CN106978435A - 一种提高大豆的转基因频率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种提高大豆的转基因频率的方法。本发明改进传统的大豆转基因抗性芽的离体生根方法，提出了一种全新的高效离体生根方法——带胚轴生根法，成功获得了大豆转基因植株。本发明的方法可大幅提高大豆遗传转化频率。

Description

一种提高大豆的转基因频率的方法
技术领域
本发明属于生物技术和植物学领域，更具体地，本发明涉及一种提高大豆的转基因频率的方法。
背景技术
大豆(Glycine max(L.)Merrill)起源于中国，是我国重要粮食作物之一，已有五千年栽培历史，现知有1000个栽培品种。大豆含脂肪约20％，蛋白质约40％，还含有丰富的维生素，富含营养，除供直接食用外，可作酱、酱油和各种豆制食品；茎、叶、豆粕及粗豆粉作肥料和优良的牲畜饲料。豆粕经加工制成的组织蛋白、浓缩蛋白、分离蛋白和纤维蛋白等是多种产品，如人造肉、干酪素、味精及造纸、塑胶工业、人造纤维、火药等的原料。豆油除主要供食用外，并为润滑剂、油漆、肥皂、瓷釉、人造橡胶、防腐剂等重要原料。此外药用有滋补养心、祛风明目、清热利水、活血解毒等功效(韦直，1995。中国植物志，北京：科学出版社，234-236)，因此大豆具有重要的研究价值。
1952年，中国大豆总产量为952×104t，人均占有量约25kg，2003年大豆总产量超过1.539×107t，但因人口增加，人均占有量下降到11.8kg。随着国民经济的发展和人民生活水平的提高，加工业、食品业和畜牧业的发展，对大豆的需求急剧增加，大豆供求矛盾日益突出。目前扩大大豆种植的潜力是有限的，而提高单产还有很大的空间和潜力(赵团结，盖钧镒，李海旺，邢邯，邱家驯，2006。超高产大豆育种研究的进展与讨论，中国农业科学，39(1)：29-37)。
目前大多数基因型的大豆都来源于同一祖先，因此常规育种方法对扩大大豆产量的帮助是很有限的，需要通过先进的离体培养技术和基因技术可以为优化大豆种质资源，提高抗病虫害能力提供关键性的技术帮助。
目前，尽管大豆的胚尖和子叶节两个受体系统的再生频率很高，但大豆的转基因频率偏低，一般低于2％。主要原因是：(1)不定芽伸长困难；(2)转基因大豆抗性芽经过长时间筛选压后长势弱化，离体生根能力下降，不定根的长势相对弱化。因此，本领域需要找到合适的手段来进一步提高大豆的转基因频率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高大豆的转基因频率的方法。
在本发明的第一方面，提供一种培育转基因大豆的方法，所述方法包括：
(a)将大豆种子灭菌处理，浸泡使大豆种子吸涨，获得大豆种子的胚尖，进行预培养；
(b)将步骤(a)的胚尖在经活化的农杆菌中浸染；所述的农杆菌携带重组质粒，所述的重组质粒包含有外源基因；
(c)将步骤(b)浸染后的胚尖培养3-6天(较佳地4-5天)后，筛选培养携带外源基因的胚尖；筛选培养，获得带有不定芽的胚尖，该不定芽携带外源基因；抹除部分芽，保留2-3个健壮的不定芽；
(d)步骤(c)的带有不定芽的胚尖培养(较佳地，在MS基础培养基上培养)12-18天(较佳地14-16天，如15天)后，在赤霉素和多效唑溶液中浸泡，再转接到含6-苄氨基腺嘌呤和赤霉素的MS基本培养基中培养，从而不定芽生长，出现主茎；
(e)将步骤(d)的小植株进行生根培养，使不定芽随同胚轴生根；和
(f)将步骤(e)的小植株的一个胚轴上的多个大豆转基因株系移栽到土壤，继续培养，获得转基因大豆植株。
在本发明的一个优选例中，步骤(a)中，所述的灭菌处理包括：分别以酒精、升汞、次氯酸钠进行灭菌。
在本发明的另一优选例中，所述的酒精为70％(v/v)浓度的酒精；所述的升汞是0.1％(v/v)升汞；或所述的次氯酸钠是10％(w/v)次氯酸钠。
在本发明的另一优选例中，酒精灭菌与升汞灭菌之间，还包括以无菌水冲洗，较佳地冲洗5-8次；升汞灭菌与次氯酸钠灭菌之间，还包括以无菌水冲洗，较佳地冲洗5-8次。
在本发明的另一优选例中，所述的预培养的时间为3-5天。
在本发明的另一优选例中，步骤(a)中，浸泡使大豆种子吸涨时，以无菌水浸泡，浸泡温度4±2℃。
在本发明的另一优选例中，步骤(a)中，预培养时，在包含2-5mg.L-16-苄氨基腺嘌呤(较佳地3-4mg.L-16-苄氨基腺嘌呤)的MS基本培养基中培养，培养条件16±2小时/天光照，25±2℃。
在本发明的另一优选例中，步骤(b)中，将农杆菌悬于包含2-5mg.L-16-苄氨基腺嘌呤(较佳地3-4mg.L-16-苄氨基腺嘌呤)和100-300uM(较佳地150-250uM)乙酰丁香酮的MS基本培养基中，将胚尖在其中浸染。
在本发明的另一优选例中，浸染条件为28±2℃摇床，250±50rpm。
在本发明的另一优选例中，浸染时间为30±10分钟，更佳地30±5分钟。
在本发明的另一优选例中，步骤(c)中，所述的浸染后的胚尖培养3-6天包括：在含有2-5mg.L-16-苄氨基腺嘌呤(较佳地3-4mg.L-16-苄氨基腺嘌呤)和100-300uM(较佳地150-250uM)乙酰丁香酮的MS基本培养基中暗培养，培养温度25±2℃。
在本发明的另一优选例中，步骤(c)中，所述的筛选培养包括：将胚尖在含有0.3±0.1mg.L-1赤霉素，200±50mg.L-1替卡西林以及与重组质粒所携带的抗性基因相应的抗生素的MS基本培养基中培养，培养条件16±2小时/天光照，25±2℃。
在本发明的另一优选例中，筛选培养7-10天。
在本发明的另一优选例中，所述的重组质粒含有卡那霉素抗性基因，且所述的与重组质粒所携带的抗性基因相应的抗生素是卡那霉素；较佳地培养基中含有100±30mg.L-1卡那霉素。
在本发明的另一优选例中，步骤(d)中，在5-10mg/L赤霉素和1-3mg/L多效唑溶液中浸泡。
在本发明的另一优选例中，在赤霉素和多效唑中的浸泡时间为10-60分钟；较佳地20-40分钟。
在本发明的另一优选例中，步骤(d)中，在含0.3±0.1mg.L-16-苄氨基腺嘌呤，0.3±0.1mg.L-1赤霉素的MS基本培养基中培养。
在本发明的另一优选例中，步骤(e)中，将小植株进行生根培养包括：将小植株分别在1/8MS基本培养基、1/4MS基本培养基、1/2MS基本培养基中抗性筛选，具有抗性的芽随同胚轴生根。
在本发明的另一优选例中，所述的1/8MS基本培养基包含100±20mg.L-1替卡西林，50±10mg.L-1卡那霉素；较佳地，筛选压减半；较佳地，在该培养基中培养6-10天；较佳地7-9天；或
所述的1/4MS基本培养基包含1±0.2mg.L-1IBA，100±20mg.L-1替卡西林，50±10mg.L-1卡那霉素；较佳地，筛选压减半；或
所述的1/2MS基本培养基包含1±0.2mg.L-1IBA，100±20mg.L-1替卡西林，50±10mg.L-1卡那霉素；较佳地，在该培养基中培养10±2天。
在本发明的另一优选例中，步骤(e)中，培养条件：16±2小时/天光照，25±2℃。
在本发明的另一优选例中，步骤(f)中，所述的土壤是泥炭、珍珠岩和蛭石按照重量比6∶3∶1的土壤。
在本发明的另一优选例中，在步骤(f)之后，还包括：收获转基因大豆植株的种子，得到T0代；较佳地，还进行进一步的传代培养。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、大豆高频转基因植株获得的关键步骤。
A：大豆胚尖长出的抗性芽，bar＝1cm。
B：大豆伸长复壮后的抗性芽，bar＝1cm。
C：大豆生根的转基因植株，bar＝2cm。
D：大豆结荚的转基因植株，两个抗性芽形成两个株系：line 1和line 2，bar＝5cm。
具体实施方式
为了进一步提高大豆转基因频率，本发明人使用根癌农杆菌转化方法，结合不定芽伸长复壮剂的使用，获得大量大豆抗性芽，并改进传统的大豆转基因抗性芽的离体生根方法，提出了一种全新的高效离体生根方法——带胚轴生根法，获得了大量的大豆转基因植株苗并开花结荚。从而，形成了大幅提高大豆遗传转化频率的技术体系。
胚尖的培育
胚尖的培育包括：将大豆种子灭菌处理，浸泡使大豆种子吸涨，获得大豆种子的胚尖，预培养3-5天。
作为本发明的优选方式，所述的灭菌处理包括：分别以酒精、升汞、次氯酸钠进行灭菌。较佳地，所述的酒精为70％(v/v)浓度的酒精；所述的升汞是0.1％(v/v)升汞；所述的次氯酸钠是10％(w/v)次氯酸钠。较佳地，酒精灭菌与升汞灭菌之间，还包括以无菌水冲洗，较佳地冲洗5-8次；升汞灭菌与次氯酸钠灭菌之间，还包括以无菌水冲洗，较佳地冲洗5-8次。
大豆转基因的受体材料通常采用成熟胚。目前为止本领域一般使用的均是氯气消毒法。该法在环境友好性，然而安全性等方面均有待改善和提高。本发明中采用简单易行的复合消毒方法来制备大豆无菌的受体材料，不需要采用化学反应方法发生氯气；消毒效果良好，无菌率达100％；所制备的成熟胚受体材料活力很强，无菌萌发率达100％。
浸泡在水中的步骤可以使大豆种子充分吸涨，获得胚尖。浸泡所用的水一般以无菌水为宜。较佳地，浸泡温度4±2℃。
作为本发明的优选方式，在预培养时，在包含2-5mg.L-16-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、较佳地3-4mg.L-16-BA的MS基本培养基中培养，培养条件16±2小时/天光照，25±2℃。
外源基因的转化
外源基因的转化是制备转基因的必需步骤。可采用本领域常用于大豆转基因的多种转化方法来进行外源基因的转化，较佳地如采用根癌农杆菌转化法，包括：将前述方法获得的胚尖在经活化的农杆菌中浸染；所述的农杆菌携带重组质粒，所述的重组质粒包含有外源基因。本发明的方法对于外源基因没有特别的限制，可以是本领域希望进行大豆转化以观测转基因效果的任何外源基因。
为了实现外源基因的转化，可将外源基因插入到重组表达载体中。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含外源基因的核苷酸序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。所述的核苷酸序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。包含上述的适当外源基因序列的载体，可以用于转化农杆菌，以进行转基因植物的制备。
作为本发明的优选方式，将包含有外源基因的农杆菌悬于包含2-5mg.L-16-BA、较佳地3-4mg.L-16-BA和100-300uM、较佳地150-250uM乙酰丁香酮的MS基本培养基中，将胚尖在其中浸染。更佳地，浸染条件为28±2℃摇床，250±50rpm；浸染时间为30±10分钟，更佳地30±5分钟。
在浸染之后，将胚尖培养3-6天，作为本发明的优选方式，该步骤培养包括：在含有2-5mg.L-16-BA、较佳地3-4mg.L-16-BA和100-300uM、较佳地150-250uM乙酰丁香酮的MS基本培养基中暗培养，培养温度25±2℃。
将胚尖经上述培养3-6天后，筛选培养携带外源基因的胚尖。作为本发明的优选方式，所述的筛选培养包括：将胚尖在含有0.3±0.1mg.L-1赤霉素(GA3)，200±50mg.L-1替卡西林(较佳地还包括100±30mg.L-1卡那霉素)的MS基本培养基中培养，培养条件16±2小时/天光照，25±2℃。
筛选培养的时间可以根据本领域技术人员的经验而定。较佳地，可以筛选培养7-10天；当然可以根据筛选情况选择其它的时间。
经过筛选培养，可以选择出已经转入了外源基因的胚尖，从而应用于后续的步骤。
不定芽的诱导和伸长
筛选培养后，获得了带有抗性芽的胚尖。由于前述的方法优化，胚尖上可以获得较多的不定芽。为了充分保证不定芽的质量，从胚尖上抹除部分小芽，保留2-3个健壮的抗性芽。
大豆遗传转化中，起始受体材料的平均不定芽数是较为关键的指标，直接关系到遗传转化频率的高低。现有技术中常用的大豆胚尖遗传转化系统最早出自本发明人的实验室，然而这个系统尚存在一些问题，主要表现在胚尖平均不定芽数偏少(1-3个/胚尖)，顶芽导致的假阳性率相对偏高。而采用本发明优化的方法先诱导大量的不定芽，再抹除大部分不定芽，既降低了假阳性率，又保证了抗性不定芽的质量。
抗性芽(即该芽携带了外源基因)的伸长包括：将带有抗性芽的胚尖在培养12-18天、较佳地14-16天后，在GA3和多效唑溶液(较佳地，含有5-10mg/L GA3和1-3mg/L多效唑)中浸泡。更佳地，在GA3和多效唑中的浸泡时间为10-60分钟，较佳地20-40分钟)。
经过上述浸泡的带有抗性芽的胚尖再转接到含有6-BA和GA3(较佳地，含有0.3±0.1mg.L-16-BA，0.3±0.1mg.L-1GA3)的MS基本培养基中培养，从而不定芽生长，出现主茎。
大豆转基因抗性芽伸长困难为业界普遍公认的难题。本发明采用GA3和多效唑协同处理的方法，既解决了不定芽伸长的难题，又控制住了不定芽的徒长问题。
带胚轴混合生根和移栽
经过前述培养步骤，带有抗性芽的胚尖已经生长出主茎，之后，将小植株分别在1/8MS基本培养基、1/4MS基本培养基、1/2MS基本培养基中抗性筛选，抗性芽随同胚轴生根。较佳地，该过程中的培养条件为：16±2小时/天光照，25±2℃。
作为本发明的优选方式，所述的1/8MS基本培养基包含100±20mg.L-1替卡西林，50±10mg.L-1卡那霉素；较佳地，筛选压减半；较佳地，在该培养基中培养6-10天。
作为本发明的优选方式，所述的1/4MS基本培养基包含1±0.2mg.L-1IBA，100±20mg.L-1替卡西林，50±10mg.L-1卡那霉素；较佳地，筛选压减半。
作为本发明的优选方式，所述的1/2MS基本培养基包含1±0.2mg.L-1IBA，100±20mg.L-1替卡西林，50±10mg.L-1卡那霉素；较佳地，在该培养基中培养10±2天。
应用本发明所述的抗性芽生根方法，可以使得每个抗性芽得以顺利成苗，进一步提高大豆转基因频率。
生根后，将小植株的一个胚轴上的多个大豆转基因株系移栽到土壤，继续培养，获得转基因大豆植株。对于所应用的土壤没有特别的限制，可以是本领域技术人员了解的适用于大豆发育生长的土壤，优选地，所述的土壤可以是泥炭、珍珠岩和蛭石按照重量比6∶3∶1的土壤。
转基因植株的传代培养
上述步骤可获得转基因大豆植株的种子，即得到T0代；较佳地，还进行进一步的传代培养，获得后代植株。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
基本培养基(Murashige and Skoog，简称MS培养基)的制备
MS基本培养基内含0.5％(w/v)B5有机溶液，3％(w/v)的蔗糖，0.1mg.L-1肌醇，0.7％(w/v)琼脂，调节pH至5.8，121℃灭菌15-25分钟。
重组质粒pCAMBIA2301
在pCAMBIA2301的多克隆位点中插入了GUS基因，并且包含卡那霉素抗性基因以用于抗性筛选，获得重组质粒pCAMBIA2301(LIU H-K,YANG C,WEI Z-M*.EfficientAgrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Soybeans using anembryonic tip regeneration system.Planta,2004,219:1042-1049)。
农杆菌
将重组质粒pCAMBIA2301转化农杆菌，获得带有该重组质粒的农杆菌。
实施例1、大豆转基因1
1、转基因植株的制备
(1)选取粒大、饱满的成熟大豆种子备用，将所得的种子用70％(v/v)酒精做表面消毒，然后将种子倒入无菌三角瓶中用0.1％(v/v)升汞摇洗7分钟，无菌水冲洗6次，再用10％次氯酸钠(NaClO)摇洗5分钟，无菌水冲洗6次后用无菌水浸泡于4℃冰箱。
(2)待到步骤(1)中种子充分吸胀后，在无菌条件下将种子从三角瓶中取出，剥出胚尖，放入MS基本培养基(内含3mg.L-16-BA)中预培养4天。培养条件：16小时/天光照，25±1℃。
(3)制备工程菌(GmSOT)：从YEP培养平板(含卡那霉素(Kanamycin))上挑取含有重组质粒pCAMBIA2301的农杆菌单菌落接种于含有50mg.L-1利福平和50mg.L-1卡那霉素的50mL YEP液体培养基中28℃摇床，250rpm震荡过夜，然后进行第二次活化，4500rpm，4℃离心10分钟，收集菌体，重悬于液体MS基本培养基(内含3mg.L-16-BA，200uM乙酰丁香酮(AS))备用。
(4)取出步骤(2)中预培养后的大豆胚尖在步骤(3)中制备完成的根癌农杆菌工程菌(GmSOT)中浸染30分钟；浸染条件：28℃摇床，250rpm。
(5)无菌条件下将步骤(4)所得浸染后的胚尖取出，置于无菌滤纸上吸干菌液，然后放置于铺有滤纸的MS(含3mg.L-16-BA，200uM AS)基本培养基中(胚尖置于滤纸上)共培养4天；培养条件：暗中，25±1℃。
(6)将步骤(5)所得胚尖用400mg.L-1替卡西林(ticarcilin)无菌溶液抑菌，用无菌滤纸吸干水分后置于MS基本培养基(含0.3mg.L-1GA3，200mg.L-1替卡西林，100mg.L-1卡那霉素)中筛选培养；培养条件：16小时/天光照，25±1℃。
(7)8天后，抹除部分小芽，获得携带了外源基因的抗性胚尖，其带有2-3个生长健壮的抗性芽(图1A)。
(8)15天以后，将步骤(7)所得的抗性芽用不定芽伸长复壮剂(5mg.L-1GA3，3mg.L-1多效唑(MET：multi-effect triazole))浸泡30min，再转接到MS基本培养基(内含0.3mg.L- 16-BA，0.3mg.L-1GA3)中培养，促进不定芽长长、长粗，并出现明显主茎(胚轴)(图1B)。
(9)将步骤(8)中的小植株先置于1/8MS基本培养基(100mg.L-1替卡西林，50mg.L-1卡那霉素)中，筛选压减半(预处理8天，最长不超过10天，否则植株叶片容易褪绿变黄)；培养条件：16小时/天光照，25±1℃。
(10)将步骤(9)中预处理后的小植株置于1/4MS(含1mg.L-1IBA，100mg.L-1替卡西林，50mg.L-1卡那霉素)培养基中生根培养5天，筛选压减半，胚轴下端出现发根迹象；培养条件：16小时/天光照，25±1℃。
(11)将步骤(10)中的小植株转接到1/2MS基本培养基(含1mg.L-1IBA，100mg.L-1替卡西林，50mg.L-1卡那霉素)中培养10天左右，所有的抗性芽随同胚轴生根，平均每个胚轴10-15cm长的根系(图1C)；培养条件：16小时/天光照，25±1℃。
(12)将步骤(11)中已生根的在一个胚轴上的多个大豆转基因株系移栽到土壤(拟南芥种植基质(泥炭6份：珍珠岩3份：蛭石1份)事先121℃灭菌60分钟)；在人工气候室中，约20天后多个转基因植株苗开花结荚(图1D)。
2、转基因植株的检测
将步骤(12)中的来源于同一胚轴的不同转基因株系分别标注为line 1、line 2等(图1D)，取不同株系的幼嫩叶片做GUS染色，再取GUS染色阳性的株系进行PCR检测。GUS、PCR阳性植株进一步进行Southern blot检测。
保留上述三种检测结果为阳性的转基因植株
3、转基因植株的传代
收获转基因植株，保存转基因大豆种子(T0代种子)。
播种T0代种子，苗期(T1代)进行GUS和PCR检测，收获其中阳性株系，并收获T1代种子；播种T1代种子，苗期(T2代)进行GUS和PCR检测，保留其中阳性株系，收获T2代转基因株系中的纯系，并保种。
4、转基因频率的计算
将获得的转基因植株数除以起始外植体数，计算转基因频率。
经统计，采用上述方法，转基因频率可以达到65％；而现有技术中目前的转基因频率约为1-2％。
实施例2、大豆转基因2
(1)选取粒大、饱满的成熟大豆种子备用，将所得的种子用70％酒精做表面消毒，然后将种子倒入无菌三角瓶中用0.1％升汞摇洗8分钟，无菌水冲洗8次，再用10％次氯酸钠(NaClO)摇洗6分钟，无菌水冲洗7次后用无菌水浸泡于4℃冰箱。
(2)待到步骤(1)中种子充分吸胀后，在无菌条件下将种子从三角瓶中取出，剥出胚尖，放入MS基本培养基(内含3mg.L-16-BA)中预培养5天。培养条件：16小时/天光照，25±1℃。
(3)制备工程菌(GmSOT)：从YEP培养平板(含卡那霉素(Kanamycin))上挑取含有重组质粒pCAMBIA2301的农杆菌单菌落接种于含有50mg.L-1利福平和50mg.L-1卡那霉素的50mL YEP液体培养基中28℃摇床，250rpm震荡过夜，然后进行第二次活化，4500rpm，4℃离心10分钟，收集菌体，重悬于液体MS基本培养基(内含3mg.L-16-BA，200uM乙酰丁香酮(AS))备用。
(4)取出步骤(2)中预培养后的大豆胚尖在步骤(3)中制备完成的根癌农杆菌工程菌(GmSOT)中浸染30分钟；浸染条件：28℃摇床，250rpm。
(5)无菌条件下将步骤(4)所得浸染后的胚尖取出，置于无菌滤纸上吸干菌液，然后放置于铺有滤纸的MS(含3mg.L-16-BA，200uM AS)基本培养基中(胚尖置于滤纸上)共培养5天；培养条件：暗中，25±1℃。
(6)将步骤(5)所得胚尖用400mg.L-1替卡西林(ticarcilin)无菌溶液抑菌，用无菌滤纸吸干水分后置于MS(含0.3mg.L-1GA3，200mg.L-1替卡西林，100mg.L-1卡那霉素)基本培养基中筛选培养；培养条件：16小时/天光照，25±1℃。
(7)9天后，抹除部分小芽，获得携带了外源基因的抗性胚尖，其带有2-3个生长健壮的抗性芽(图1A)。
(8)15天以后，将步骤(7)所得的抗性芽用不定芽伸长复壮剂(10mg.L-1GA3，2mg.L-1多效唑)浸泡60min，再转接到MS基本培养基(内含0.3mg.L-16-BA，0.3mg.L-1GA3)中培养，促进不定芽长长、长粗，并出现明显主茎(胚轴)(图1B)。
(9)将步骤(8)中的小植株先置于1/8MS基本培养基(100mg.L-1替卡西林，50mg.L-1卡那霉素)中，筛选压减半(预处理9天，最长不超过10天，否则植株叶片容易褪绿变黄)；培养条件：16小时/天光照，25±1℃。
(10)将步骤(9)中预处理后的小植株置于1/4MS(含1mg.L-1IBA，100mg.L-1替卡西林，50mg.L-1卡那霉素)培养基中生根培养6天，筛选压减半，胚轴下端出现发根迹象；培养条件：16小时/天光照，25±1℃。
(11)将步骤(10)中的小植株转接到1/2MS基本培养基(含1mg.L-1IBA，100mg.L-1替卡西林，50mg.L-1卡那霉素)中培养10天左右，所有的抗性芽随同胚轴生根，平均每个胚轴10-15cm长的根系(图1C)；培养条件：16小时/天光照，25±1℃。
(12)将步骤(11)中已生根的在一个胚轴上的多个大豆转基因株系移栽到土壤(基质：拟南芥种植基质(泥炭6份：珍珠岩3份：蛭石1份)事先121℃灭菌120分钟)；在人工气候室中，约25天后多个转基因植株苗开花结荚(图1D)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (14)

1.一种培育转基因大豆的方法，其特征在于，所述方法包括：
(a)将大豆种子灭菌处理，浸泡使大豆种子吸涨，获得大豆种子的胚尖，进行预培养；
(b)将步骤(a)的胚尖在经活化的农杆菌中浸染；所述的农杆菌携带重组质粒，所述的重组质粒包含有外源基因；
(c)将步骤(b)浸染后的胚尖培养3-6天后，筛选培养携带外源基因的胚尖；筛选培养，获得带有不定芽的胚尖，该不定芽携带外源基因；抹除部分芽，保留2-3个健壮的不定芽；
(d)步骤(c)的带有不定芽的胚尖培养12-18天后，在赤霉素和多效唑溶液中浸泡，再转接到含6-苄氨基腺嘌呤和赤霉素的MS基本培养基中培养，从而不定芽生长，出现主茎；
(e)将步骤(d)的小植株进行生根培养，使不定芽随同胚轴生根；和
(f)将步骤(e)的小植株的一个胚轴上的多个大豆转基因株系移栽到土壤，继续培养，获得转基因大豆植株。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，所述的灭菌处理包括：分别以酒精、升汞、次氯酸钠进行灭菌。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，浸泡使大豆种子吸涨时，以无菌水浸泡，浸泡温度4±2℃。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，预培养时，在包含2-5mg.L-1 6-苄氨基腺嘌呤的MS基本培养基中培养，培养条件16±2小时/天光照，25±2℃。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，将农杆菌悬于包含2-5mg.L-1 6-苄氨基腺嘌呤和100-300uM乙酰丁香酮的MS基本培养基中，将胚尖在其中浸染。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(c)中，所述的浸染后的胚尖培养3-6天包括：在含有2-5mg.L-1 6-苄氨基腺嘌呤和100-300uM乙酰丁香酮的MS基本培养基中暗培养，培养温度25±2℃。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(c)中，所述的筛选培养包括：将胚尖在含有0.3±0.1mg.L-1赤霉素，200±50mg.L-1替卡西林以及与重组质粒所携带的抗性基因相应的抗生素的MS基本培养基中培养，培养条件16±2小时/天光照，25±2℃。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(d)中，在5-10mg/L赤霉素和1-3mg/L多效唑溶液中浸泡。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(d)中，在含0.3±0.1mg.L-1 6-苄氨基腺嘌呤，0.3±0.1mg.L-1赤霉素的MS基本培养基中培养。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(e)中，将小植株进行生根培养包括：将小植株分别在1/8MS基本培养基、1/4MS基本培养基、1/2MS基本培养基中抗性筛选，具有抗性的芽随同胚轴生根。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的1/8MS基本培养基包含100±20mg.L-1替卡西林，50±10mg.L-1卡那霉素；较佳地，筛选压减半；较佳地，在该培养基中培养6-10天；或
所述的1/4MS基本培养基包含1±0.2mg.L-1IBA，100±20mg.L-1替卡西林，50±10mg.L-1卡那霉素；较佳地，筛选压减半；或
所述的1/2MS基本培养基包含1±0.2mg.L-1IBA，100±20mg.L-1替卡西林，50±10mg.L-1卡那霉素；较佳地，在该培养基中培养10±2天。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(e)中，培养条件：16±2小时/天光照，25±2℃。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(f)中，所述的土壤是泥炭、珍珠岩和蛭石按照重量比6∶3∶1的土壤。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(f)之后，还包括：收获转基因大豆植株的种子，得到T0代；较佳地，还进行进一步的传代培养。
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