率为1.97％；对照组处理的119个外植体，获得2个生根良好可移栽的PPT抗性植株株，抗性植株率为1.68％。因此在实施例1步骤5固体共培养基中添加50μmo l L-1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂α-氨氧基乙酸AOA比对照明显提高了大豆抗性植株的获得率。
实施例4：在固体共培养集中添加2.39μmol L-1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂放线菌素D对大豆遗传转化效率影响
在实施例1步骤5固体共培养基制备中添加2.39μmo l L-1放线菌素D代替20μmol L-1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂α-氨氧基乙酸AOA，以不加放线菌素D为对照；其余步骤与实施例1相同。
统计处理组和对照组的抗性植株获得率。结果见图2：放线菌素D处理组处理的100个外植体，获得14株生根良好可移栽的植株，抗性植株获得率为14.0％；对照组处理的129个外植体，获得1株生根良好可以移栽的抗性植株，获得率为0.78％。因此在实施例1步骤5固体共培养基中添加2.39μmol L-1放线菌素D苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂比对照明显提高了大豆抗性植株的获得率。
实施例5：在固体共培养基中添加0.01μmol L-1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂K252a对大豆遗传转化效率影响
将实施例1中步骤5固体共培养基中添加0.01μmol L-1K252a代替20μmol L-1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂α-氨氧基乙酸AOA，以不加K252a的处理为对照；其余步骤与实施例1相同。
统计处理组和对照组的抗性植株获得率。结果见图3：0.01μmolL-1K252a处理外植体94个，获得生根良好可移栽的PPT抗性植株株8个，抗性植株获得率为8.51％；对照组处理外植体126个，获得生根良好可移栽的PPT抗性植株2个，抗性植株获得率为1.59％。因此在实施例1步骤5固体共培养基中添加0.01μmol L-1K252a苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂比对照明显提高了大豆抗性植株的获得率。
实施例6：在固体共培养基中添加0.05μmol L-1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂K252a对大豆遗传转化效率影响
将实施例1中步骤5固体共培养基中添加0.05μmol L-1K252a苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂α-氨氧基乙酸AOA；其余步骤与实施例1相同。
统计处理组和对照组的抗性植株获得率。结果见图3：0.05μmolL-1K252a处理外植体138个，获得生根良好可移栽的PPT抗性植株12个，抗性植株获得率为8.7％；对照组处理外植体126个，获得生根良好可移栽的PPT抗性植株2个，抗性植株获得率为1.59％。因此在实施例1步骤5固体共培养基中添加0.05μmol L-1K252a苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂比对照明显提高了大豆抗性植株的获得率。
实施例7：在固体共培养基中添加0.1μmol L-1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂K252a对大豆遗传转化效率影响
将实施例1中步骤5固体共培养基中添加0.1μmol L-1K252a苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂α-氨氧基乙酸AOA；其余步骤与实施例1相同。
统计处理组和对照组的抗性植株获得率。结果见图3：0.1μmol L-1K252a处理外植体112个，获得生根良好可移栽的PPT抗性植株4个，抗性植株获得率为3.57％；对照组处理外植体126个，获得生根良好可移栽的PPT抗性植株2个，抗性植株获得率为1.59％。在实施例1步骤5固体共培养基中添加0.1μmol L-1K252a苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂比对照明显提高了大豆抗性植株的获得率。
实施例8：在固体共培养基中添加0.2μmol L-1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂K252a对大豆遗传转化效率影响
将实施例1中步骤5固体共培养基中添加0.2μmol L-1K252a苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂α-氨氧基乙酸AOA；其余步骤与实施例1相同。
统计处理组和对照组的抗性植株获得率。结果见图3：0.2μmol L-1K252a处理外植体110个，获得生根良好可移栽的PPT抗性植株2个，抗性植株获得率为1.82％；对照组处理外植体126个，获得生根良好可移栽的PPT抗性植株2个，抗性植株获得率为1.59％。因此在实施例1步骤5固体共培养基中添加0.2μmol L-1K252a苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂比对照明显提高了大豆抗性植株的获得率。
本发明列举的实施例旨在更进一步地阐明苯丙氨酸解氨酶PAL活性的抑制剂对降低大豆异黄酮等次生代谢产物对农杆菌侵染的抑制作用，提高大豆农杆菌转化效率具有的显著效果，而不对本发明的范围构成任何限制。
Claims (4)
1.一种利用调节异黄酮生物合成提高大豆遗传转化效率的方法，其特征在于包括如下步骤：
①种子的消毒：取健康饱满大豆种子，放入含有100ml30%次氯酸钠和4ml浓盐酸的密闭容器内，利用反应生成的氯气消毒24～36小时；
②种子的萌发培养：将步骤①中的种子接种到B5萌苗培养基中进行为期5～6天的25℃、16/8h光暗周期的培养；
③外植体制备：将步骤②中的种子在无菌条件下去掉种皮、切掉幼叶和上胚轴，保留0.5～2.0cm的下胚轴，用手术刀片对子叶节部位进行创伤处理；
④固体共培养基的制备：向经过121℃高压灭菌15min后的含有B5大量元素、B5微量元素、6-BA、IBA、MES、蔗糖、琼脂，PH5.4的培养基中，再加入抽滤灭菌的硫代硫酸钠，DTT，半胱氨酸,B5有机成分、乙酰丁香酮AS及苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂，混匀后按30ml/皿分装到φ90mm的灭菌培养皿中；
⑤农杆菌侵染液的制备：将含有外源基因的重组农杆菌悬于含有1/10×B5大量元素、1/10×B5微量元素、1×B5有机成分6-BA1.0mgL-1、IBA0.2mg L-1、MES3.9g L-1、蔗糖30g L-1，乙酰丁香酮AS200μΜ，PH5.4的培养基中，调节菌液浓度到OD600≈0.5，室温静置半小时备用；
⑥农杆菌侵染和共培养：将步骤③中的外植体放入100ml三角瓶中，加入步骤⑤制备的农杆菌侵染液中，摇床上80rpm低速转动30分钟后，取出外植体，用灭菌滤纸吸掉多余菌液，摆放到步骤④中固体共培养培养基上，暗培养3～5天；
⑦芽诱导和抗性植株的获得：将步骤⑥中的外植体转移到恢复培养基上培养7天后，转移到带有筛选压的芽诱导培养基上培养14～21天，然后将诱导出抗性芽的外植体转移到芽伸长培养基上进行芽伸长，芽长4～5cm时转移到生根培养基中，获得转化再生植株移栽到花盆中获得转化的抗性植株；
步骤④中所述固体共培养基的制备为向经过121℃高压灭菌15min后的含有1/10×B5大量元素、1/10×B5微量元素、6-BA1.0mgL-1、IBA0.2mg L-1、MES3.9g L-1、蔗糖30g L-1、琼脂5g L-1，PH5.4的培养基中，再加入抽滤灭菌的硫代硫酸钠158mg L-1，DTT154mg L-1，半胱氨酸1g L-1,1×B5有机成分，AS200μΜ及20～50μmolL-1α-氨氧基乙酸AOA苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂，混匀后按30ml/皿分装到φ90mm的灭菌培养皿中；
或步骤④中所述固体共培养基的制备为向经过121℃高压灭菌15min后的含有1/10×B5大量元素、1/10×B5微量元素、6-BA1.0mgL-1、IBA0.2mg L-1、MES3.9g L-1、蔗糖30g L-1、琼脂5g L-1，PH5.4的培养基中，再加入抽滤灭菌的硫代硫酸钠158mg L-1，DTT154mg L-1，半胱氨酸1g L-1,1×B5有机成分，AS200μΜ及2.39μmol L-1放线菌素D苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂，混匀后按30ml/皿分装到φ90mm的灭菌培养皿中；
或步骤④中所述固体共培养基的制备为向经过121℃高压灭菌15min后的含有1/10×B5大量元素、1/10×B5微量元素、6-BA1.0mgL-1、IBA0.2mg L-1、MES3.9g L-1、蔗糖30g L-1、琼脂5g L-1，PH5.4的培养基中，再加入抽滤灭菌的硫代硫酸钠158mg L-1，DTT154mg L-1，半胱氨酸1g L-1,1×B5有机成分，AS200μΜ及0.01～0.2μmol L-1激酶抑制剂K252a苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂，混匀后按30ml/皿分装到φ90mm的灭菌培养皿中；
步骤⑦所述的恢复培养基是：MS大量元素+MS微量元素+铁盐+B5有机+6-BA1.5-3.0mg L-1+IBA0.2mgL-+Cef250mg L-1+Ticar200mgL-1+蔗糖30g L-1+琼脂5.5g L-1，PH5.8；
步骤⑦所述的芽诱导培养基成分同恢复培养基；
步骤⑦所述的芽伸长培养基是：MS大量元素+MS微量元素+铁盐+B5有机+Cefotaxime250mg L-1+Ticar200mg L-1+PPT3mg L-1+蔗糖30g L-1+琼脂5.5g L-1，PH5.8；
步骤⑦所述的生根培养基是：1/2MS大量元素+MS微量元素+铁盐+B5有机NAA0.4mg L-1+Cef250mg L-1+Ticar200mg L-1+PPT1mg L-1+蔗糖20g L-1+琼脂5.0g L-1，PH5.8。
2.根据权利要求1所述一种利用调节异黄酮生物合成提高大豆遗传转化效率的方法，其特征在于步骤④固体共培养基的制备中所述的苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂为α-氨氧基乙酸AOA、放线菌素D、激酶抑制剂K252a其中的一种。
3.根据权利要求1所述一种利用调节异黄酮生物合成提高大豆遗传转化效率的方法，其特征在于步骤④固体共培养基的制备中所述的苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制剂α-氨氧基乙酸AOA使用浓度为30μmol L-1。
4.根据权利要求1所述一种利用调节异黄酮生物合成提高大豆遗传转化效率的方法，其特征在于步骤⑤农杆菌侵染液的制备中所述的含有外源基因的重组农杆菌是利用热击法将含有PPT抗性基因的质粒PCAMBIA3301导入到根癌农杆菌EHA105所得到的重组农杆菌。
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