CN107475210A - 一种水稻白叶枯病抗性相关基因OsABA2及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种水稻白叶枯病抗性相关基因OsABA2，该基因由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成。本发明还公开了一种水稻类病斑基因，该类病斑基因能显著提高水稻对白叶枯病的抗性水平，通过对OsABA2基因进行基因编辑可获得类病斑突变体。本发明发现了OsABA2基因的新功能，通过基因编辑敲除OsABA2基因后获得的类病斑突变体，可用于水稻白叶枯病抗性育种；同时，该类病斑性状受单隐性核基因控制，转基因或杂交育种后代鉴定和选择比较简单；此外，该类病斑基因来源于籼稻，对籼稻的白叶枯病抗病育种能起到极大促进作用。

Description

一种水稻白叶枯病抗性相关基因OsABA2及其应用
技术领域
本发明属于水稻基因工程领域，具体涉及一种水稻白叶枯病抗性相关基因OsABA2，还涉及该基因在调控水稻白叶枯病抗性上的用途。
背景技术
水稻白叶枯病是由黄单胞杆菌水稻致病变种-白叶枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae)引起的一种细菌性病害。其主要症状为叶尖及边缘初生黄绿色斑点，后沿叶脉发展成苍白色、黄褐色长条斑，最后变灰白色而枯死。该病可使水稻减产20％～30％，严重的可减产50％～60％，甚至颗粒无收，属于水稻三大病害之一。一般籼稻重于粳糯稻，晚稻重于早稻，因此，水稻白叶枯病是水稻生产中亟待解决的问题。
选育抗病品种是控制水稻白叶枯病害最经济有效的方法，但是由于对水稻白叶枯病的致病机理尚不清楚，以及水稻白叶枯病抗源材料少，致使选育抗白叶枯病品种比较困难。近年研究发现，植物类病斑能增强对水稻白叶枯病抗性，所谓的植物类病斑是指在正常的生长环境下，没有受到明显的虫害、逆境胁迫、机械损伤或病原物等侵害时，叶片上自发产生的坏死斑。在表型上，其斑点与植物受到病原菌侵害时产生的真正的病斑类似，因此，称为类病斑。类病斑的发现为水稻抗白叶枯病的育种提供了一种新的途径，并且不受白叶枯病菌生理小种的限制。目前发现的能增强水稻白叶枯病抗性的类病斑的相关基因主要有：A344(CN106243208A)，OsPAD4(CN104745549A)、OsAT1(Mori等.Plant MolecularBiology，2007，63(6)：847-860)、SPL28(Yongli Qiao等.New Phytologist.(2010)185：258-274)、Pti1a(Takahashi等.THE PLANT CELL ONLINE，2007.19(9)：2940-2951)、OsEDR1(Kim等.Biochemical&Biophysical Research Communications，2003，300(4)：868-876)、LMR(Rym Fekih等.Mol Genet Genomics(2015)290：611–622)、NH1(Chern等.MolecularPlant-Microbe Interactions，2005.18(6)：511-520)、OsSSI2(Jiang C J等.Molecularplant-microbe interactions：MPMI，2009，22(7)：820-829)、SPL33(Wang S等.Journal ofExperimental Botany,2017,68(5)：899-913)、OsCUL3a(Liu Q等.Plant Cell，2017，29(2)：345-359)等。目前所报道的类病斑基因大多来自粳稻，它们在籼稻上的应用价值有限。因此，挖掘籼稻背景的类病斑基因对于籼稻抗病育种具有十分重要的意义。
OsABA2基因编码黄质醛脱氢酶，该酶催化黄质醛转化为脱落醛，在脱落酸生物合成过程中发挥重要作用(Endo等.Journal of Plant Physiology，2014.171(14)：1231-1240)。
经检索，未发现OsABA2基因在调控类病斑和增强水稻白叶枯病抗性方面的报道。
发明内容：
本发明人从所构建的以籼稻品种宜香1B为遗传背景的EMS(甲基磺酸乙酯)诱变库中筛选得到一个水稻类病斑突变体，命名为lmm9150(lesion mimic mutant 9150)。通过遗传分析发现该类病斑性状由单隐性核基因控制。进一步研究后发现，该基因突变体能显著增强水稻白叶枯病抗性，而且该基因突变对主要产量性状没有影响。本发明是在上述意外发现的基础上完成的。
本发明目的在于提供一种水稻白叶枯病抗性相关蛋白。
本发明另一目的在于提供编码上述蛋白的基因。
本发明第三目的在于提供上述蛋白在提高水稻白叶枯病抗性上的用途。
本发明第四目的在于提供上述基因在提高水稻白叶枯病抗性上的用途
本发明第五目的在于提供一种水稻类病斑基因。
本发明第六目的在于提供上述类病斑基因在提高水稻白叶枯病抗性上的用途。
本发明第七目的在于提供用于敲除上述基因的靶标序列。
本发明第八目的在于提供用于敲除上述基因的sgRNA。
本发明第九目的在于提供通过敲除上述基因培育抗水稻白叶枯病的水稻品种的方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种水稻白叶枯病抗性相关蛋白，命名为OsABA2，所述的蛋白由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成。
本发明还提供了编码上述蛋白的基因，命名为OsABA2，所述的基因由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成。
上述蛋白在提高水稻白叶枯病抗性上的应用。
上述基因在提高水稻白叶枯病抗性上的应用。
本发明还提供了一种水稻类病斑基因，所述的水稻类病斑基因通过对上述基因进行基因编辑获得；所述的基因编辑是通过CRISPR/CAS9系统进行的。
上述水稻类病斑基因，其用于进行基因编辑的靶标序列由SEQ ID No.9所示的核苷酸序列组成。
上述水稻类病斑基因，所述的水稻类病斑基因由SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示的核苷酸序列组成。
上述水稻类病斑基因，所述的水稻类病斑基因优选为由SEQ ID No.8所示的核苷酸序列组成。
上述水稻类病斑基因由单隐性基因控制。
上述水稻类病斑基因在提高水稻白叶枯病抗性上的应用。
用于敲除上述基因的靶标序列，由SEQ ID No.9所示的核苷酸序列组成；其中所述的基因由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成。
用于敲除上述基因的sgRNA，其靶标序列由SEQ ID No.9所示的核苷酸序列组成；其中所述的基因由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成。
上述靶标序列在提高水稻白叶枯病抗性上的应用。
上述sgRNA在提高水稻白叶枯病抗性上的应用。
通过敲除上述基因培育抗白叶枯病的水稻品种的方法，包括合成上述靶标序列，构建含有所述靶标序列的CRISPR/CAS9系统表达载体；将该表达载体转化到水稻品种中，选择OsABA2基因被敲除的转基因株系，即为抗水稻白叶枯病的品种。
一种培育抗白叶枯病的水稻品种的方法，包括以上述方法培育的品种为非轮回亲本，以农艺性状优良的品种为轮回亲本回交，回交后代通过分子标记进行辅助选择，选择带有上述类病斑基因、且农艺性状倾向于轮回亲本的材料，连续回交4-7代，最后自交1代，选择类病斑性状不分离的株系，即为抗白叶枯病的水稻品种。
上述方法中所述的品种可以是保持系或恢复系等。
一种抗白叶枯病的水稻杂交种的育种方法，包括以上述抗白叶枯病的品种为亲本，组配杂交种，即得抗白叶枯病的水稻杂交种。
本发明具有的优点或有益效果：(1)本发明以所发现的OsABA2基因的新功能为基础，开辟了应用OsABA2基因的新途径；(2)本发明通过基因编辑敲除OsABA2基因后获得产生的类病斑基因，能显著增强水稻白叶枯病抗性，可用于水稻白叶枯病抗性育种；(3)本发明涉及的类病斑突变体和克隆的类病斑基因均来源于籼稻，可用于提高籼稻的抗白叶枯病，为籼稻的抗白叶枯病育种提供了一个新的途径；(4)本发明类病斑基因由单隐性核基因控制，在转基因或杂交育种后代的鉴定和选择中比较简单，便于应用。
附图说明
图1为野生型宜香1B和突变体lmm9150成熟期植株对比照片；其中1为宜香1B，2为lmm9150。
图2为野生型宜香1B和突变体lmm9150苗期叶片对比照片；其中1、2、3和4分别为宜香1B从上往下数的第1片叶，第2片叶，第3片叶和第4片叶；5、6、7和8分别为lmm9150从上往下数的第1片叶，第2片叶，第3片叶和第4片叶。
图3为野生型宜香1B和突变体lmm9150分蘖期叶片对比照片；其中1、2、3和4分别为宜香1B从上往下数的第1片叶，第2片叶，第3片叶和第4片叶；5、6、7和8分别为lmm9150从上往下数的第1片叶，第2片叶，第3片叶和第4片叶。
图4为野生型宜香1B和突变体lmm9150成熟期叶片对比照片；其中1、2、3和4分别为宜香1B从上往下数的第1片叶，第2片叶，第3片叶和第4片叶；5、6、7和8分别为lmm9150从上往下数的第1片叶，第2片叶，第3片叶和第4片叶。
图5为野生型宜香1B和突变体lmm9150分蘖末期接种水稻白叶枯病菌8248生理小种后的抗性比较照片；其中1为IR24,2为IRBB21,3为宜香1B,4为lmm9150。
图6为野生型宜香1B和突变体lmm9150分蘖末期接种水稻白叶枯病菌P3生理小种后的抗性比较照片；其中1为IR24，2为IRBB21，3为宜香1B，4为lmm9150。
图7为野生型宜香1B和突变体lmm9150分蘖末期接种水稻白叶枯病菌Xoo4生理小种后的抗性对比照片。图中1为IR24，2为IRBB21，3为宜香1B，4为lmm9150。
图8为野生型宜香1B和突变体lmm9150分蘖末期接种水稻白叶枯病菌P6生理小种后的抗性对比照片；其中1为IR24，2为IRBB21，3为宜香1B，4为lmm9150。
图9为野生型宜香1B和突变体lmm9150植株高度柱形图；其中1为野生型宜香1B，2为lmm9150。
图10为野生型宜香1B和突变体lmm9150剑叶长度柱形图；其中1为野生型，2为lmm9150。
图11为野生型宜香1B和突变体lmm9150单株产量柱形图；其中1为宜香1B，2为lmm9150。
图12为野生型宜香1B和突变体lmm9150千粒重柱形图；其中1为宜香1B，2为lmm9150。
图13为野生型宜香1B和突变体lmm9150分蘖数柱形图；其中1为宜香1B，2为lmm9150。
图14为野生型宜香1B和突变体lmm9150结实率柱形图；其中1为宜香1B，2为lmm9150。
图15为在突变体lmm9150与02428(粳稻)杂交构建的F2群体中筛选3号染色体上连锁分子标记的电泳图谱；其中1、3、5、7、9和11为显性池；2、4、6、8、10和12为隐性池；其中1和2使用分子标记是RM7642；3和4使用分子标记是Os3.5.08；5和6使用分子标记是Os3.136.5；7和8使用分子标记是RM16；9和10使用分子标记是RM422；11和12使用分子标记是RM7389。
图16为基因定位中其中一个连锁标记的部分电泳图；其中1是02428带型；2是突变体lmm9150带型；其中3、4、5是显性单株带型；6到24是隐性单株带型，其中泳道6-12、14、16、18-24为隐性单株带型；13、17为双交换带型；15为单交换带型。
图17为候选基因与突变性状共分离分析酶切电泳图谱(部分)；其中1、2、4和5为野生型单株带型，3和6为隐性单株带型。
图18为候选基因与突变性状共分离分析酶切电泳图谱(部分)；其中1、2、5、6为野生型单株带型均能被KpnI酶切；3、4、7为隐性单株带型不能被KpnI酶切。
图19为内切酶KpnI酶切F2群体中隐性单株电泳图谱(部分)；其中1-12均为隐性单株带型。
图20为引物P9150-2扩增后的电泳图谱；其中1为DNA Marker,2为转基因植株。
图21为转CRISPR/CAS9-OsABA2敲除阳性植株T1代叶片类病斑点对比图，其中1为阴性对照；2、3、4、5、6分别是转基因阳性株系CAS9-1、CAS9-2、CAS9-3、CAS9-4和CAS9-5。
图22为野生型宜香1B和转基因敲除株系分蘖期接种水稻白叶枯病菌P3生理小种后的抗性比较照片；其中1为IR24,2为IRBB21,3为宜香1B,4为转基因敲除株系CAS9-2。
图23为野生型宜香1B和转基因敲除株系分蘖期接种水稻白叶枯病菌P6生理小种后的抗性比较照片；其中1为IR24,2为IRBB21,3为宜香1B,4为转基因敲除株系CAS9-2。
图24为野生型宜香1B和转基因敲除株系分蘖期接种水稻白叶枯病菌Xoo4生理小种后的抗性比较照片；其中1为IR24,2为IRBB21,3为宜香1B,4为转基因敲除株系CAS9-2。
图25为野生型宜香1B和敲除转基因株系分蘖期接种水稻白叶枯病菌8248生理小种后的抗性对比照片；其中1为IR24,2为IRBB21,3为宜香1B,4为转基因敲除株系CAS9-2。
具体实施方式
实施例1本发明类病斑突变体lmm9150的表型鉴定与遗传分析
(一)试验材料
(1)类病斑突变体lmm9150，是本发明人从以宜香1B为背景构建的EMS(甲基磺酸乙酯)诱变库中筛选获得的类病斑突变体。该突变体与宜香1B进行多代回交，该类病斑性状遗传稳定。
(2)宜香1B(籼稻)。
lmm9150和宜香1B(见图1)均来自于四川农业大学水稻研究所遗传研究实验室。
(二)试验方法
(1)类病斑突变体lmm9150和宜香1B同时相邻种植在四川农业大学温江校区试验田，苗期，分蘖期和成熟期对类病斑表型进行观察、拍照。
结果(图2)突变体lmm9150从4叶期开始从老叶叶尖出现红褐色点状坏死斑，随着发育的进程类病斑的数量不断增加，并且向叶片下部扩展(图3)，到成熟期坏死斑扩展到剑叶顶端(图4)。
(2)类病斑突变体的遗传分析试验
将类病斑突变体lmm9150和宜香1B均种植在四川农业大学温江校区试验田。将突变体lmm9150与宜香1B进行正反杂交(lmm9150×宜香1B，宜香1B×lmm9150)，构建遗传分离群体，用于统计F1代表型和F2代群体的分离比例。
利用突变体lmm9150与宜香1B正反杂交获得F1代，F1代植株叶片表现正常，和野生型一样没有类病斑的出现。经卡方检验，结果(见表1)F2代中的野生型和类病斑表型的分离比为3:1，符合孟德尔单隐性基因的分离比，说明突变体lmm9150的类病斑性状受单隐性核基因控制。
表1类病斑突变体lmm9150的遗传分析试验结果
杂交组合 正常植株 类病斑植株 总株数 χc 2(3：1) P
宜香1B×lmm9150 484 164 648 0.9 P<0.05
lmm9150×宜香1B 416 142 558 1.0 P<0.05
实施例2本发明类病斑突变体lmm9150对白叶枯病抗性鉴定试验
(一)试验材料
(1)、类病斑突变体lmm9150和宜香1B,白叶枯病感病品种IR24和白叶枯病抗病品种IRBB21均来自于四川农业大学水稻研究所重大病害实验室。
(2)、水稻白叶枯病菌的生理小种：P6,P3,8428和Xoo4均来自四川农业大学水稻研究所重大病害实验室。
(二)试验方法
(1)、水稻白叶枯病菌的培养
取保存于50％甘油中的水稻白叶枯病菌，均匀地涂抹在固体培养基上，28℃倒置暗培养4天，备用。所述的固体培养基配方(200ml)：蔗糖2g，L-谷氨酸钠0.2g。将蔗糖和L-谷氨酸钠混匀后，用NaOH调至PH＝7.0，再加入蛋白胨2g，混合后于灭菌高压锅120℃灭菌20分钟。冷却后倒成平板，4℃储存。
(2)、接种和观察
将lmm9150、宜香1B、IR24和IRBB21同田种植在四川农业大学温江校区试验田。取步骤(1)中培养好的白叶枯病菌用水稀释成吸光度OD600值为0.5的悬浮菌液。选择夏季高温高湿傍晚接种，并保证3小时内不被雨水冲刷，这样利于病菌侵染及发病。待接种材料发育至分蘖盛期的时候采用剪叶法接种，在lmm9150、宜香1B、IR24和IRBB21中分别随机选取10株，每个单株选取3片全展新叶进行接种，15天后测量病斑面积；参照水稻的白叶枯病情分级标准(见表2)进行分级。
表2水稻白叶枯病的病情分级标准
病级 抗性反应 抗性评价
0 病斑面积占叶面积小于<5.0％ 高抗
1 病斑面积占叶面积5.1-12.0％ 抗病
3 病斑面积占叶面积12.1-25.0％ 中抗
5 病斑面积占叶面积25.1-50.0％ 中感
7 病斑面积占叶面积50.1-75.0％ 感病
9 病斑面积占叶面积大于75％ 高感
结果(见图5-图8)与宜香1B的病斑面积相比，本发明类病斑突变体lmm9150受生理小种浸染后的病斑面积均明显减小(见表3)，与抗病品种IRBB21的表现相当，其中对生理小种8248的抗性达到抗病水平，对其他生理小种为中抗水平。
表3突变体lmm9150对水稻白叶枯病菌不同生理小种抗性试验结果
实施例3本发明类病斑突变体lmm9150候选基因的定位试验
(一)试验材料
类病斑突变体lmm9150，野生型宜香1B和02428(粳稻)均来自四川农业大学水稻研究所遗传研究实验室。
(二)试验方法
(1)、将lmm9150与02428杂交构建F2代群体用于遗传定位。将lmm9150与宜香1B回交构建BC1F2代群体用于MutMap测序进行基因精细定位。
(2)、近等基因池构建
将lmm9150与02428杂交得到的F2群体，采用BAS法(bulk segregation analysis)进行基因定位。首先，随机选取10份lmm9150单株叶片和10份02428单株叶片，每10株的叶片等量混合提取DNA建池，得到2个亲本DNA池用于筛选亲本间多态性分子标记。再者，在突变体lmm9150与02428杂交得到的F2群体中选10份具有突变体类病斑表型的单株叶片和10份具有野生型正常表型单株的叶片，每10株的叶片等量混合提取DNA建池，分别得到1个显性混池和1个隐性混池用于突变性状与水稻染色体的连锁分析。最后，在突变体lmm9150与02428杂交得到的F2群体中选择164个具有类病斑表型的单株叶片，采用改进CTAB法分单株提取DNA，用于进行基因定位。
(3)、定位引物和基因定位
先利用平均分布于水稻12条染色体上的512对SSR引物(具体序列详见http://www.gramene.org/bd/markers)进行PCR扩增，通过PCR扩增筛选出在lmm9150与02428基因组之间具有多态性的引物211对；随后用筛选出的211对多态性引物检测显性混池和隐性混池(见图15)，以及lmm9150与02428构建的F2群体中隐性单株，进行基因初步定位；在已初定位的区间内，依据(http://www.gramene.org)网站公布的9311和日本晴DNA序列之间的差异序列，设计Indel引物I403-3和I403-2(见表4)，电泳图谱见图16，继续检测近等基因池和lmm9150与02428构建的F2群体中的30个隐性单株，进行定位。
其中PCR反应体系(20uL)：Taq酶(5U/uL)0.2uL，Primer(10mmol/L)2uL，dNTP(2.5mmol/L)0.3uL，DNA模板(20-100ng/μL)2uL，10×Buffer(25mM)2uL，ddH2O 13.5uL。PCR反应程序：95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min，12℃1min。
将PCR扩增产物在3.0％的琼脂糖凝胶、恒压150-180V条件下电泳1.0-2.0h左右，用凝胶成像系统成像并保存记录。
(4)、连锁图谱的构建
将带型为lmm9150的单株标记为0，带型为杂合的单株记为1，带型为02428的单株记为2，未出带的单株记为3，通过用MAPMARKER3.0软件对F2分离群体中分子标记和突变性状的分离数据进行连锁分析，再将重组值转化为遗传图距(cent Morgan,cM)。
结果发现第3号染色体的长臂端两个SSR标记I403.3和RM3684均与候选基因有连锁关系，遗传距离分别为1.1cM和1.5cM。
(5)、候选基因精细定位和基因预测
利用做图群体F2中的显性单株和隐性单株构建的显性池和隐性池对3号染色体的分子标记进行筛选，首先发现分子标记Os3_130.7和RM7389存在连锁关系。由于这两个标记物理距离很远，所以就从这个两个标记往中间选择标记对F2群体的隐性单株进行连锁关系分析，发现越靠近中部的分子标记交换率逐步减少。同样的方法，分析发现分子标记Os3_135.7、Os.3.142.3、I403-3、I403-2、RM422和RM3684的交换单株分别只有24个，23个,2个，0个，0个，3个；说明候选基因与I403-2和M422共分离，被定位在标记I403-3和RM3684之间。
表4本发明类病斑突变体lmm9150基因定位所用的PCR引物
引物名称 前引物(5’-3’) 后引物(5’-3’) 片段长度
Os3_130.7 GATAACGTGGAGGAGTCGT TGCACTCAAAATTTTCCTCT 112
Os3_135.7 CAGAAGAAATTGTCTCCCC GTTAAACACCTCTCGCAAAC 140
Os.3.142.3 GGTAACACGACGACTCCA GAGGAGCTATCTGAGACACG 130
I403-3 TCTGCTCGTAGCAACAATAA TACATTGTGAAACGGATGAA 158
I403-2 GGCTATGCACAGTACTACGTT GCTACACTTATTTTGGGACG 126
RM422 TTCAACCTGCATCCGCTC CCATCCAAATCAGCAACAGC 160
RM3684 TATTTCACCTTCCTGCCACG GAATGAGGTGGAGGATCGAC 130
RM7389 AGCGACGGATGCATGATC TTGAGCCGGAGGTAGTCTTG 140
为了进一步缩小定位区间，利用lmm9150与宜香1B构建的BC1F2群体中收集的20个类病斑的单株叶片等量混合，和宜香1B分别进行全基因组重测序(测序深度20×)进行MutMap分析。结果在3号染色体定位区间内共分离标记RM422附近发现一个SNP指数为1的SNP,位于注释基因LOC_Os03g59610基因的第二外显子。对lmm9150与宜香1B中的候选基因进行测序，以LOC_Os03g59610为参考序列，利用DNAMAN软件进行比对发现lmm9150在LOC_Os03g59610基因第二外显子发生了由G到A的碱基替换(见SEQ ID No.8)，导致编码的氨基酸序列第110位的天冬氨酸突变成了天冬酰胺，该位点在不同植物中具有很高的保守性。
为了验证突变位点与lmm9150突变性状是否存在共分离关系，以lmm9150与02428构建的F2群体中收集的140个类病斑和40个正常单株为材料，设计dCAPS引物PCR扩增后将产物进行酶切。本试验在突变位点附近引入一个错配的碱基，也就是酶切位点。内切酶是KpnI，由于酶切位点位于野生型序列上,所以40个野生型单株DNA为模板的PCR产物均能被KpnI酶切(见图17和图18)，而140个类病斑单株为模板的PCR产物则不能被KpnI酶切(见图19)，结果说明突变位点与lmm9150突变性状共分离。
设计特异性引物(上游引物5’-GACCTGACGAGACGATGTCC-3’(SEQ ID NO.16)；下游引物5’-GCAACCTTGCTTTCCAACC-3’(SEQ ID NO.17))对候选基因进行了荧光定量分析，以持家基因Ubq5作为内参基因，结果候选基因在突变体中的相对表达量是1.1，而在野生型中的相对表达量是1.7，突变体中的表达量显著低于野生型。
综合上述基因定位、突变位点测序、共分离分析及定量表达，可以认定LOC_Os03g59610(又名OsABA2)就是候选基因(Endo等.Journal of Plant Physiology，2014.171(14)：1231-1240)。同时对突变体中候选基因进行测序，利用DNAMAN软件与LOC_Os03g59610序列进行比对，结果发现本发明中克隆到的OsABA2基因(其核苷酸序列见SEQID No.2，测序由成都擎科生物技术有限公司完成)与已经报道的基因(LOC_Os03g59610)存在1个差异，在第一外显子有9个核苷酸的缺失。这可能是因为籼稻和粳稻背景差异所导致。本发明OsABA2基因源于籼稻，而注释基因LOC_Os03g59610来自于粳稻品种日本晴。
实施例4本发明类病斑突变体lmm9150候选基因的敲除验证试验
(一)试验材料
本试验所用大肠杆菌DH5α和农杆菌EHA105菌株购自于全式金生物技术有限公司。
(二)试验方法
1、CRISPR/CAS9-OsABA2基因敲除载体构建
以野生型宜香1B中OsABA2(LOC_Os03g59610)基因的核苷酸序列为模板，选择合适的区域，设计2个敲除的靶位点，利用BWA(V)H-CAS9载体参照试剂盒(杭州百格生物公司)构建CRISPR/CAS9-OsABA2载体。具体构建流程如下：
(1)、设计用于敲除OsABA2基因的靶标序列：
5’-AGACATCTTGGTCACCTCCA-3’(SEQ ID NO.9)。
然后设计并合成下述接头引物以形成gRNA靶点序列：
F:5’-CAGTGGTCTCAGGCAGACATCTTGGTCACCTCCA-3’(SEQ ID NO.10)，
R:5’-CAGTGGTCTCAAAACTGGAGGTGACCAAGATGTC-3’(SEQ ID NO.11)；
(2)、制备引物二聚体
将步骤(1)合成的引物对加水溶解至10μM，按下列反应体系混合后，在PCR仪95℃加热3分钟，然后以约0.2℃/秒缓慢降至20℃，得引物二聚体。所述的反应体系为：退火Buffer 18ul,gRNA靶点引物各1ul，加ddH2O,补足至20ul。
(3)、将引物二聚体构建至BWA(V)H载体。按下列反应体系在冰上混合各个组分，混匀后20℃反应1小时后转化大肠杆菌备用，获得包含启动子、gRNA等元件的表达载体。所述的反应体系：BWA(V)H载体2ul，Oligo二聚体1ul，酶混合液1ul，加ddH2O,补足至10ul。
2大肠杆菌转化
(1)、从-80℃冰箱中取出一管制备好的大肠杆菌感受态细胞，置于冰上融化；
(2)、每100ng连接产物加入100μL感受态细胞悬浮液，混匀后在冰上放置30min；
(3)、42℃热激30s，迅速取出立即置于冰上2min；
(4)、加入500μL不含抗生素的LB液体培养基，在37℃、200rpm培养1小时，得活化菌液；
(5)、将活化的菌液以5000rpm离心1min，在无菌条件下倒掉大部分上清夜，用移液枪轻轻吸打混匀沉淀，吸取100μL，在超净台上把菌液转移并涂到含有卡那霉素的LB筛选平板上；
(6)、将涂有菌液的LB固体培养基平板正面向上放置10分钟左右，待菌液完全被LB固体培养基吸收后将涂板的培养基倒置，于恒温箱中37℃过夜培养；
(7)、挑取单菌落，利用P9150-1引物对菌液进行PCR检测。所述的P9150-1引物对为：
P9150-1F:5’-GTCTCCGACCTGATGCAGCTCTCGG-3’(SEQ ID NO.12)，
P9150-1R:5’-GTCCGTCAGGACATTGTTGGAG-3’(SEQ ID NO.13)；
其中PCR反应程序：95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min，12℃1min。
(8)、将阳性克隆加入3ml含有卡那霉素(50mg/L)的LB培养液中，在37℃、200rpm下培养约10h，保存菌液并提取质粒。
3、按照OMEGA Plasmid Extraction Kit产品说明书提取大肠杆菌质粒，将提取的质粒DNA收集到干净的离心管中，-20℃保存。
4、质粒序列的测定和序列分析
将阳性克隆质粒送到成都擎科科技股份有限公司进行测序。用DNAMAN软件对测序结果进行序列比对，确证gRNA序列的正确性，将阳性克隆质粒命名为CRISPR/CAS9-OsABA2。
5、农杆菌转化
(1)农杆菌化学转化法
按照一个质粒：50ul感受态细胞从-80℃拿出来时快速放手心化冻；将构建好的CRISPR/CAS9-OsABA2质粒0.4～1ug加入到50ul感受态细胞中，冰上放置30min；液氮中冷冻2min；37℃水浴2min,溶化细胞；立即加入5倍体积的无抗生素LB液体培养基，在28℃、170rpm下摇床培养2～3hr；7000rpm离心2分钟，在100ul LB液体培养基中悬浮细胞；涂在利福平加卡那抗性板，吹干，28℃培养2-3天；用潮霉素分子标记P9150-1引物进行菌液PCR检测，将能扩增出目的条带的阳性农杆菌单克隆，加入甘油作为保护剂，置于-80℃保存备用。
(2)农杆菌浸染法转化水稻
(a)愈伤组织的诱导：先用75％酒精将日本晴种子消毒1分钟，用无菌水漂洗3次，然后用40％的次氯酸钠漂洗30min，再用无菌水冲洗5次，放置于带滤纸的培养皿中滤干，用镊子接种于NMB培养基上，于28℃、光照条件下培养7天。每7天继代一次。继代2～3次后，挑取从种子上生长出的良好愈伤组织，把它们继代于NMB培养基上，于28℃、黑暗条件下培养4天。
(b)农杆菌菌株的活化：将(1)中-80℃保存的30ul农杆菌加入3mL含有利福平和卡那霉素的YEP液体培养基中，于28℃下振荡培养14h；再取其中1mL于含有利福平和卡那霉素的50mLYEP液体培养基中，28℃再振荡培养4h，得活化的农杆菌菌液。
(c)共培养转化：将(b)活化好的菌液在5000rpm下离心收集菌体，用含有100μM/L乙酰丁香酮的AAM液体培养基30mL重悬菌体，将(a)中预先挑好的愈伤组织浸于菌液中20min，吸去多余的菌液，平铺于共培养固体培养基上，28℃暗培养2d。
(d)愈伤脱菌培养与愈伤抗性筛选：将共培养2d后的愈伤组织用无菌水冲洗至水澄清，然后用含头孢霉素(500mg/L)的无菌水振荡30min杀菌，将愈伤组织用无菌滤纸或吸水纸彻底吸干，然后接种于选择培养基上培养3周左右。
(e)转基因植株的分化与生根：将(d)中新长出的抗性愈伤组织接种到分化培养基上，光照培养1～2个月，然后将长出的3cm左右高的幼苗转到生根培养基上进行生根培养，当苗长至约10cm时，取叶片提取DNA，利用扩增目的基因全长DNA的P9150-2引物进行鉴定阳性植株苗，最终获得5株转基因阳性植株。将5个转基因阳性植株分别命名为：CAS9-1、CAS9-2、CAS9-3、CAS9-4和CAS9-5。
(f)将阳性转基因植株室内炼苗2-3天后，移栽于大田。
6、转基因水稻的检测
(1)应用改进的CTAB法提取步骤5中所得的阳性转基因植株的DNA，用P9150-2引物对扩增出转基因植株中的敲除靶基因的全长序列，PCR产物片段大小为2543bp(图20)。所述的P9150-2引物对为：
P9150-2F：5'-CCCAGCCTGAGATTCCGTAT-3'(SEQ ID No.14)，
P9150-2R：5'-TGATTGTCCTTAAGCACCGG-3'(SEQ ID No.15)；
其中PCR反应体系(25uL)：Tap酶(5U/μL)0.5ul，Primer(10mmol/L)2ul，dNTP(2.5mmol/L)0.5ul，DNA(20-100ng/μL)2ul，2×Buffer(25mM)12.5ul，ddH2O 7.5ul。PCR反应程序为：95℃5min；95℃30s，56℃5s，72℃2.5min，30个循环；72℃10min，12℃1min。
(2)PCR产物的回收和测序
按照Omega Gel Extraction Kit产品说明书中回收步骤(1)PCR扩增所得的DNA片段，取2μL胶回收产物置于1％琼脂糖凝胶中进行电泳检测，检测后送成都擎科科技股份有限公司测序。
结果(见图21)5个独立转基因阳性株系叶片均表现为类病斑。与阴性对照对比发现，5个转基因植株在OsABA2基因的CDS编码区分别发生了单碱基A/G/T的插入，缺失或小片段缺失突变(见SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.7；其中CAS9-1在第二外显子缺失一个碱基；CAS9-2在第二外显子插入一个碱基；CAS9-3在第二外显子缺失18个碱基；CAS9-4在第二外显子分别插入和缺失一个碱基；CAS9-5在第二外显子缺失4个碱基)。经OsABA2基因的敲除实验，说明OsABA2基因是控制类病斑表型的基因；也证明OsABA2是控制突变体lmm9150类病斑表型的基因。
7、采用实施例2中所述的方法，对转基因敲除株系CAS9-2和对照品种宜香1B进行了白叶枯病抗性鉴定。
表5敲除OsABA2转基因株系对水稻白叶枯病菌抗性对比试验结果
结果(见图22～图25，表5)发现和突变体lmm9150的抗性鉴定结果相似，与对照相比，敲除OsABA2基因的转基因株系CAS9-2的白叶枯病抗性得到显著增强，说明对OsABA2基因其它CDS编码区(相对突变体lmm9150突变位点而言)进行编辑(包括进行一个或几个添加、替换和缺失)同样可以获得突变体lmm9150相似的白叶枯病抗性；说明OsABA2基因是白叶枯病抗性相关基因，将该基因敲除后可以增强水稻白叶枯病抗性。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川农业大学
<120> 一种水稻白叶枯病抗性相关基因OsABA2及其应用
<130> 2017S1057INH
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 278
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 1
Met Ser Ala Ala Ala Ala Ser Ser Pro Ala Pro Arg Leu Glu Ser Lys
1 5 10 15
Val Ala Leu Val Thr Gly Gly Ala Ser Gly Ile Gly Glu Ala Ile Val
20 25 30
Arg Leu Phe Arg Glu His Gly Ala Lys Val Cys Ile Ala Asp Ile Gln
35 40 45
Asp Glu Ala Gly Gln Lys Leu Arg Asp Ser Leu Gly Gly Asp Gln Asp
50 55 60
Val Leu Phe Val His Cys Asp Val Ser Val Glu Glu Asp Val Ala Arg
65 70 75 80
Ala Val Asp Ala Thr Ala Glu Lys Phe Gly Thr Leu Asp Ile Met Val
85 90 95
Asn Asn Ala Gly Phe Thr Gly Gln Lys Ile Thr Asn Ile Arg Asn Ile
100 105 110
Asp Phe Ser Glu Val Arg Lys Val Ile Asp Ile Asn Leu Val Gly Val
115 120 125
Phe His Gly Met Lys His Ala Ala Arg Ile Met Ile Pro Asn Lys Lys
130 135 140
Gly Ser Ile Ile Ser Leu Gly Ser Val Ser Ser Val Ile Gly Gly Leu
145 150 155 160
Gly Pro His Ser Tyr Thr Ala Thr Lys His Ala Val Val Gly Leu Thr
165 170 175
Lys Asn Val Ala Gly Glu Leu Gly Lys His Gly Ile Arg Val Asn Cys
180 185 190
Val Ser Pro Tyr Ala Val Pro Thr Ala Leu Ser Met Pro Tyr Leu Pro
195 200 205
Gln Gly Glu Arg Lys Asp Asp Ala Leu Lys Asp Phe Phe Ala Phe Val
210 215 220
Gly Gly Glu Ala Asn Leu Lys Gly Val Asp Leu Leu Pro Lys Asp Val
225 230 235 240
Ala Gln Ala Val Leu Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Ala Arg Tyr Ile Ser
245 250 255
Ala Leu Asn Leu Met Val Asp Gly Gly Phe Thr Ser Val Asn His Asn
260 265 270
Leu Arg Ala Phe Glu Asp
275
<210> 2
<211> 834
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 2
atgtccgccg ccgccgcatc ctcccccgct ccccggttgg aaagcaaggt tgcgctggtt 60
accggtggtg cttcaggtat tggtgaagca attgttcgcc tctttagaga gcatggtgca 120
aaggtatgta ttgcagatat ccaagatgaa gcaggtcaga agctccggga ctcccttgga 180
ggtgaccaag atgtcttatt tgtccactgc gatgtttcgg tggaagagga tgtagcccga 240
gcggtcgatg caacagctga aaagtttggt actcttgaca tcatggtcaa caatgctggc 300
tttacaggcc agaaaatcac agatatccga aacatcgact tttctgaagt caggaaggta 360
atcgacatca atttagttgg tgtattccac gggatgaaac acgcagcgcg catcatgatc 420
cccaataaga aggggtccat catctcattg ggaagtgttt ctagtgtcat tggagggttg 480
ggacctcatt catacacagc aaccaagcat gctgtggtgg gtctaaccaa gaatgtagct 540
ggggaattgg ggaagcatgg gatacgcgtg aactgcgtat ctccctatgc agtgcccacg 600
gctctctcca tgccgtatct gccccagggc gagcgcaagg atgatgccct gaaagacttt 660
ttcgcctttg ttggtggtga agcaaacctg aaaggtgtgg atctgctacc taaggatgtt 720
gctcaagcag tgctctactt ggcaagcgat gaagcgaggt acatcagcgc gctcaacctc 780
atggtggatg gtggctttac ctctgtgaat cacaatttga gagcatttga agat 834
<210> 3
<211> 836
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 敲除OsABA2基因的转基因株系
<400> 3
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<211> 837
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 敲除OsABA2基因的转基因株系
<400> 6
atgtccgccg ccgccgcatc ctcccccgct ccccggttgg aaagcaaggt tgcgctggtt 60
accggtggtg cttcaggtat tggtgaagca attgttcgcc tctttagaga gcatggtgca 120
aaggtatgta ttgcagatat ccaagatgaa gcaggtcaga agctccggga ctcccttggg 180
gtgaccaaga tgtcttattt gtccactgcg atgtttcggt ggaagaggat gtagcccgag 240
acggtcgatg caacagctga aaagtttggt actcttgaca tcatggtcaa caatgctggc 300
tttacaggcc agaaaatcac agatatccga aacatcgact tttctgaagt caggaaggta 360
atcgacatca atttagttgg tgtattccac gggatgaaac acgcagcgcg catcatgatc 420
cccaataaga aggggtccat catctcattg ggaagtgttt ctagtgtcat tggagggttg 480
ggacctcatt catacacagc aaccaagcat gctgtggtgg gtctaaccaa gaatgtagct 540
ggggaattgg ggaagcatgg gatacgcgtg aactgcgtat ctccctatgc agtgcccacg 600
gctctctcca tgccgtatct gccccagggc gagcgcaagg atgatgccct gaaagacttt 660
ttcgcctttg ttggtggtga agcaaacctg aaaggtgtgg atctgctacc taaggatgtt 720
gctcaagcag tgctctactt ggcaagcgat gaagcgaggt acatcagcgc gctcaacctc 780
atggtggatg gtggctttac ctctgtgaat cacaatttga gagcatttga agattaa 837
<210> 7
<211> 833
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 敲除OsABA2基因的转基因株系
<400> 7
atgtccgccg ccgccgcatc ctcccccgct ccccggttgg aaagcaaggt tgcgctggtt 60
accggtggtg cttcaggtat tggtgaagca attgttcgcc tctttagaga gcatggtgca 120
aaggtatgta ttgcagatat ccaagatgaa gcaggtcaga agctccggga ctcccttggg 180
accaagatgt cttatttgtc cactgcgatg tttcggtgga agaggatgta gcccgagcgg 240
tcgatgcaac agctgaaaag tttggtactc ttgacatcat ggtcaacaat gctggcttta 300
caggccagaa aatcacagat atccgaaaca tcgacttttc tgaagtcagg aaggtaatcg 360
acatcaattt agttggtgta ttccacggga tgaaacacgc agcgcgcatc atgatcccca 420
ataagaaggg gtccatcatc tcattgggaa gtgtttctag tgtcattgga gggttgggac 480
ctcattcata cacagcaacc aagcatgctg tggtgggtct aaccaagaat gtagctgggg 540
aattggggaa gcatgggata cgcgtgaact gcgtatctcc ctatgcagtg cccacggctc 600
tctccatgcc gtatctgccc cagggcgagc gcaaggatga tgccctgaaa gactttttcg 660
cctttgttgg tggtgaagca aacctgaaag gtgtggatct gctacctaag gatgttgctc 720
aagcagtgct ctacttggca agcgatgaag cgaggtacat cagcgcgctc aacctcatgg 780
tggatggtgg ctttacctct gtgaatcaca atttgagagc atttgaagat taa 833
<210> 8
<211> 837
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 突变体lmm9150的OsABA2基因序列
<400> 8
atgtccgccg ccgccgcatc ctcccccgct ccccggttgg aaagcaaggt tgcgctggtt 60
accggtggtg cttcaggtat tggtgaagca attgttcgcc tctttagaga gcatggtgca 120
aaggtatgta ttgcagatat ccaagatgaa gcaggtcaga agctccggga ctcccttgga 180
ggtgaccaag atgtcttatt tgtccactgc gatgtttcgg tggaagagga tgtagcccga 240
gcggtcgatg caacagctga aaagtttggt actcttgaca tcatggtcaa caatgctggc 300
tttacaggcc agaaaatcac aaatatccga aacatcgact tttctgaagt caggaaggta 360
atcgacatca atttagttgg tgtattccac gggatgaaac acgcagcgcg catcatgatc 420
cccaataaga aggggtccat catctcattg ggaagtgttt ctagtgtcat tggagggttg 480
ggacctcatt catacacagc aaccaagcat gctgtggtgg gtctaaccaa gaatgtagct 540
ggggaattgg ggaagcatgg gatacgcgtg aactgcgtat ctccctatgc agtgcccacg 600
gctctctcca tgccgtatct gccccagggc gagcgcaagg atgatgccct gaaagacttt 660
ttcgcctttg ttggtggtga agcaaacctg aaaggtgtgg atctgctacc taaggatgtt 720
gctcaagcag tgctctactt ggcaagcgat gaagcgaggt acatcagcgc gctcaacctc 780
atggtggatg gtggctttac ctctgtgaat cacaatttga gagcatttga agattaa 837
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于敲除OsABA2的靶标序列
<400> 9
agacatcttg gtcacctcca 20
<210> 10
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于形成gRNA的寡聚核苷酸
<400> 10
cagtggtctc aggcagacat cttggtcacc tcca 34
<210> 11
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于形成gRNA的寡聚核苷酸
<400> 11
cagtggtctc aaaactggag gtgaccaaga tgtc 34
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于检测gRNA的上游引物
<400> 12
gtctccgacc tgatgcagct ctcgg 25
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于检测gRNA的下游引物
<400> 13
gtccgtcagg acattgttgg ag 22
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于扩增敲除靶基因后的全长基因序列的上游引物
<400> 14
cccagcctga gattccgtat 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于扩增敲除靶基因后的全长基因序列的下游引物
<400> 15
tgattgtcct taagcaccgg 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于候选基因定量检测的上游引物
<400> 16
gacctgacga gacgatgtcc 20
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于候选基因定量检测的下游引物
<400> 17
gcaaccttgc tttccaacc 19

Claims (10)

1.一种水稻白叶枯病抗性相关蛋白，其特征在于所述的蛋白由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因，其特征在于所述的基因由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成。
3.一种水稻类病斑基因，其特征在于所述的水稻类病斑基因通过对权利要求2所述的基因进行基因编辑获得；所述的基因编辑是通过CRISPR/CAS9系统进行的；其用于进行基因编辑的靶标序列由SEQ ID No.9所示的核苷酸序列组成。
4.根据权利要求3所述的水稻类病斑基因，其特征在于所述的水稻类病斑基因由SEQID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示的核苷酸序列组成。
5.权利要求3或4所述的水稻类病斑基因在提高水稻白叶枯病抗性上的应用。
6.用于敲除权利要求2所述基因的靶标序列，其特征在于所述的靶标序列由SEQ IDNo.9所示的核苷酸序列组成。
7.用于敲除权利要求2所述基因的sgRNA，其特征在于其靶标序列由SEQ ID No.9所示的核苷酸序列组成。
8.权利要求6所述的靶标序列在提高水稻白叶枯病抗性上的应用。
9.通过敲除权利要求2所述的基因培育抗白叶枯病的水稻品种的方法，其特征在于包括合成权利要求6所述的靶标序列，构建含有所述靶标序列的CRISPR/CAS9系统表达载体；将该表达载体转化到水稻品种中，选择OsABA2基因被敲除的转基因株系，即为抗水稻白叶枯病的水稻品种。
10.一种培育抗白叶枯病的水稻品种的方法，其特征在于包括以权利要求9所述的方法培育的品种为非轮回亲本，以农艺性状优良的品种为轮回亲本回交，回交后代通过分子标记进行辅助选择，选择带有权利要求3或4所述的类病斑基因、且农艺性状倾向于轮回亲本的材料，连续回交4-7代，最后自交1代，选择类病斑性状不分离的株系，即为抗白叶枯病的水稻品种。
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