CN111073991A - 一种抗稻瘟病基因Pi67(t)，及与其紧密连锁的共显性分子标记和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于农作物分子遗传育种学领域，具体涉及一种水稻抗稻瘟病基因Pi67(t)，及与其紧密连锁的共显性分子标记和应用。所述分子标记是一种水稻抗稻瘟病基因Pi67(t)紧密连锁的分子标记，它是用引物组合SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3从水稻总DNA中扩增出的核苷酸序列，通过检测该分子标记，可以准确判断待测水稻样品中是否携带抗稻瘟病基因Pi67(t)，加快抗稻瘟病水稻品种选育进程。

Description

一种抗稻瘟病基因Pi67(t)，及与其紧密连锁的共显性分子标 记和应用

技术领域

本发明属于农作物分子遗传育种学领域，具体涉及一种水稻抗稻瘟病基因Pi67(t)，及与其紧密连锁的共显性分子标记和应用。

背景技术

水稻是我国最重要的农作物之一，其对保障我国粮食安全具至关重要的意义。由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病是对水稻生产造成严重危害的病害之一，一旦发病，不但降低水稻产量，而且影响稻米品质，给水稻生产带来严重损失。我国北方粳稻年栽培面积达9000万亩以上，约占全国粳稻生产面积的60％。近20年来，尽管在高产育种上有巨大突破，但由于稻瘟病菌复杂多变，且品种抗谱狭窄，加之品种单一化大面积种植，导致很多育成的优良品种推广几年即丧失了抗性，严重影响我国的粮食安全。长期的生产实践表明，培育和合理利用抗病品种是控制稻瘟病最经济有效和环境友好的途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种水稻抗稻瘟病基因Pi67(t)，及与其紧密连锁的共显性分子标记和应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种抗稻瘟病基因Pi67(t)，在水稻品种GY8的第12号染色体10.18Mb-11.14Mb区域内，携带抗稻瘟病基因Pi67(t)。

一种与抗稻瘟病基因Pi67(t)紧密连锁的共显性分子标记，分子标记为在水稻抗稻瘟病Pi67(t)的定位区域内存在一个60bp的插入位点，核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

一种用于检测所述分子标记的的引物组合，所述引物组合由如SEQ ID NO.2和SEQID NO.3中碱基序列所示；其中，SEQ ID NO.2正向引物Indel-F序列是5′-GGGAGGGTGGTCATTTTCTT-3′，SEQ ID NO.3反向引物Indel-R序列是5′-GCTGCAACCACTTCTTAGGC-3′。

一种引物组合的应用，所述引物组合在选育携带抗稻瘟病基因Pi67(t)的水稻品种中的应用。

进一步的说：

1)以携带抗稻瘟病基因Pi67(t)的水稻抗病品系GY8与其它不携带抗稻瘟病基因Pi67(t)的水稻品种杂交并繁衍后代群体；

2)提取上述所获得群体中单个植株的基因组DNA，用权利要求3所述引物组合进行PCR扩增，扩增产物的片段长度为337bp，则标志着所检测水稻样品携带抗稻瘟病基因Pi67(t)。

一种检测水稻品种是否携带Pi67(t)方法，

1)提取水稻样品基因组DNA；

2)利用权利要求3所述的引物组合对水稻样品基因组DNA进行PCR扩增；

3)扩增产物的片段长度为337bp，则标志着其样品基因组中携带抗稻瘟病基因Pi67(t)。

一种利用所述引物组合选育携带抗稻瘟病基因Pi67(t)的水稻品种的方法，

1)以携带抗稻瘟病基因Pi67(t)的水稻抗病品系GY8与其它不携带抗稻瘟病基因Pi67(t)的水稻品种杂交，并繁衍后代群体；

2)利用CTAB法提取上述群体中单个植株的基因组DNA，用所述引物组合进行PCR扩增，即能够获得片段长度为337bp的产物，则标志着所检测水稻样品携带抗稻瘟病基因Pi67(t)。

本发明的有益效果：

本发明是将北方粳稻品种GY8与辽星1号杂交，构建F8代重组自交系RILs群体，采用芯片技术，从GY8中定位到一个广谱抗稻瘟病基因Pi67(t)；抗稻瘟病基因Pi67(t)在水稻育种中已经得到应用，为提高该基因在育种过程中的选择效率和准确性，缩短育种周期，特发明与Pi67(t)紧密连锁的分子标记及其在水稻新品种选育过程中的应用方法，具体为：

1.本发明获得的与水稻抗稻瘟病基因Pi67(t)紧密连锁的分子标记，其鉴定的抗稻瘟病基因为在水稻品种GY8中定位的新基因，该基因已在在北方粳稻抗病育种中应用，后代材料抗稻瘟病性强。本发明的应用可显著提高Pi67(t)利用效率。

2.本发明提供的分子标记基于二代重测序结果开发，并经过一代测序验证，结果精确，特异性好。

3.本发明提供的分子标记位于抗病基因Pi67(t)的定位区域内，该区域为第12号染色体着丝粒附近，重组概率低，在遗传上与Pi67(t)连锁紧密，标记与基因共分离程度高。

4.本发明提供的分子标记为插入缺失(Indel)标记，且Indel片段长度为60bp，多态性好，便于通过琼脂糖凝胶电泳准确区分，且可同时鉴定出纯合体和杂合体，应用的成本低、操作简便、准确性高。

附图说明

图1为本发明实施例提供的抗稻瘟病基因Pi67(t)定位区域和Indel位点在水稻染色体上的位置图；

图2为本发明实施例提供的不同基因型在Indel位点的序列比对结果图。

图3为利用本发明实施例提供的Indel标记在两个亲本及其后代中进行PCR扩增的产物电泳条带图。

图4为本发明实施例提供的利用引物组合SEQ ID NO.2/SEQ ID NO.3在抗稻瘟病供体品种GY8和感病水稻品种辽星1号的PCR产物的序列比对结果。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。

实施例1水稻抗稻瘟病基因Pi67(t)的定位

利用抗稻瘟病水稻品种GY8与感稻瘟病水稻品种辽星1号杂交，从F₂代开始利用单粒传的方法构建重组自交系群体RILs，群体中包括197个株系。

将上述获得株系在辽宁省的稻瘟病诱发圃中种植，连续两年调查上述获得的群体中197个株系和两个亲本对稻瘟病的抗性；致病反应型和小种确定按全国稻瘟病菌生理小种联合试验组(1980)统一标准进行评定。调查记载标准为：

0级 无病……………………………………………高抗(HR)

1级 仅有针尖大小的褐点…………………………抗(R)

2级 稍大的褐点……………………………………抗(R)

3级 圆形稍大的灰色小病斑，病斑直径1～2mm…中抗(MR)

4级 典型纺锤形病斑，为害面积2％以……………中感(MS)

5级 典型病斑，为害面积3％～10％…………………中感(MS)

6级 典型病斑，为害面积11％～25％………………感(S)

7级 典型病斑，为害面积26％～50％………………感(S)

8级 典型病斑，为害面积51％～75％………………高感(HS)

9级 全部叶片枯死…………………………………高感(HS)

利用8K水稻基因芯片对两个亲本和197个株系的基因型进行检测，在水稻的12条染色体上共发现559个亲本间有差异的SNP。再利用QTL IciMapping软件，将GY8携带的抗稻瘟病基因定位到12号染色体的7.8M-13.2M范围内。利用重组自交系群体中含有定位区域的株系与感病亲本辽星1号回交构建回交群体,再从回交群体中筛选重组子，结合重组子的表型将定位区域缩小到第12号染色体10.18Mb-11.19Mb范围内，并将GY8携带的抗稻瘟病基因命名为Pi67(t)如图1所示。

实施例2与水稻抗稻瘟病基因Pi67(t)紧密连锁的分子标记的开发

利用二代重测序技术对携带抗稻瘟病基因Pi67(t)的水稻品系GY8和不携带该基因的水稻品种辽星1号进行重测序，获得平均覆盖深度大于30×的测序数据。通过比对两个品种的序列，发现两个水稻品种在抗稻瘟病基因Pi67(t)的定位区域内存在一个60bp的插入/缺失位点(Indel)如图2所示，抗稻瘟病基因Pi67(t)和Indel位点在染色体上的位置和序列，如图1、2所示。

由图1可见在抗稻瘟病基因Pi67(t)位于水稻第12号染色体10.18Mb-11.19Mb范围内，Indel位点位于定位区域内；由图2可见携带抗稻瘟病基因Pi67(t)的GY8和不携带基因Pi67(t)的辽星1号在两个Indel上的序列比对，与辽星1号相比GY8有60bp的插入。即为SEQID NO.1所示的水稻抗稻瘟病基因Pi67(t)紧密连锁的分子标记。

SEQ ID NO.1

AACTTTCACTTAGAGAGATTAATCAGAAATTTTAAATGTTGACTTTGTGGAAAACTGAAC

根据上述Indel位点两端序列设计一对引物组合，所述引物组合由如SEQ ID NO.2所示的DNA序列和如SEQ ID NO.3所示的DNA序列组成。SEQ ID NO.2正向引物Indel-F序列是5′-GGGAGGGTGGTCATTTTCTT-3′，SEQ ID NO.3反向引物Indel-R序列是5′-GCTGCAACCACTTCTTAGGC-3′。

利用上述获得引物对，对水稻品种GY8和辽星1号的基因组DNA分别进行PCR扩增。

反应体系如下：2×Taq PCR Master Mix(艾德莱PC0902)10μL，10μM的引物各0.5μL，100μg/mL的模板DNA 1μL，ddH₂O 8μL。

PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环,72℃延伸10min,4℃保存。

由上述PCR扩增产物可见，该引物对的PCR扩增产物包含该Inde区域，携带抗稻瘟病基因Pi67(t)的GY8的扩增产物为337bp而不携带基因Pi67(t)的辽星1号扩增产物为277bp，扩增产物序列比对结果如图4所示。该引物能够很好的区分抗病与感病的基因型。

实施例3与水稻抗稻瘟病基因Pi67(t)紧密连锁的分子标记的验证

以抗稻瘟病基因Pi67(t)的供体品种GY8和感病品种辽星1号为亲本，构建F₂群体，以辽宁地区流行的稻瘟病菌的混合菌对群体中的单株进行苗期人工接种，鉴定其对稻瘟病的抗性。并利用引物组合SEQ ID NO：2/SEQID NO：3对F₂群体各植株的基因型进行鉴定。

具体试验如下：

以抗稻瘟病基因Pi67(t)的供体品种GY8和感病品种辽星1号为亲本，构建F2群体为试材，种植于温室。将辽宁地区流行的稻瘟病菌ZA1、ZA9、ZB1和ZF1分别移植于燕麦片番茄汁琼脂培养基上，25-27℃条件下培养7d，待菌丝长满，用灭菌的棉签擦掉气生菌丝后保湿培养，稻瘟病菌会大量产孢。待7个品种稻苗长至5叶1心时，将上述扩繁培养的分生孢子用120ml无菌水清洗，用双层纱布过滤装入三角瓶中，配制孢子悬液(浓度为120倍显微镜视野下有20个左右孢子)，将上述5个稻瘟病菌小种混合，配制成混合菌孢子悬浮液，对试验材料进行喷雾接种。接种后用黑色塑料膜遮光、保湿12小时。于接种后10d调查，调查方法参照实施例1。同时提取F₂群体植株的基因组DNA，以引物组合SEQ ID NO：2/SEQID NO：3进行PCR扩增.PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环,72℃延伸10min,4℃保存。扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶中电泳,应用凝胶成像系统记录试验结果,扩增结果如图3所示。由图可见接种鉴定及基因扩增的结果表明，其中1-22号为GY8和辽星1号杂交的F2代部分株系，F₂群体中凡扩增产物中有1条长度约337bp片段的个体对稻瘟病均表现抗病，扩增产物仅有1条长度277bp的片段的个体对稻瘟病均表现为感病。基因型为杂合的植株扩增产物为2个大小分别为337bp和277bp的片段，表现为抗病。实施例结果表明，利用引物组合SEQ ID NO：2/SEQID NO：3可准确的筛选到携带抗稻瘟病基因Pi67(t)的植株，筛选效率达到100％。

实施例4与水稻抗稻瘟病基因Pi67(t)紧密连锁的分子标记的应用利用感病水稻品种辽星1号与上述实施例F₂中携带纯和Pi67(t)基因的单株(即2号植株)进行回交，获得BC₁F₂代材料。利用引物组合SEQ ID NO：2/SEQ ID NO：3对BC₁F₂代植株的基因组DNA进行PCR扩增，实施方法同实施例3。如果扩增产物仅为1条长度约337bp的片段，该单株具有纯和Pi67(t)。在携带纯和Pi67(t)植株的后代中进行株型和产量性状的筛选，选育出既携带抗稻瘟病基因又具有良好株型和产量性状的水稻品系。实施例结果表明，应用该分子标记能够从后代材料中快速准确鉴定出携带纯和Pi67(t)基因的水稻植株，加速水稻抗稻瘟病品种培育的进程。

序列表

<110> 辽宁省水稻研究所

<120> 一种抗稻瘟病基因Pi67(t)，及与其紧密连锁的共显性分子标记和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aactttcact tagagagatt aatcagaaat tttaaatgtt gactttgtgg aaaactgaac 60

Claims (7)

1.一种抗稻瘟病基因Pi67(t)，其特征在于：在水稻品种GY8的第12号染色体10.18Mb-11.19Mb区域内，携带抗稻瘟病基因Pi67(t)。

2.一种与权利要求1所述的抗稻瘟病基因Pi67(t)紧密连锁的共显性分子标记，其特征在于：分子标记为在水稻抗稻瘟病Pi67(t)的定位区域内存在一个60bp的插入位点，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种用于检测权利要求2所述分子标记的的引物组合，其特征在于：所述引物组合由如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3中碱基序列所示；其中，SEQ ID NO.2正向引物Indel-F序列是5′-GGGAGGGTGGTCATTTTCTT-3′，SEQ ID NO.3反向引物Indel-R序列是5′-GCTGCAACCACTTCTTAGGC-3′。

4.一种权利要求3所述的引物组合的应用，其特征在于：所述引物组合在选育携带抗稻瘟病基因Pi67(t)的水稻品种中的应用。

5.按权利要求3所述的引物组合的应用，其特征在于：

1)以携带抗稻瘟病基因Pi67(t)的水稻抗病品系GY8与其它不携带抗稻瘟病基因Pi67(t)的水稻品种杂交并繁衍后代群体；

2)提取上述所获得群体中单个植株的基因组DNA，用权利要求3所述引物组合进行PCR扩增，扩增产物的片段长度为337bp，则标志着所检测水稻样品携带抗稻瘟病基因Pi67(t)。

6.一种检测水稻品种是否携带Pi67(t)方法，其特征在于：

1)提取水稻样品基因组DNA；

2)利用权利要求3所述的引物组合对水稻样品基因组DNA进行PCR扩增；

3)扩增产物的片段长度为337bp，则标志着其样品基因组中携带抗稻瘟病基因Pi67(t)。

7.一种利用所述引物组合选育携带抗稻瘟病基因Pi67(t)的水稻品种的方法，其特征在于：

1)以携带抗稻瘟病基因Pi67(t)的水稻抗病品系GY8与其它不携带抗稻瘟病基因Pi67(t)的水稻品种杂交，并繁衍后代群体；

2)利用CTAB法提取上述群体中单个植株的基因组DNA，用所述引物组合进行PCR扩增，即能够获得片段长度为337bp的产物，则标志着所检测水稻样品携带抗稻瘟病基因Pi67(t)。

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