CN108003227A

CN108003227A - 一种水稻早花时相关蛋白及其编码基因

Info

Publication number: CN108003227A
Application number: CN201810041004.2A
Authority: CN
Inventors: 徐培洲; 吴挺开; 陶宇; 孙朝伟; 吴先军; 张红宇; 陈晓琼; 廖泳祥; 邓小书; 余世聪
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2018-01-16
Filing date: 2018-01-16
Publication date: 2018-05-08
Anticipated expiration: 2038-01-16
Also published as: CN108003227B

Abstract

本发明公开了一种水稻早花时相关蛋白，属于水稻基因工程领域；该蛋白由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成；本发明还公开了相应的由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的编码基因；本发明还公开了水稻早花时基因。本发明早花时基因控制的开颖时间比其相应的野生型开颖时间提前1.5～2h，开颖时间提前效果显著，为培育早花时不育系、进而提高水稻制种产量提供了一种新的基因和途径；其次，本发明早花时性状受单隐性基因控制，转基因后代或杂交育种后代的鉴定和选择比较简单；本发明的早花时突变体为早花时基因的研究和应用提供了很好的研究材料。

Description

一种水稻早花时相关蛋白及其编码基因

技术领域

本发明属于水稻基因工程领域，具体涉及一种水稻早花时相关蛋白，以及编码该蛋白的基因，还涉及它们在水稻三系制种中的用途。

背景技术

杂交水稻的应用大大提高了水稻单位面积产量，但是由于杂交水稻制种产量低、成本高，相应地农民购种的费用高，提高了生产成本。提高单位面积制种产量是降低杂交稻种子生产成本的关键。

杂交水稻制种产量的主要限制因素是不育系异交结实率偏低，而不育系的开花习性是影响异交结实率的决定因素之一(袁隆平.杂交水稻学.中国农业出版社,2002,246-279)。由于不育胞质的负效应，通常不育系每天颖花开颖时间一般比恢复系迟且分散，制种时容易花时不遇，父早母迟，造成花粉得不到有效利用；而母本盛花时，父本已衰退，无足够的花粉提供给母本，造成不育系许多颖花错失授粉时机而不实减产(马铮等.现代农业科技,2005,5:35-36)。因此，培育早花时品种是从根本上解决水稻制种花时不遇问题的有效途径。此外，水稻抽穗开花期对高温最为敏感，高温将导致结实率下降，产量降低。水稻开花期花时提早可避开中午高温对花粉的伤害，能够有效的缓解高温导致的不实减产(Heslop-Harrison JS等.Annals of Botany,1987,59:505-515)。随着全球气候逐渐变暖，水稻产区夏季遭遇高温热害的几率日益增加，已严重影响了当地水稻的安全性生产。

随着转基因技术的发展，利用转基因技术将早花时基因转育到不育系中是解决水稻三系制种花时不遇的有效方法，而研究和获得早花时基因是利用转基因技术的前提和关键。目前，对于水稻早花时性状的遗传控制机制还不清楚，王建军等(杂交水稻，1991，(5))认为水稻早花时性状受一对显性基因控制，孙义伟等(江西农业大学学报，1993，(A01)：461-464)认为早花时性状并非受一对主效基因控制,属于部分显性；Hideyuki等认为水稻早花时基因受数量基因控制，他们利用回交方法将野生稻中的早花时基因转育到栽培稻中，并将该基因定位于第3染色体上，命名为qEMF3(Hideyuki等，Journal of ExperimentalBotany，2015，66(5)：1227-1236)。从上述可知，目前对于早花时基因的研究还不够深入，对于早花时性状的遗传机制还不清楚，更谈不上早花时基因的克隆和应用了。

四川农业大学水稻研究所于2013年5月在甲基磺酸乙酯(EMS)诱变的宜香1B诱变库中筛选得到一个水稻花时提前突变体，命名为emf1(early-morning flowering 1)，该突变体开颖盛花期比野生型宜香1B提前1.5～2h。遗传分析发现其F₂群体的正常花时植株与早花时植株的分离比例接近3：1，说明该早花时性状由单隐性基因控制；并将该基因定位于第一染色体长臂上Osl-86.51和Osl-86.57标记之间的158kb的区间内，在此区间内共存在19个候选基因(刘娟，四川农业大学硕士论文，2016)。目前这19个候选基因还都没有被克隆，也尚未确定是哪个候选基因控制早花时性状。

到目前为止，尚未有控制早花时性状的基因被克隆及应用。

发明内容：

针对目前水稻三系制种中存在的不育系与恢复系之间因花时不遇造成的制种产量低、生产成本高等问题，本发明目的在于提供一种水稻早花时相关蛋白。

本发明第二目的在于提供编码上述相关蛋白的基因。

本发明第三目的在于提供上述基因在水稻制种上的用途。

本发明第四目的在于提供用于敲除上述基因的靶标序列。

本发明第五目的在于提供用于敲除上述基因的sgRNA。

本发明第六目的在于提供一种水稻早花时基因。

本发明第七目的在于提供上述水稻早花时基因在水稻制种上的用途。

本发明第八目的在于提供通过敲除上述基因培育早花时水稻品种的方法。

本发明第九目的在于提供利用回交培育早花时水稻品种的方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供一种水稻早花时相关蛋白，命名为EFT1，所述的相关蛋白由SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列组成。

本发明还提供了编码上述相关蛋白的基因，命名为OsEFT1，所述的基因由SEQ IDNo.2所示的核苷酸序列组成。

上述基因在调控水稻早花时性状上的应用。

上述基因在水稻三系制种上的应用。

用于敲除上述基因的靶标序列，由SEQ ID No.3所示的核苷酸序列组成。

用于敲除上述基因的sgRNA，其靶标序列由SEQ ID No.3所示的核苷酸序列组成。

上述靶标序列在培育早花时水稻品种上的应用。

上述应用中所述的水稻品种是指保持系或不育系。

上述靶标序列在水稻三系制种上的应用。

上述sgRNA在培育早花时水稻品种上的应用。

上述应用中所述的水稻品种是指保持系或不育系。

本发明还提供了一种水稻早花时基因，所述的水稻早花时基因通过上述基因的突变或基因编辑获得；所述的基因编辑通过CRISPR/CAS9系统进行。

上述水稻早花时基因，所述的基因由SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示的核苷酸序列组成。

上述水稻早花时基因中，由SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ IDNo.8所示的核苷酸序列组成的早花时基因是通过对上述基因OsEFT1进行基因编辑获得的。

上述水稻早花时基因中，由SEQ ID No.4所示的核苷酸序列组成的早花时基因来自于突变体emf1，突变体emf1从甲基磺酸乙酯(EMS)诱变的宜香1B诱变库中筛选得到的。

上述水稻早花时基因由单隐性基因控制，该基因位于第一染色体长臂上。

上述水稻早花时基因在水稻三系制种上的应用。

本发明还提供了通过基因敲除培育早花时水稻品种的方法，包括合成上述靶标序列，构建含有所述靶标序列的CRISPR/CAS9系统表达载体；将该表达载体转化到水稻品种中，选择靶基因OsEFT1被敲除的转基因株系即可。

一种利用回交培育早花时水稻保持系的方法，包括以早花时水稻材料为非轮回亲本，以农艺性状优良的保持系为轮回亲本进行杂交，然后自交，选择具有早花时表型、且农艺性状倾向于轮回亲本的后代；连续回交4-8代，最后自交1代，选择具有早花时性状且其他性状不分离的后代，即为早花时水稻保持系。

一种利用回交培育早花时水稻不育系的方法，以上述方法中所得的早花时保持系为父本，以该保持系对应的不育系为母本杂交；再以所得不育后代为母本，以保持系为父本回交一次，选择回交后代中表现早花时性状的不育材料，即为早花时水稻不育系。

上述方法中所述的早花时水稻材料是指emf1，或其他敲除了上述早花时相关基因OsEFT1的材料，如携带有由SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示的核苷酸序列组成的早花时水稻材料。

emf1是四川农业大学水稻研究所于2013年5月在甲基磺酸乙酯(EMS)诱变的宜香1B诱变库中筛选得到一个水稻花时提前突变体，该突变体开颖盛花期比野生型宜香1B提前1.5～2h。

公众可从四川农业大学获得emf1生物材料。

本发明具有的优点或有益效果：(1)本发明早花时基因控制的开颖时间比其相应的野生型宜香1B的开颖时间提前1.5～2h，开颖时间显著提前，为培育早花时不育系和保持系、进而提高水稻制种产量提供了一种新的基因和途径。(2)本发明早花时性状受单隐性基因控制，且受温度和光照影响较小，转基因后代或杂交育种后代的鉴定和选择比较简单，育种效率高、成本低。(3)本发明突变体emf1或基因敲除后产生的早花时突变体为早花时基因的研究和应用提供了很好的研究材料。(4)本发明通过基因敲除手段对花时性状进行改良的方法，为培育早花时品种提供了一个简单快速的途径。

附图说明

图1为宜香1B和emf1成熟期植株对比照片；其中1为宜香1B，2为emf1。

图2为早上8:34时穗局部开颖情况对比照片；其中1为宜香1B，2为emf1。

图3为引物Pemf1-2扩增后的电泳图谱；其中1为DNA Marker,2、3和4为转基因植株。

图4为基因敲除株系在上午9:45时穗部开颖情况对比照片；其中1为中花11，2为转基因阳性株系CAS9#1，3为转基因阳性株系CAS9#2。

图5为转基因敲除株系穗部对比照片；其中1为中花11，2为转基因阳性株系CAS9#1，3为转基因阳性株系CAS9#2。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明做进一步的解释和说明，但是不对本发明构成任何限制。

实施例1本发明早花时突变体emf1中早花时基因筛选

(一)试验材料

(1)花时提前突变体emf1，是本发明人从以籼稻保持系宜香1B为背景构建的EMS(甲基磺酸乙酯)诱变库中筛选获得的花时提前的突变体。该突变体与宜香1B进行多代回交，该花时提前的性状遗传稳定。

(2)早花时突变体emf1和野生型宜香1B(见图1和图2)、以及02428(粳稻)均来自四川农业大学水稻研究所遗传研究实验室。

(二)试验方法

(1)、将emf1与02428杂交构建F₁代群体，并自交得到F₂代群体，用于遗传定位。将emf1与宜香1B回交构建BC₁F₃代群体，用于MutMap测序进行基因精细定位。

(2)、近等基因池构建

将emf1与02428杂交得到的F₂分离群体，采用BAS法(bulk segregationanalysis)进行基因定位与分析。首先，分别随机选取宜香1B的10个单株叶片和02428的10个单株叶片，每10株的叶片等量混合提取DNA建池，得到2个亲本DNA池，用于筛选亲本间多态性分子标记。然后，在emf1与02428杂交得到的F₂群体中选10份具有早花时表型的单株叶片和10份具有野生型正常花时表型的单株叶片，每10株的叶片等量混合提取DNA建池，分别得到1个显性混池和1个隐性混池，用于分析突变性状与染色体的连锁关系。最后，在突变体emf1与02428杂交得到的F₂群体中选择64个具有早花时表型的单株叶片，采用改进CTAB法分单株提取DNA，用于进行基因定位。

(3)、定位引物合成和基因定位

先利用平均分布于水稻12条染色体上的512对SSR引物(具体序列详见http://www.gramene.org/bd/markers)进行PCR扩增，通过PCR扩增并进行琼脂糖凝胶电泳，筛选出在emf1与02428基因组之间具有多态性的引物188对；随后用筛选出的188对多态性引物检测显性混池和隐性混池，以及emf1与02428构建的F₂群体中隐性单株，进行基因初步定位；在已初定位的区间内，依据(http://www.gramene.org)网站公布的籼稻品种9311和粳稻品种日本晴目标区域的核苷酸序列之间的差异，设计Indel引物Os1-94.5和Os1-103.1(见表1)，继续检测近等基因池和emf1与02428构建的F₂群体中的256个隐性单株，进行定位。

表1本试验所用的PCR引物

引物名称	正向引物序列(5’-3’)	反向引物序列(5’-3’)
			1-8	AGCTGCCGTGAGCCTCAAG	TCCAAAACGCTCTCTTCGTC
Os1-94.5	AAAGAACTAGCGAGTCAACG	TCACATTTTGACTCTATGTTGG
			Os1-103.1	TGGTGAGCTGATTTATAGCC	GCAAAATGGAAATGACTAGC
Os1-107.6	GTCGTGGAAGAACAGAAAAG	ATACTAGTCCCATGTGTGGC
			Os1-98	GAGTGGACATTTTCCGATTA	ATGTTTGGTTTAGAGGGGAT
Os1-84.73	CGTTCACTGGGTCTCTCC	GACAGAAACGGAGTCAATTCATCG
			Os1-86.01	TCCTCCTTCTGCGGTATAGTC	GGGTGGCTGCTCTTCTCTC
Os1-86.25	CCACCGCCAGACATCATCTTCG	TTTGCTCCTCCTCCACGCTTCG
			Os1-86.57	GGAGCACACACACACACAAA	CTATCTTCGGCATGCTCCAC
Os1-87.5	CACCAGCACGTACTTCATCTCG	ATACTCCCAAAGCCCTCATCC

其中PCR反应体系(20uL)：Taq酶(5U/uL)0.2uL，Primer(10mmol/L)2uL，dNTP(2.5mmol/L)0.3uL，DNA模板(50-200ng/μL)2uL，10×Buffer(25mM)2uL，ddH₂O 13.5uL。PCR反应程序：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min，12℃1min。将PCR扩增产物在3.0％的琼脂糖凝胶、恒压180V-200V条件下电泳45min-1h左右，用凝胶扫描成像仪(Bio-rad GelDoc 2000)成像并保存记录。

(4)、连锁图谱的构建

将与emf1带型一致的单株标为Ⅰ，与02428带型一致的单株标为Ⅱ，杂合双带型单株标为Ⅲ，没有跑出条带的单株标为Ⅳ，统计结果通过用生物学分析软件Mapmake3.0软件对F₂分离群体中分子标记和突变性状的分离数据进行连锁分析，再将重组值转化为遗传图距(cent Morgan,cM)。

结果发现第1染色体的短臂端两个SSR标记1-8和Os1-107.6均与目标性状存在连锁关系，遗传距离分别为0.39cM和0.78cM。

(5)、候选基因精细定位和基因预测

为了进一步缩小定位区间，在emf1和宜香1B杂交后所得的F₂群体中随机选25株表型为早花时的植株，以等量的DNA构成一个突变体混池，用于MutMap全基因组测序。以表型为花时正常的宜香1B基因组序列为参照组，对突变体emf1的全基因组高通量测序结果进行分析解读，测序深度为20层。用SOAP2软件将测序数据与已发表的日本晴参考基因组(MSUOsa1Release 7Annotation)进行全完比对，根据初定位区间筛选出染色体特定位置的短序列片段。运用SOAPsnp、SOAPsv、SOAPindel等数据分析软件对突变体与日本晴参考组之间的单核苷酸多态性(SNP)、SVs、InDels进行分析解读，筛选出突变体emf1在定位区间内特异存在7个SNPs位点、1处13bp的碱基缺失、1个SVs。通过计算△SNP index，挑选出在F2-read≥15且连续分布的高△SNP index读值(理论上△SNP index≥0.85，可定义为突变基因与性状紧密连锁)。经过数据分析得到12条染色体上SNP位点的散点分散图。在第1染色体短臂上出现高△SNP index分值且连续分布的情况，与初定位区间相吻合。由此得到候选基因所在的区间定位于第1染色体短臂物理距离21M～23M之间，在此区间内没有已报道的与花时相关的基因，分析结果表明LOC_Os01g42520为一个控制花时的新基因。

将Mutmap全基因组测序数据分析结果与突变体emf1突变表型、水稻基因组注释网站(http://rice.plantbiology.msu.ed/cgi-bin)与(http://plants.ensembl.org/ index.html)中籼稻数据库相结合，根据基因功能注释进行筛选在定位区间内，进一步分析得到这几个SNP位点多处于基因间、内含子上或同义突变，仅有一个SNP位点位于基因LOC_Os01g42520的第二外显子属于非同义突变，与13bp碱基缺失刚好位于同一个外显子。为了确认Mutmap重测序结果的可靠性，对分析公司给出的三个SNP位点与缺失片段设计引物，分别在野生型与突变体emf1中进行PCR扩增并进行Sanger测序，同时将SNPs转化为四引物受阻扩增标记进行基因性状共分离验证。结果表明其中非同义突变的SNP为位点在野生型与突变体emf1中的确发生了单碱基突变，并在同一个外显子上部分缺失，并在F₂代中发生了基因性状共分离，与分析公司给予的结果相吻合。在该编码蛋白基因的CDS区第760位碱基由胞嘧啶转换成胸腺嘧啶，造成编码的第254位氨基酸由精氨酸突变为半胱氨酸，同时在基因组24183132至24183243处缺失13个碱基，导致了5个氨基酸的缺失，造成基因移码突变(野生型的氨基酸序列见SEQ ID No.1、相应野生型的基因序列见SEQ ID No.2；突变体emf1的基因序列见SEQ IDNo.4)，该碱基突变与13bp碱基的缺失可能破坏了蛋白的正常编码序列，导致蛋白的功能遭受破坏，故将该基因LOC_Os01g42520列为突变体emf1中早花时性状的候选基因，命名为OsEFT1。

实施例2本发明早花时候选基因OsEFT1的基因敲除验证试验

(一)试验材料

本试验所用大肠杆菌感受态DH5α购于北京全式金生物有限公司、农杆菌EHA105菌株受四川农业大学水稻研究所王文明课题组惠赠。

(二)试验方法

1、CRISPR/Cas9-OsEFT1基因敲除载体构建

以F:5’-ATGCGTCGCGTCACGGTG-3’和R:5’-CAGGAGCAGCCGCCGGCC-3’为引物，分别以突变体emf1、宜香1B、中花11的cDNA为模板对该基因进行扩增，发现该基因在籼稻宜香1B与粳稻中花11中编码区核苷酸序列存在高度同源的情况，说明该基因编码的蛋白在籼稻宜香1B和粳稻中花11中无差异。

以野生型宜香1B中OsEFT1(LOC_Os01g42520)基因的核苷酸序列为模板，选择特异的区域，设计1个靶标序列，利用BWA(V)H-CAS9载体参照试剂盒(杭州百格生物公司)构建CRISPR/CAS9-OsEFT1载体。具体构建流程如下：

(1)设计目的基因的靶标序列：

5’-GCGCGCCGCGCTAAACGTGA-3’(SEQ ID NO.3)；

(2)、设计并合成下述接头引物以形成gRNA靶点序列：

5’-GGGCGCCCGCGCCGTGGAGCTGG-3’；

5’-GCGCGCCGCGCTAAACGTGACGG-3’。

(3)、制备引物二聚体

将步骤(2)合成的引物对加水溶解至10μM，按下列反应体系混合后，在PCR仪95℃加热3分钟，然后以约0.2℃/秒缓慢降至20℃，得引物二聚体。所述的反应体系为：退火Buffer 18ul,gRNA靶点引物各1ul，加ddH₂O,补足至20ul。

(4)、将引物二聚体构建至BWA(V)H载体。按下列反应体系在冰上混合各个组分，混匀后20℃反应1小时，获得包含启动子、靶序列、gRNA等元件的表达载体。所述的反应体系：BWA(V)H载体2ul，Oligo二聚体1ul，酶混合液1ul，加ddH₂O,补足至10ul。

2大肠杆菌转化

(1)、从-80℃冰箱中取出一管制备好的大肠杆菌感受态细胞，置于冰上融化；

(2)、每100ng上述表达载体加入100μL感受态细胞悬浮液，混匀后在冰上放置30min；

(3)、42℃热激30s，迅速取出立即置于冰上2min；

(4)、加入500μL不含抗生素的LB液体培养基，在37℃、200rpm培养1小时，得活化菌液；

(5)、将活化的菌液以5000rpm离心1min，在无菌条件下倒掉大部分上清夜，用移液枪轻轻吸打混匀沉淀，吸取100μL，在超净台上把菌液转移并涂到含有卡那霉素的LB筛选平板上；

(6)、将涂有菌液的LB固体培养基平板正面向上放置10分钟左右，待菌液完全被LB固体培养基吸收后将涂板的培养基倒置，于恒温箱中37℃过夜培养；

(7)、挑取单菌落，利用Pemf1引物对菌液进行PCR检测阳性克隆个体。所述的Pemf1引物对为：Pemf1F:5’-CAAGGCGAAGATGGACGAG-3’，Pemf1R:5’-ATCAAGGTGCCGTACGAGT-3’；其中PCR反应程序：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min，12℃1min。

(8)、将阳性克隆加入3ml含有卡那霉素(50mg/L)的LB培养液中，在37℃、200rpm下培养约10h，保存菌液并提取质粒。

3、按照OMEGA Plasmid Extraction Kit产品说明书提取大肠杆菌质粒，将提取的质粒DNA收集到干净的离心管中，-20℃保存。

4、质粒序列的测定和序列分析

将阳性克隆质粒送到成都擎科科技股份有限公司进行测序。用DNAMAN软件对测序结果进行序列比对，确证gRNA序列的正确性，将阳性克隆质粒命名为CRISPR/Cas9-OsEFT1。

5、农杆菌转化

(1)农杆菌化学转化法

按照一个质粒：50ul感受态细胞从-80℃拿出来时快速放手心化冻；将构建好的CRISPR/Cas9-OsEFT1质粒0.4～1ug加入到50ul感受态细胞中，冰上放置30min；液氮中冷冻2min；37℃水浴2min,溶化细胞；立即加入5倍体积的无抗生素LB液体培养基，在28℃、170rpm下摇床培养2～3hr；7000rpm离心2分钟，在100ul LB液体培养基中悬浮细胞；涂在利福平加卡那抗性板，吹干，28℃培养2-3天；用潮霉素分子标记Pemf1引物进行菌液PCR检测，将能扩增出目的条带的阳性农杆菌单克隆，加入甘油作为保护剂，置于-80℃保存备用。

(2)农杆菌浸染法转化水稻

(a)愈伤组织的诱导：先用75％酒精将日本晴种子消毒1分钟，用无菌水漂洗3次，然后用40％的次氯酸钠漂洗30min，再用无菌水冲洗5次，放置于带滤纸的培养皿中滤干，用镊子接种于NMB培养基上，于28℃、光照条件下培养7天。每7天继代一次。继代2～3次后，挑取从种子上生长出的良好愈伤组织，把它们继代于NMB培养基上，于28℃、黑暗条件下培养4天。

(b)农杆菌菌株的活化：将(1)中-80℃保存的30ul农杆菌加入3mL含有利福平和卡那霉素的YEP液体培养基中，于28℃下振荡培养14h；再取其中1mL于含有利福平和卡那霉素的50mLYEP液体培养基中，28℃再振荡培养4h，得活化的农杆菌菌液。

(c)共培养转化：将(b)活化好的菌液在5000rpm下离心收集菌体，用含有100μM/L乙酰丁香酮的AAM液体培养基30mL重悬菌体，将(a)中预先挑好的愈伤组织浸于菌液中20min，吸去多余的菌液，平铺于共培养固体培养基上，28℃暗培养2d。

(d)愈伤脱菌培养与愈伤抗性筛选：将共培养2d后的愈伤组织用无菌水冲洗至水澄清，然后用含头孢霉素(500mg/L)的无菌水振荡30min杀菌，将愈伤组织用无菌滤纸或吸水纸彻底吸干，然后接种于选择培养基上培养3周左右。

(e)转基因植株的分化与生根：将(d)中新长出的抗性愈伤组织接种到分化培养基上，光照培养1～2个月，然后将长出的3cm左右高的幼苗转到生根培养基上进行生根培养，当苗长至约10cm时，取叶片提取DNA，利用扩增目的基因全长DNA的Pemf1引物进行鉴定阳性植株苗，最终获得4株转基因阳性植株。将4个转基因阳性植株分别命名为：CAS9#1、CAS9#2、CAS9#3、CAS9#4。

(f)将阳性转基因植株室内炼苗2-3天后，移栽于大田。

6、转基因水稻的检测

(1)应用改进的CTAB法提取步骤5中所得的阳性转基因植株的DNA，用Pemf1-2引物对扩增出转基因植株中的敲除靶基因的全长序列(见图3)。所述的Pemf1-2引物对为：Pemf1-2F：5'-GAAGGAAGTAAGACGAGCGC-3'，Pemf1-2R：5'-AACCCCTTGTGACAGACCTT-3'；其中PCR反应体系(25uL)：Tap酶(5U/μL)0.5ul，Primer(10mmol/L)2ul，dNTP(2.5mmol/L)0.5ul，DNA(20-100ng/μL)2ul，2×Buffer(25mM)12.5ul，ddH₂O 7.5ul。PCR反应程序为：95℃5min；95℃30s，56℃5s，72℃2.5min，30个循环；72℃10min，12℃1min。

(2)PCR产物的回收和测序

PCR扩增反应结束后,在产物中加入溴酚蓝指示剂，并在2％的琼脂糖中电泳，并用天根PCR产物回收试剂盒进行回收，送成都擎科科技股份有限公司测序。

结果2个独立转基因阳性株系均表现为早花时表型(见图4)。与阴性对照对比发现，4个转基因植株在OsEFT1基因的CDS编码区分别发生了单碱基G/T的插入，缺失或小片段缺失突变(见SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.8)。上述结果说明OsEFT1基因是控制早花时表型的基因；也证明OsEFT1是控制突变体emf1早花时表型的基因。

7、对转基因敲除株系Cas9#1和对照品种中花11进行盛花期开颖时间统计。

结果(见图5，表2)发现转基因敲除株系和突变体emf1的早花时性状相似，与对照相比，敲除OsEFT1基因的转基因株系Cas9#1的开颖时间早于阴性对照中花11，说明对OsEFT1基因其它CDS编码区(相对突变体emf1突变位点而言)进行编辑(包括进行一个或几个添加、替换和缺失)同样可以获得突变体emf1的早花时特性；说明OsEFT1基因是控制小穗开颖的相关基因，将该基因敲除后可以使水稻提前开颖，花时提前。

表2敲除OsEFT1转基因株系相对于对照中花11的开颖时间对比结果

实施例3本发明早花时突变体emf1的转录组测序试验

RNA-seq测序拼接在上海欧易生物有限公司进行，具体的步骤如下：

(一)RNA抽提、建库

(1)在前一天选择穗部颖花已开到1/3处的植株做标记，分别收集开颖前14h、早晨8：30(突变体开颖时)两个时间点的突变体emf1、野生型宜香1B颖花在液氮中速冻，并在冰上剥取，设置三次生物重复。运用试剂盒mirVana^TM miRNA ISOlation Kit，Ambion-1561抽提总RNA，样品质量要求≥5μg，纯度要求OD:1.8～2.2。

(2)链特异性转录组建库

提取浆片的总RNA并使用DNase消化DNA后，用带有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA；将mRNA用特异试剂打断成短片段，以打断后的mRNA为模板,用六碱基随机引物合成一链cDNA，然后配制二链合成反应体系合成二链cDNA，并使用试剂盒纯化双链cDNA；纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后进行片段大小选择，最后进行PCR扩增；构建好的文库用Agilent 2100Bioanalyzer质检合格后，使用Illumina HiSeqTM2500或其他测序仪进行测序。

文库经质检后在Hiseq4000平台进行读数测序。

(二)转录组数据分析

随机选着一些在pathway和GO的基因进行荧光定量qRT-PCR分析

前人研究已经证明OsEFT1基因在拟南芥中的同源基因AT4G32460编码一类参与果胶酯酶的转录因子，调控果胶酯酶的活力进而对细胞壁的修饰起着关键的作用。为了研究OsEFT1基因的调控网路，本发明的发明人分别收集了野生型宜香1B与突变体emf1在开颖前1天18:00与突变体开颖时8:30的小穗样品，使用RNA-seq分析。通过emf1(18:00)与宜香1B(18:00)的GO富集与KEGG pathway分析：其生理作用集中为植物类型细胞壁组织毛，细胞组分集中为植物类型细胞壁，分子功能集中为DNA特定绑定结构域转录因子的活力；而emf1(8:30)与宜香1B(8:30)的GO富集和KEGG pathway分析：其生理作用富集为植物类型细胞壁组织细胞壁结构，细胞结构组分富集为植物类型细胞壁，分子功能富集为果胶酯酶的活力；RNA-Seq分析结果与本发明的发明人的预测结果相符：OsEFT1编码一个正调控转录因子对果胶酯酶活力调控，控制细胞壁上或细胞间的原果胶去酯化过程。而早花时突变体emf1为隐性突变，OsEFT1基因功能丧失，进而无法正常的将原果胶去酯化修饰细胞壁，浆片薄壁细胞成分的改变，影响浆片的吸水速率，影响小穗的开颖过程。说明OsEFT1对于细胞壁组成与修饰过程中发挥着必不可少的功能。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种水稻早花时相关蛋白及其编码基因

<130> 2018S1142INH

<141> 2018-01-15

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 373

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 1

Met Arg Arg Val Thr Val Leu Val Leu Leu Leu Ala Cys Ala Ala Ala

1 5 10 15

Arg Ala Ala Ala Ala Val Val Thr Asp Gly Leu Leu Pro Asn Gly Asn

20 25 30

Phe Glu Glu Gly Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Asn Gly Thr Val Val

35 40 45

Arg Gly Ala Asn Ala Ile Pro Arg Trp Glu Thr Ser Gly Phe Val Glu

50 55 60

Tyr Ile Glu Ser Gly His Lys Gln Gly Asp Met Leu Leu Val Val Pro

65 70 75 80

Gln Gly Ala His Ala Val Arg Leu Gly Asn Glu Ala Ser Ile Arg Gln

85 90 95

Arg Leu Ala Val Thr Arg Gly Ala Tyr Tyr Ala Val Thr Phe Ser Ala

100 105 110

Ala Arg Thr Cys Ala Gln Ala Glu Gln Leu Asn Val Ser Val Ser Pro

115 120 125

Glu Trp Gly Val Leu Pro Met Gln Thr Ile Tyr Gly Ser Asn Gly Trp

130 135 140

Asp Ser Tyr Ala Trp Ala Phe Lys Ala Lys Met Asp Glu Val Ala Leu

145 150 155 160

Val Ile His Asn Pro Gly Val Glu Glu Asp Pro Ala Cys Gly Pro Leu

165 170 175

Ile Asp Gly Val Ala Ile Arg Ala Leu Tyr Pro Pro Thr Leu Ala Lys

180 185 190

Gly Asn Met Leu Lys Asn Gly Gly Phe Glu Glu Gly Pro Tyr Phe Leu

195 200 205

Pro Asn Ala Ser Trp Gly Val Leu Val Pro Pro Asn Ile Glu Asp Asp

210 215 220

His Ser Pro Leu Pro Ala Trp Met Ile Met Ser Ser Lys Ala Val Lys

225 230 235 240

Tyr Val Asp Ala Ala His Phe Ala Val Pro Gln Gly Ala Arg Ala Val

245 250 255

Glu Leu Val Gly Gly Lys Glu Ser Ala Leu Val Gln Glu Val Arg Thr

260 265 270

Val Pro Gly Trp Thr Tyr Arg Leu Ser Phe Ala Val Gly Asp Ala Arg

275 280 285

Asp Gly Cys Ala Gly Ser Met Val Ala Glu Ala Tyr Ala Ala Arg Ala

290 295 300

Ser Ile Lys Val Pro Tyr Glu Ser Lys Gly Thr Gly Gly Tyr Lys Arg

305 310 315 320

Ala Val Leu Glu Phe Ala Ala Ile Ala Asn Arg Thr Arg Val Val Phe

325 330 335

Gln Ser Thr Phe Tyr His Thr Met Thr Asp Gly Ser Leu Cys Gly Pro

340 345 350

Val Ile Asp Asp Ala Ser Leu Val Gly Leu Arg Lys Lys Thr Ala Gly

355 360 365

Arg Arg Leu Leu Leu

370

<210> 2

<211> 1119

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 2

atgcgtcgcg tcacggtgct cgttctgctc ctcgcctgcg cggcggcgcg cgccgccgcc 60

gccgtcgtca ccgacgggct gttgccgaac ggcaacttcg aggagggccc acccaagtcg 120

gacctggtga acggcacggt ggtgcgcggc gcgaacgcca tcccgcggtg ggagacgtcc 180

gggttcgtgg agtacatcga gtccgggcac aagcaggggg acatgctgct ggtggtgccg 240

cagggcgcgc acgccgtgcg cctcggcaac gaggcgtcca tccggcagcg gctcgccgtg 300

accaggggcg cctactacgc cgtcacgttt agcgcggcgc gcacctgcgc ccaggcggag 360

cagctcaacg tgtcggtgag ccccgagtgg ggggtgctcc ccatgcagac catctacggc 420

agcaacgggt gggactcgta cgcgtgggcg ttcaaggcga agatggacga ggtggcgctc 480

gtcatccaca acccgggcgt ggaggaggac ccggcgtgcg gcccgctcat cgacggcgtc 540

gccatcaggg cgctgtaccc gccgacgctg gccaagggga acatgctcaa gaacggcggg 600

ttcgaggagg gcccctactt cctccccaac gcgtcgtggg gggtgctcgt cccgcccaac 660

atcgaggacg accactcgcc gctcccggcg tggatgatca tgtcgtccaa ggccgtcaag 720

tacgtcgacg ccgcgcactt cgccgtgccg cagggcgccc gcgccgtgga gctggtgggg 780

ggcaaggagt cggcgctggt gcaggaggtg cgcaccgtgc ccgggtggac gtaccgcctg 840

tcgttcgccg tgggcgacgc gcgcgacggg tgcgcgggct ccatggtcgc cgaggcgtac 900

gcggcgaggg cctccatcaa ggtgccgtac gagtccaagg gcaccggcgg gtacaagcgc 960

gccgtcctcg agttcgccgc catcgccaac cgcacccgcg tcgtgttcca gagcacgttc 1020

taccacacca tgaccgacgg ctcgctctgc gggccggtca tcgacgacgc ctccctcgtc 1080

ggcctccgca agaagacggc cggccggcgg ctgctcctg 1119

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(20)

<223> 用于敲除早花时相关基因OsEFT1的靶标序列

<400> 3

gcgcgccgcg ctaaacgtga 20

<210> 4

<211> 1106

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 4

atgcgtcgcg tcacggtgct cgttctgctc ctcgcctgcg cggcggcgcg cgccgccgcc 60

gccgtcgtca ccgacgggct gttgccgaac ggcaacttcg aggagggccc acccaagtcg 120

gacctggtga acggcacggt ggtgcgcggc gcgaacgcca tcccgcggtg ggagacgtcc 180

gggttcgtgg agtacatcga gtccgggcac aagcaggggg acatgctgct ggtggtgccg 240

cagggcgcgc acgccgtgcg cctcggcaac gaggcgtcca tccggcagcg gctcgccgtg 300

accaggggcg cctactacgc cgtcacgttt agcgcggcgc gcacctgcgc ccaggcggag 360

cagctcaacg tgtcggtgag ccccgagtgg ggggtgctcc ccatgcagac catctacggc 420

agcaacgggt gggactcgta cgcgtgggcg ttcaaggcga agatggacga ggtggcgctc 480

gtcatccaca acccgggcgt ggaggaggac ccggcgtgcg gcccgctcat cgacggcgtc 540

gccatcaggg cgctgtaccc gccgacgctg gccaagggga acatgctcaa gaacggcggg 600

ttcgaggagg gcccctactt cctccccaac gcgtcgtggg gggtgctcgt cccgcccaac 660

atcgaggacg accactcgcc gctcccggcg tggatgatca tgtcgtccaa ggccgtcaag 720

tacgtcgacg ccgcgcactt cgccgtgccg cagggcgcct gcgccgtgga gctggtgggg 780

ggcaaggagt cggcgctggt gcaggaggtg cgcaccgtac ccgcctgtcg ttcgccgtgg 840

gcgacgcgcg cgacgggtgc gcgggctcca tggtcgccga ggcgtacgcg gcgagggcct 900

ccatcaaggt gccgtacgag tccaagggca ccggcgggta caagcgcgcc gtcctcgagt 960

tcgccgccat cgccaaccgc acccgcgtcg tgttccagag cacgttctac cacaccatga 1020

ccgacggctc gctctgcggg ccggtcatcg acgacgcctc cctcgtcggc ctccgcaaga 1080

agacggccgg ccggcggctg ctcctg 1106

<210> 5

<211> 1120

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 5

atgcgtcgcg tcacggtgct cgttctgctc ctcgcctgcg cggcggcgcg cgccgccgcc 60

gccgtcgtca ccgacgggct gttgccgaac ggcaacttcg aggagggccc acccaagtcg 120

gacctggtga acggcacggt ggtgcgcggc gcgaacgcca tcccgcggtg ggagacgtcc 180

gggttcgtgg agtacatcga gtccgggcac aagcaggggg acatgctgct ggtggtgccg 240

cagggcgcgc acgccgtgcg cctcggcaac gaggcgtcca tccggcagcg gctcgccgtg 300

accaggggcg cctactacgc cgtcatcgtt tagcgcggcg cgcacctgcg cccaggcgga 360

gcagctcaac gtgtcggtga gccccgagtg gggggtgctc cccatgcaga ccatctacgg 420

cagcaacggg tgggactcgt acgcgtgggc gttcaaggcg aagatggacg aggtggcgct 480

cgtcatccac aacccgggcg tggaggagga cccggcgtgc ggcccgctca tcgacggcgt 540

cgccatcagg gcgctgtacc cgccgacgct ggccaagggg aacatgctca agaacggcgg 600

gttcgaggag ggcccctact tcctccccaa cgcgtcgtgg ggggtgctcg tcccgcccaa 660

catcgaggac gaccactcgc cgctcccggc gtggatgatc atgtcgtcca aggccgtcaa 720

gtacgtcgac gccgcgcact tcgccgtgcc gcagggcgcc cgcgccgtgg agctggtggg 780

gggcaaggag tcggcgctgg tgcaggaggt gcgcaccgtg cccgggtgga cgtaccgcct 840

gtcgttcgcc gtgggcgacg cgcgcgacgg gtgcgcgggc tccatggtcg ccgaggcgta 900

cgcggcgagg gcctccatca aggtgccgta cgagtccaag ggcaccggcg ggtacaagcg 960

cgccgtcctc gagttcgccg ccatcgccaa ccgcacccgc gtcgtgttcc agagcacgtt 1020

ctaccacacc atgaccgacg gctcgctctg cgggccggtc atcgacgacg cctccctcgt 1080

cggcctccgc aagaagacgg ccggccggcg gctgctcctg 1120

<210> 6

<211> 1120

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 6

atgcgtcgcg tcacggtgct cgttctgctc ctcgcctgcg cggcggcgcg cgccgccgcc 60

gccgtcgtca ccgacgggct gttgccgaac ggcaacttcg aggagggccc acccaagtcg 120

gacctggtga acggcacggt ggtgcgcggc gcgaacgcca tcccgcggtg ggagacgtcc 180

gggttcgtgg agtacatcga gtccgggcac aagcaggggg acatgctgct ggtggtgccg 240

cagggcgcgc acgccgtgcg cctcggcaac gaggcgtcca tccggcagcg gctcgccgtg 300

accaggggcg cctactacgc cgtcaacgtt tagcgcggcg cgcacctgcg cccaggcgga 360

gcagctcaac gtgtcggtga gccccgagtg gggggtgctc cccatgcaga ccatctacgg 420

cagcaacggg tgggactcgt acgcgtgggc gttcaaggcg aagatggacg aggtggcgct 480

cgtcatccac aacccgggcg tggaggagga cccggcgtgc ggcccgctca tcgacggcgt 540

cgccatcagg gcgctgtacc cgccgacgct ggccaagggg aacatgctca agaacggcgg 600

gttcgaggag ggcccctact tcctccccaa cgcgtcgtgg ggggtgctcg tcccgcccaa 660

catcgaggac gaccactcgc cgctcccggc gtggatgatc atgtcgtcca aggccgtcaa 720

gtacgtcgac gccgcgcact tcgccgtgcc gcagggcgcc cgcgccgtgg agctggtggg 780

gggcaaggag tcggcgctgg tgcaggaggt gcgcaccgtg cccgggtgga cgtaccgcct 840

gtcgttcgcc gtgggcgacg cgcgcgacgg gtgcgcgggc tccatggtcg ccgaggcgta 900

cgcggcgagg gcctccatca aggtgccgta cgagtccaag ggcaccggcg ggtacaagcg 960

cgccgtcctc gagttcgccg ccatcgccaa ccgcacccgc gtcgtgttcc agagcacgtt 1020

ctaccacacc atgaccgacg gctcgctctg cgggccggtc atcgacgacg cctccctcgt 1080

cggcctccgc aagaagacgg ccggccggcg gctgctcctg 1120

<210> 7

<211> 1113

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 7

atgcgtcgcg tcacggtgct cgttctgctc ctcgcctgcg cggcggcgcg cgccgccgcc 60

gccgtcgtca ccgacgggct gttgccgaac ggcaacttcg aggagggccc acccaagtcg 120

gacctggtga acggcacggt ggtgcgcggc gcgaacgcca tcccgcggtg ggagacgtcc 180

gggttcgtgg agtacatcga gtccgggcac aagcaggggg acatgctgct ggtggtgccg 240

cagggcgcgc acgccgtgcg cctcggcaac gaggcgtcca tccggcagcg gctcgccgtg 300

accaggggcg cctactacgc cgtcacgttt agcgcggcgc gcacctgcgc ccaggcggag 360

cagctcaacg tgtcggtgag ccccgagtgg ggggtgctcc ccatgcagac catctacggc 420

agcaacgggt gggactcgta cgcgtgggcg ttcaaggcga agatggacga ggtggcgctc 480

gtcatccaca acccgggcgt ggaggaggac ccggcgtgcg gcccgctcat cgacggcgtc 540

gccatcaggg cgctgtaccc gccgacgctg gccaagggga acatgctcaa gaacggcggg 600

ttcgaggagg gcccctactt cctccccaac gcgtcgtggg gggtgctcgt cccgcccaac 660

atcgaggacg accactcgcc gctcccggcg tggatgatca tgtcgtccaa ggccgtcaag 720

tacgtcgacg ccgcgcactt cgccgtgccg cagggcgccc gcgccgtgga ggggggcaag 780

gagtcggcgc tggtgcagga ggtgcgcacc gtgcccgggt ggacgtaccg cctgtcgttc 840

gccgtgggcg acgcgcgcga cgggtgcgcg ggctccatgg tcgccgaggc gtacgcggcg 900

agggcctcca tcaaggtgcc gtacgagtcc aagggcaccg gcgggtacaa gcgcgccgtc 960

ctcgagttcg ccgccatcgc caaccgcacc cgcgtcgtgt tccagagcac gttctaccac 1020

accatgaccg acggctcgct ctgcgggccg gtcatcgacg acgcctccct cgtcggcctc 1080

cgcaagaaga cggccggccg gcggctgctc ctg 1113

<210> 8

<211> 1119

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 8

atgcgtcgcg tcacggtgct cgttctgctc ctcgcctgcg cggcggcgcg cgccgccgcc 60

gccgtcgtca ccgacgggct gttgccgaac ggcaacttcg aggagggccc acccaagtcg 120

gacctggtga acggcacggt ggtgcgcggc gcgaacgcca tcccgcggtg ggagacgtcc 180

gggttcgtgg agtacatcga gtccgggcac aagcaggggg acatgctgct ggtggtgccg 240

cagggcgcgc acgccgtgcg cctcggcaac gaggcgtcca tccggcagcg gctcgccgtg 300

accaggggcg cctactacgc cgtcacgttt agcgcggcgc gcacctgcgc ccaggcggag 360

cagctcaacg tgtcggtgag ccccgagtgg ggggtgctcc ccatgcagac catctacggc 420

agcaacgggt gggactcgta cgcgtgggcg ttcaaggcga agatggacga ggtggcgctc 480

gtcatccaca acccgggcgt ggaggaggac ccggcgtgcg gcccgctcat cgacggcgtc 540

gccatcaggg cgctgtaccc gccgacgctg gccaagggga acatgctcaa gaacggcggg 600

ttcgaggagg gcccctactt cctccccaac gcgtcgtggg gggtgctcgt cccgcccaac 660

atcgaggacg accactcgcc gctcccggcg tggatgatca tgtcgtccaa ggccgtcaag 720

tacgtcgacg ccgcgcactt cgccgtgccg cagggcgccc gcgccgtgga gctggtgggg 780

ggcaaggagt cggcgctggt gcaggaggtg cgcaccgtgc ccgggtggac gtaccgcctg 840

tcgttcgccg tgggcgacgc gcgcgacggg tgcgcgggct ccatggtcgc cgaggcgtac 900

gcggcgaggg cctccatcaa ggtgccgtac gagtccaagg gcaccggcgg gtacaagcgc 960

gccgtcctcg agttcgccgc catcgccaac cgcacccgcg tcgtgttcca gagcacgttc 1020

taccacacca tgaccgacgg ctcgctctgc gggccggtca tcgacgacgc ctccctcgtc 1080

ggcctccgca agaagacggc cggccggcgg ctgctcctg 1119

Claims

1.一种水稻早花时相关蛋白，其特征在于所述的相关蛋白由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成。

2.编码权利要求1所述相关蛋白的基因，其特征在于所述的基因由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成。

3.用于敲除权利要求2所述基因的靶标序列，其特征在于由SEQ ID No.3所示的核苷酸序列组成。

4.用于敲除权利要求2所述基因的sgRNA，其特征在于其靶标序列由SEQ ID No.3所示的核苷酸序列组成。

5.权利要求3所述的靶标序列在培育早花时水稻品种上的应用。

6.一种水稻早花时基因，其特征在于所述的水稻早花时基因通过权利要求2所述基因的突变或基因编辑获得；所述的基因编辑通过CRISPR/CAS9系统进行。

7.根据权利要求6所述的水稻早花时基因，其特征在于所述的基因由SEQ ID No.4、SEQID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示的核苷酸序列组成。

8.权利要求6或7所述的水稻早花时基因在水稻三系制种上的应用。

9.通过基因敲除培育早花时水稻品种的方法，其特征在于包括合成权利要求3所述的靶标序列，构建含有所述靶标序列的CRISPR/CAS9系统表达载体；将该表达载体转化到水稻品种中，选择靶基因被敲除的转基因株系即可。

10.一种利用回交培育早花时水稻保持系的方法，包括以早花时水稻材料为非轮回亲本，以农艺性状优良的保持系为轮回亲本进行杂交，然后自交，选择具有早花时表型、且农艺性状倾向于轮回亲本的后代；连续回交4-8代，最后自交1代，选择具有早花时性状且其他性状不分离的后代，即为早花时水稻保持系；其中早花时水稻材料是指emf1。

11.一种利用回交培育早花时水稻不育系的方法，以权利要求10所述方法中所得的早花时保持系为父本，以该保持系对应的不育系为母本杂交；再以所得不育后代为母本，以保持系为父本回交一次，选择回交后代中表现早花时性状的不育材料，即为早花时水稻不育系。