CN110484545A

CN110484545A - 一种从野生大豆中分离出来的抗花叶病毒GsCAD1基因、编码蛋白及其应用

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Publication number: CN110484545A
Application number: CN201910878213.7A
Authority: CN
Inventors: 姜丽丽; 庞劲松; 寻红卫; 王蒙; 王莹; 于佳淼; 杨向东; 郭东全; 杨静; 牛路; 钱雪艳; 邢国杰; 董英山; 李启云; 刘宝
Original assignee: Jilin Academy of Agricultural Sciences; Northeast Normal University
Current assignee: Jilin Academy of Agricultural Sciences; Northeast Normal University
Priority date: 2019-09-17
Filing date: 2019-09-17
Publication date: 2019-11-22
Anticipated expiration: 2039-09-17
Also published as: CN110484545B

Abstract

本发明公开一种从野生大豆中分离出来的抗花叶病毒GsCAD1基因，其核苷酸序列如SEQNo.1所示，该序列与抗花叶病毒密切相关，本发明还公开了一种GsCAD1基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQNo.2所示，本发明还公开了GsCAD1基因的应用，是将所述GsCAD1基因导入目的植物中，得到对植物花叶病毒病的抗性高于目的植物的转基因植物。本发明提供的GsCAD1基因的过量表达可以显著提高大豆抗花叶病毒病的水平，提供了一种长久有效的防治大豆花叶病毒病的手段，保证了大豆的产量和种植户的经济效益。

Description

一种从野生大豆中分离出来的抗花叶病毒GsCAD1基因、编码蛋白及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种从野生大豆中分离出来的抗花叶病毒核苷酸序列。

背景技术

大豆花叶病毒(Soybean Mosaic Virus，SMV)病是严重影响我国大豆产量和种子品质并在我国主要大豆产区经常发生的重要病害之一,严重影响我国大豆的产量，在自然条件下每年可导致我国大豆8-50％的产量损失。SMV的体外保毒期在环境为室温、4℃和0℃以下分别为4-5天、15天和120天左右。SMV的致死温度为58-66℃，稀释限点为10-5。SMV可以通过种子在上下代和不同地域之间传播，在田间又可通过汁液摩擦接种及蚜虫进行非持久性传播。

SMV是单链正义的RNA病毒并且其基因组只含有一个大的开放阅读框，能够利用寄主体内的翻译系统剪切成11个成熟蛋白。SMV属于马铃薯Y病毒属，其主要通过蚜虫带病毒吸食大豆枝叶进行传播，另外染病的大豆植株也能经过病毒的种子进行下一代传播。大豆花叶病毒病能引起感病大豆植株叶片出现花叶、皱缩等大豆花叶病毒病常见叶片症状，进而会影响植株也叶片的叶绿素含量从而影响植物的光合作用导致植株生长发育受到影响，而且感病的大豆植株还能引起大豆种子在种皮上产生斑驳的病斑，从而对大豆的产量和种子品质都会产生很大影响，因此，培育抗大豆花叶病毒病的大豆新品种能够提高我国大豆的产量。人们在生产上防治大豆花叶病毒病主要是通过种植抗病大豆品种的方法进行防治，但是由于侵染大豆植株的大豆花叶病毒生理小种的多样性以及不同大豆花叶病毒生理小种之间通过重组从而快速进化出新的病毒小种，导致原先的抗病植株抗性丢失。

发明内容

为了解决上述存在的技术问题，本发明提供一种从野生大豆中分离出来的抗花叶病毒核苷酸序列。

本发明是通过以下技术方案实现的。

一种从野生大豆中分离出来的抗花叶病毒GsCAD1基因，其核苷酸序列如SEQNo.1所示，该序列与抗花叶病毒密切相关。

本发明还提供一种GsCAD1基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQNo.2所示。

本发明还提供一种GsCAD1基因的应用，是将所述GsCAD1基因导入目的植物中，得到对植物花叶病毒病的抗性高于目的植物的转基因植物。

进一步地，所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。

本发明还提供一种GsCAD1基因培育转基因植物的方法，其特征在于，包括以下操作步骤：

(1)重组质粒的构建

a)提取野生大豆BYO-5的RNA，利用反转录试剂盒获得野生大豆BYO-5的cDNA；

b)利用引物F1:CTCTAGAATGGCAGCACAAGCTGAA,引物R1：CGGATCCAATTTCAGTGTGTTTCCA，以野生大豆BYO-5的cDNA为模板做PCR；

c)将野生大豆GsCAD1基因克隆出来,并连接到pMD-18T载体；

d)用XbaI和BamHI酶切pTF101.1-35S和连接正确的GsCAD1基因pMD-18T载体质粒，最后利用T4连接酶将酶切过的GsCAD1基因连接到pTF101.1-35S载体的MCS区域，从而构成pTF101.1-35S-GsCAD1质粒；

e)将重组质粒pTF101.1-35S-GsCAD1导入农杆菌EHA101，得到重组农杆菌；

f)将重组农杆菌感染转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

由以上的技术方案可知，本发明的有益效果是：

本发明提供的GsCAD1基因的过量表达可以显著提高大豆抗花叶病毒病的水平，提供了一种长久有效的防治大豆花叶病毒病的手段，保证了大豆的产量和种植户的经济效益。

附图说明

图1为转基因植株PCR鉴定结果。

图2是T3代转基因大豆和大豆品种沈农九号接种大豆花叶病毒1号和3号混合株系后的照片。

图3为T3代转基因大豆和大豆品种沈农九号接种大豆花叶病毒1号和3号混合株系后的叶片照片。

图4为qRT-PCR检测转基因植株和野生型植株接种SMV后的病毒的表达水平。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例

一、重组质粒的构建

1、提取野生大豆BYO-5的RNA，利用反转录试剂盒(AT311-03)获得野生大豆BYO-5的cDNA。

2、利用引物F1:CTCTAGAATGGCAGCACAAGCTGAA(下划线标注的为酶切位点XbaI),引物R1：CGGATCCAATTTCAGTGTGTTTCCA(下划线标注的为酶切位点BamHI)，以野生大豆BYO-5的cDNA为模板做PCR，反应体系如下表1，PCR扩增程序如下表2

表1扩增体系

表2 PCR扩增程序

将50uLPCR产物于1.0％琼脂糖凝胶电泳上检测并回收大小1080左右的PCR片段。

3、将野生大豆GSCAD1基因克隆出来,并连接到pMD-18T载体(反应体系如下表3)

表3连接pMD18-T载体的反应体系

在PCR管中加入连接体系后，瞬间离心，放入PCR仪中16℃连接过夜。

4、用XbaI和BamHI酶切pTF101.1-35S和连接正确的CAD1基因pMD-18T载体质粒，最后利用T4连接酶将酶切过的GSCAD1基因连接到pTF101.1-35S载体的MCS区域，从而构成pTF101.1-35S-GsCAD1质粒。

二、转基因植物的获得

1、将重组质粒pTF101.1-35S-GsCAD1导入农杆菌EHA101，得到重组农杆菌。

2、用CCM液体培养基悬浮重组农杆菌，得到OD₆₀₀nm＝0.8～1.0的菌悬液。

3、取大豆品种沈农九号的种子，在含有氯气的密闭容器中灭菌12-16个小时。

4、完成步骤3后，取种子，种脐朝下置于GM培养基平板上，23℃暗培养24小时。

5、完成步骤4后，取种子，用无菌解剖刀沿种脐切开，并去掉腋芽，在腋芽上方凹槽处平行于中轴划3～4个切口，然后置于步骤2得到的菌悬液中浸泡30～40分钟。

6、完成步骤5后，将种子移至铺有无菌滤纸的CCM培养基平板上，23℃暗培养4～5天。

7、完成步骤6后，将种子转移至SIM培养基平板上，25℃、16h(光)/8h(暗)培养，每2～3周继代1次,共继代培养2次。

8、完成步骤7后，将诱导出丛生芽的外植体上的子叶切去，置于SEM培养基平板上，25℃、16h(光)/8h(暗)培养，每2～3周继代1次，共继代培养3～5次,继代时去掉褐化的愈伤组织。

9、完成步骤8后，当再生芽生长至4～8cm时，将再生芽切下后转移至RM培养基平板上，25℃、16h(光)/8h(暗)培养。

10、完成步骤9后，当再生植株长出2条以上的根，移至炼苗室驯化3～5天，然后转移至温室中生长，得到T0代植株。

11、T0代植株单株自交，获得T1代植株。

12、将T0代植株和T1代植株分别进行PCR鉴定，方法如下：提取转基因材料和野生型才的基因组DNA，分别将其基因组DNA作为模板，采用F2和R2组成的引物对进行PCR扩增，如果得到约1.6kb的扩增产物，鉴定结果为阳性。

F2：5’-ACCTAACAGAACTCGCCGTAAAGAC-3’；

R2：5’-AACTTTATTGCCAAATGTTTGAACG-3’。

13、T1代植株单株自交，获得T2代植株，T2代自交获得T3代。

14、取T3代植株，按照步骤12的方法进行PCR鉴定。

对于某一T1代植株来说，如果该植株与其T2代植株均为鉴定阳性，该T1代植株为纯合的转基因植株，该植株及其自交后代为转基因株系。

两个转基因株系(35S-GsCAD1-1和35S-GsCAD1-2)的T3代植株进行PCR鉴定的部分结果见图1(WT代表野生型植株)。

三、转基因植物的抗病性鉴定

分别将两个转基因株系(35S-GsCAD1-1和35S-GsCAD1-2)的T2代和T3代植株，大豆品种沈农九号，进行大豆花叶病毒抗性鉴定，每个株系对10株T2代以及20株T3代植株进行鉴定，方法如下：

在大豆苗期(第一片复叶展开)，采用田间人工摩擦接种的方法接种大豆花叶病毒强毒1号和3号混合株系，于开花前后进行抗性调查，大豆抗花叶病毒病鉴定植株病情级别划分标准见表4，大豆抗花叶病毒病抗性评价标准见表5，抗性调查的结果见表6。T3代转基因大豆和大豆品种沈农九号接种大豆花叶病毒1号和3号混合株系后的照片见图2,叶片照片见图3。

表4大豆抗花叶病毒病鉴定植株病情级别划分

表5大豆抗花叶病毒病抗性评价标准

病情指数	抗性评价
		0	免疫(IM)
0.1～20.0	高抗(HR)
		20.1～35.0	中抗(MR)
35.1～50.0	中感(MS)
		50.1～70.0	感(S)
70.1～100.0	高感(HS)

表6抗性调查的结果

结果表明：转基因大豆株系35S-GsCAD1-1和35S-GsCAD1-2对大豆花叶病毒表现出较强的抗性，其中株系35S-GsCAD1-1的两个世代在抗性调查中均表现为免疫(病情指数为0)，表明其抗性性状能够稳定遗传。由图4可知GsCAD1基因的过量表达可以显著提高大豆抗花叶病毒病的水平。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

序列表

<110>东北师范大学-吉林省农业科学院

<120>一种从野生大豆中分离出来的抗花叶病毒GsCAD1基因、编码蛋白及其应用

<130>1

<160>2

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>1080

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

ATGGCAGCACAAGCTGAAATTGAGCATCCTAGGAAGGCATTCGGATGGGCAGCTAGGGAT 60

TCTTCCGGTCTTCTCTCCCCTTTCAATTTCTGCAGAAGGGAACCCGGTGAGAAAGATGTG 120

GCATTCAGAGTGTTGTACTGTGGGATATGCCACTCGGACCTCCACAGCATAAAGAACGAA 180

TGGGGTACTTCCATCTATCCAATGGTTCCTGGGCATGAGGTAGCTGGTGTAGTAACAGAG 240

GTGGGAAGCAAAGTAGAGAAGTTCAAAGTTGGGGACAAGGTTGGTGTGGGATGCCTGGTT 300

GATTCCTGCCGCACCTGCCAAAACTGTTGTGACAATCTTGAGAATTATTGTCCTCAATCT 360

ACGTTCACATATGGTGCCAAATATAGAGATGGCACCATCACATATGGAGGCTACTCTGAC 420

TCAATGGTTGCTGAAGAGCATTTTGTGGTTCGCATTCCAGATAGATTACCACTTGATGCT 480

GCTGCACCTCTTCTTTGTGCTGGCATCACTGTGTATAGCCCTCTCAGATATTATGGACTT 540

GACAAGCCTGGTCTGCATGTGGGTGTGGTTGGTCTTGGTGGACTAGGCCATATGGCTGTC 600

AAGTTTGCCAAAGCTTTTGGTGCTAAGGTCACAGTAATAAGTACTTCACCAAACAAAAAG 660

GAAGAAGCAATACAAAATCTTGGAGCTGATTCCTTTCTAATAAGCCGGGACCAAGATCAG 720

ATGCAGGCTGCAATGGGTACTTTGGATGGTATTATTGACACAGTTTCTGCCGTTCATCCT 780

CTCTTACCTCTCATTGGTTTGCTCAAGTCTCATGGAAAGCTTGTAATGGTTGGTGCACCG 840

GAGAAGCCTCTGGAACTGCCTGTTTTTCCTTTACTTGCGGGGAGAAAGATAGTTGCTGGC 900

ACTCTGATTGGAGGGCTAATGGAGACGCAAGAAATGATTGATTTTGCAGCGAAACACAAT 960

GTGAAACCTGACATTGAAGTCATTCCTATGGACTATGTCAACACAGCAATGGAGCGCCTC 1020

CTTAAAGCAGATGTTAAATATCGATTTGTTATTGATATTGGAAACACACTGAAATTCTGA 1080

<210>2

<211>359

<212>PRT

<213>人工合成

<400>2

Met Ala Ala Gln Ala Glu Ile Glu His Pro Arg Lys Ala Phe Gly Trp

Ala Ala Arg Asp Ser Ser Gly Leu Leu Ser Pro Phe Asn Phe Cys Arg

Arg Glu Pro Gly Glu Lys Asp Val Ala Phe Arg Val Leu Tyr Cys Gly

Ile Cys His Ser Asp Leu His Ser Ile Lys Asn Glu Trp Gly Thr Ser

Ile Tyr Pro Met Val Pro Gly His Glu Val Ala Gly Val Val Thr Glu

Val Gly Ser Lys Val Glu Lys Phe Lys Val Gly Asp Lys Val Gly Val

Gly Cys Leu Val Asp Ser Cys Arg Thr Cys Gln Asn Cys Cys Asp Asn

Leu Glu Asn Tyr Cys Pro Gln Ser Thr Phe Thr Tyr Gly Ala Lys Tyr

Arg Asp Gly Thr Ile Thr Tyr Gly Gly Tyr Ser Asp Ser Met Val Ala

Glu Glu His Phe Val Val Arg Ile Pro Asp Arg Leu Pro Leu Asp Ala

Ala Ala Pro Leu Leu Cys Ala Gly Ile Thr Val Tyr Ser Pro Leu Arg

Tyr Tyr Gly Leu Asp Lys Pro Gly Leu His Val Gly Val Val Gly Leu

Gly Gly Leu Gly His Met Ala Val Lys Phe Ala Lys Ala Phe Gly Ala

Lys Val Thr Val Ile Ser Thr Ser Pro Asn Lys Lys Glu Glu Ala Ile

Gln Asn Leu Gly Ala Asp Ser Phe Leu Ile Ser Arg Asp Gln Asp Gln

Met Gln Ala Ala Met Gly Thr Leu Asp Gly Ile Ile Asp Thr Val Ser

Ala Val His Pro Leu Leu Pro Leu Ile Gly Leu Leu Lys Ser His Gly

Lys Leu Val Met Val Gly Ala Pro Glu Lys Pro Leu Glu Leu Pro Val

Phe Pro Leu Leu Ala Gly Arg Lys Ile Val Ala Gly Thr Leu Ile Gly

Gly Leu Met Glu Thr Gln Glu Met Ile Asp Phe Ala Ala Lys His Asn

Val Lys Pro Asp Ile Glu Val Ile Pro Met Asp Tyr Val Asn Thr Ala

Met Glu Arg Leu Leu Lys Ala Asp Val Lys Tyr Arg Phe Val Ile Asp

Ile Gly Asn Thr Leu Lys Phe

Claims

1.一种从野生大豆中分离出来的抗花叶病毒GsCAD1基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQNo.1所示，该序列与抗花叶病毒密切相关。

2.一种如权利要求1所述的GsCAD1基因编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQNo.2所示。

3.一种如权利要求1所述的GsCAD1基因的应用，其特征在于，将所述GsCAD1基因导入目的植物中，得到对植物花叶病毒病的抗性高于目的植物的转基因植物。

4.根据权利要求3所述的GsCAD1基因的应用，其特征在于，所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。

5.一种如权利要求1所述的GsCAD1基因培育转基因植物的方法，其特征在于，包括以下操作步骤：

(1)重组质粒的构建

c)将野生大豆GsCAD1基因克隆出来,并连接到pMD-18T载体；