CN115961081B - 与玉米抗茎基腐病基因位点qFCR9紧密连锁的分子标记及其应用 - Google Patents
与玉米抗茎基腐病基因位点qFCR9紧密连锁的分子标记及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了与玉米抗茎基腐病基因位点qFCR9紧密连锁的分子标记及其应用，属于分子生物学及遗传育种。该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，在所述核苷酸序列的第21位碱基处，碱基突变为G或T；所述分子标记K1207与玉米抗茎基腐病基因位点qFCR9共定位于玉米9号染色体上，且位于Bin_9.004‑Bin_9.005区段内。本发明公开的分子标记K1207与抗茎基腐病基因位点qFCR9显著相关，呈现紧密连锁标记特征，用于分子标记辅助选择的准确性高，提高适应不同环境的玉米特定抗茎基腐病品种的选择鉴定效率，且成功率高，可大大加快玉米抗病品种的选育进程。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学及遗传育种领域，特别是涉及与玉米抗茎基腐病基因位点qFCR9紧密连锁的分子标记及其应用。
背景技术
玉米(Zea mays)是世界上重要的三大作物之一，作为一种兼具粮食、饲料和生物燃料的多功能作物。在我国，玉米的种植面积广，产量高，已成为我国第一大粮食作物。由镰孢菌(Fusarium spp.)的侵染造成的玉米茎基腐病严重制约玉米的产量，同时镰孢菌侵染后产生的脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮毒素严重影响玉米的品质。玉米茎基腐病又称玉米青枯病，在全世界玉米种植区域均有发生，在我国自70年代以来有不同程度的发现。目前，该病害已成为继玉米大斑病、小斑病和丝黑穗病后的主要病害之一，可在玉米全生育期进行侵染并发病。抗病玉米品种的选育和大规模种植是控制该病害最经济和有效的途径，通过分子辅助选择可快速培育茎基腐病抗性品种。
目前，在玉米和大麦中都有针对抗茎基腐病基因位点的相关报道，而在玉米中的报道相对较少。如，Liu等在4号和8号染色体上检测到两个与抗茎基腐病相关的QTL(Liu S,Fu J,Shang Z,Song X and Zhao M.2021Combination of genome-wide associationstudy and QTL mapping reveals the genetic architecture of fusarium stalk rotin maize.Front.Agron.,2:590374.doi:10.3389/fagro.2020.590374)。育种家正在利用这些少数的抗性基因进行育种，抗病背景日益狭窄。但在生产实践中，新的生理小种的出现致使已有抗病品种被克服，导致病害继续流行，造成经济损失。因此从玉米野生近缘属种大刍草中筛选新的抗病种质，发掘和定位新的广谱抗病基因或QTL，并分子辅助选择聚合多个抗病基因或QTL能够对病害起到广谱的抗性，满足抗病育种和生产实践的要求。
发明内容
本发明的目的是提供与玉米抗茎基腐病基因位点qFCR9紧密连锁的分子标记及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该分子标记与抗茎基腐病基因位点qFCR9显著相关，呈现紧密连锁标记特征，用于分子标记辅助选择的准确性高，提高适应不同环境的玉米特定抗茎基腐病品种的选择鉴定效率，且成功率高，可大大加快玉米抗病品种的选育进程。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供与玉米抗茎基腐病基因位点qFCR9紧密连锁的分子标记K1207，所述分子标记K1207的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，在所述核苷酸序列的第21位碱基处，碱基突变为G或T；
所述分子标记K1207与玉米抗茎基腐病基因位点qFCR9共定位于玉米9号染色体上，且位于Bin_9.004-Bin_9.005区段内。
本发明还提供一种引物组，包括用于扩增所述分子标记K1207的两条特异性正向引物和一条特异性反向引物，两条所述特异性正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-2所示，所述特异性反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
本发明还提供一种检测玉米抗茎基腐病基因位点qFCR9的试剂盒，包含所述的引物组。
本发明还提供一种所述的分子标记K1207或所述的引物组或所述的试剂盒的应用，用于如下任一项应用中：
(1)鉴定玉米抗茎基腐病基因位点qFCR9；
(2)筛选抗茎基腐病的玉米品种或品系；
(3)玉米分子标记辅助育种；
(4)改良玉米种质资源。
本发明还提供一种筛选含有玉米抗茎基腐病基因位点qFCR9的玉米株系方法，包括以下步骤：
以待测玉米样品的基因组DNA作为模板，利用所述的引物组对模板进行荧光定量PCR扩增，利用扩增结果判断玉米株系。
进一步地，所述荧光定量PCR扩增的反应体系为：2×KASP Mastermix 5μL，KASPAssay Mix 1.4μL，模板DNA 1μL、Dnase/RNase-free去离子水2.6μL；其中，所述KASP AssayMix包含如SEQ ID NO：1-3所示的引物组，所述引物组的体积比依次为2：2：5。
进一步地，所述荧光定量PCR扩增的程序为：95℃预变性15min；95℃变性20s，61℃退火延伸60s，循环10次，每次退火延伸温度降低0.6℃；95℃变性20s，55℃退火延伸40s，循环34次；25℃60s，采集荧光信号。
进一步地，若扩增结果显示所述分子标记K1207的碱基突变为G，则待测玉米样品为含有玉米抗茎基腐病基因位点qFCR9的玉米株系；若显示所述分子标记K1207的碱基突变为T，则待测玉米样品为不含有玉米抗茎基腐病基因位点qFCR9的玉米株系。
本发明还提供所述的方法在玉米分子育种、培育转基因玉米和玉米种质资源改良中应用。
本发明还提供所述的分子标记K1207或所述的玉米抗茎基腐病基因位点qFCR9在筛选抗茎基腐病的玉米品种或品系中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明首次公开了来源玉米近缘属种大刍草中的抗茎基腐病基因位点qFCR9，位于玉米9号染色体，显著提高了玉米抗茎基腐病能力。该基因位点在玉米抗病育种中具有较高的利用价值。本发明首次公开了基于荧光定量PCR平台精确检测玉米新抗茎基腐病qFCR9的分子标记K1207，且为共显性标记，检测准确高效、扩增方便稳定。本发明公开的分子标记K1207与抗茎基腐病基因位点qFCR9显著相关，呈现紧密连锁标记特征，用于分子标记辅助选择的准确性高，提高适应不同环境的玉米特定抗茎基腐病品种的选择鉴定效率，且成功率高，可大大加快玉米抗病品种的选育进程。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明玉米抗茎基腐病基因位点qFCR9在9染色体上的位置及与分子标记K1207之间的连锁遗传图谱；
图2为本发明实施例2中利用荧光定量PCR引物对玉米抗茎基腐病材料(Dip和BD017)和感茎基腐病材料(玉米B73和BD003)基因型分型的结果；
图3为本发明实施例3中利用荧光定量PCR引物对玉米BD017与BD003衍生的高代抗茎基腐病与感茎基腐病株系进行基因型分型的结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1玉米抗茎基腐病基因位点qFCR9的鉴定
在本发明中，玉米抗茎基腐病基因位点qFCR9是通过以下方法获得的：
(1)作图群体的构建
利用感病玉米亲本B73作为母本，以大刍草Dip为父本，构建杂交组合获得杂种F1，并以B73为轮回亲本，对收获后的杂种F1进行了一次回交，并从获得的后代中选择一个单株再进行一次回交，最后对收获的单穗采用单粒传法连续自交六代，并获得了1个玉米与大刍草的远缘杂交回交重组自交系群体(构建方法参考“Wang Q,Liao Z,Zhu C etal.2022Teosinte confers specific alleles and yield potential to maizeimprovement.Theor.Appl.Genet.,135:3545-3562.doi:10.1007/s00122-022-04199-5”)。
(2)温室鉴定所述亲本及群体植株的抗茎腐病表型
(a)禾谷镰刀菌孢子悬浮液的提取
将禾谷镰刀菌Fg接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基，25℃条件下培养5-7天；使用灭菌的细胞针划一个小菌块，放入100ml的CMC培养基中，28℃下180rpm振荡培养7天以上；已灭菌的双层纱布过滤掉菌丝，滤液在5000rpm下离心5min，收集孢子悬浮液于2.0ml离心管中；用1ml无菌ddH2O重悬孢子，5000rpm离心5min后弃上清；用1ml灭菌后的ddH2O重悬孢子，保存于-20℃备用；接种前，在孢子悬浮液中加入终浓度为0.1％的吐温20。
(b)温室接种及表型鉴定
将种子消毒发芽后种植在15×15×10cm3的黑色塑料盆内，在14天左右选择大小相近的玉米植株采用注射法接种，参照Sun等方法(Sun Y,Ruan X,Ma L,Wang F and GaoX.2018Rapid screening and evaluation of maize seedling resistance to stalkrot caused by Fusarium spp.Bio-protocol,8(10):e2859-e2859.doi:10.21769/BioProtoc.2859)有所改动，具体方法如下：
使用1ml注射器吸取0.1ml孢子悬浮液斜刺入玉米茎秆中。将种植玉米植株的花盆水平排列在100×80×10cm的塑料方盘中，并在托盘底部铺上一层纸巾并添加250ml无菌水，使纸巾完全湿润，以便保持托盘内的湿度维持在75％左右。利用塑料薄膜密封塑料方形托盘上以保持湿度，并在塑料薄膜上划6-8个均匀的条孔(长度约为2厘米)进行空气交换。最后，将接菌后的幼苗在24±2℃的14小时光照/10小时黑暗的条件下保持5天。每天检查湿度，及时补水，使湿度保持在75％左右。在接种5天后和10天后分别对各株系的茎基腐病症状进行病情鉴定，病情分级标准为：1级：没有观察到明显的菌丝，植株没有变色。2级：注射部位周围菌丝稀疏，感染部位周围组织开始腐烂。3级：注射部位周围菌丝明显，注射部位呈棕色，感染部位腐烂软化明显，茎部仍粗壮直立。4级：菌丝在感染部位2-3cm处向外扩张，接种部位腐烂，感染部位周围有明显的浸水现象。5级：接种部位明显出现块状白色菌丝，菌丝向上向下扩展，腐烂部分呈深褐色，举起后茎极易弯曲。(3)病情指数的计算根据公式：病情指数＝100×∑(调查株数×各株病情等级)/(调查总株数)，计算病情指数。
(3)用CTAB法提取所述的遗传作图群体的各株系的DNA，利用华大自主平台BGISEQ-500RS对双亲及215份BD群体进行重测序(方法参考“Wang Q,Liao Z,Zhu C etal.2022Teosinte confers specific alleles and yield potential to maizeimprovement.Theor.Appl.Genet.,135:3545-3562.doi:10.1007/s00122-022-04199-5”)，测序深度为10×，经过比对和SNP calling后，获得4,964,439高质量的SNP(缺失小于20％；最小等位基因频率大于5％)。根据SNP分型结果，对亲本和群体株系进行分型。亲本大刍草的基因型记为A，亲本玉米B73的基因型记为B。群体株系基因型来源于大刍草的记为A，来源于玉米B73的记为B。
(4)利用JoinMap 4作图软件将获得的所述群体基因型资料构建玉米分子遗传连锁图谱，寻找最优的标记数和标记顺序，确定后续使用的连锁群。利用软件MapQTL 6的区间作图法，并结合作图群体抗茎基腐病表型数据将抗茎基腐病基因位点qFCR9定位于9号染色体上一个0.28cM(侧翼标记Bin_9.004和Bin_9.005)的区段内(图1)，对应在玉米B73物理参考基因组(version 5；http://ftp.ebi.ac.uk/ensemblgenomes/pub/release-51/plants/fasta/zea_mays/dna)上9号染色体37569343-47021480bp的位置。
实施例2玉米抗茎基腐病基因位点qFCR9的分子标记的鉴定
1.DNA提取
试验材料选取大刍草Dip、玉米BD017、B73和BD003，其中，大刍草Dip和玉米BD017为抗病材料，玉米B73和BD003为感病材料；大刍草Dip和玉米B73为抗茎基腐病基因位点qFCR9作图群体亲本材料，玉米BD017和BD003为实施例1中大刍草Dip与玉米B73构建的回交群体中的两个衍生后代材料。采用CTAB法提取玉米样品两叶期的叶片DNA。
2、玉米抗茎基腐病基因位点qFCR9的分子标记的鉴定
2.1引物设计
通过设计引物，扩增抗茎基腐病基因位点qFCR9基因组区段内的基因序列，利用克隆测序鉴定抗病材料BD017和Dip与感病材料B73和BD003之间的SNP差异位点。利用DNAMAN6.0软件设计荧光定量PCR引物。荧光定量PCR引物设计标准：扩增引物长度18～30bp，扩增产物长度45-70bp，退火温度57-62℃，GC含量在40％～60％之间。合成引物序列为：
正向引物1(K1207-F1)：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTagaaggcagagcacgagcagG-3’(SEQ ID NO:1)；
正向引物2(K1207-F2)：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTagaaggcagagcacgagcagT-3’(SEQ ID NO:2)；
反向引物(K1207-R)：5’-AGTGACCCACATCACGAGTCC-3’(SEQ ID NO:3)；
其中下划线部分为FAM标签序列，波浪线部分为HEX标签序列。
2.2荧光定量PCR平台测试引物及其亲本间的差异性
(1)提取大刍草Dip、玉米BD017、B73、BD003和两叶期的叶片DNA。
(2)以待测玉米的基因组DNA为模板，基于KASP检测平台技术设计引物，进行荧光定量PCR扩增；
其中，步骤2的引物序列如SEQ ID NO:1-3所示：
并且，引物K1207-F1和K1207-F2的5’端分别连有不同的荧光基团。
(3)荧光定量PCR扩增反应体系：2×KASP Mastermix 5μL，KASP Assay Mix 1.4μL，浓度为100ng/μL的模板DNA1μL、Dnase/RNase-free去离子水2.6μL；其中，KASP AssayMix中含有引物K1207-F1、K1207-F2和K1207-3，体积比为2:2:5。即，在KASP Assay Mix中，将浓度为100μM的引物K1207-F1、K1207-F2和K1207-R按2:2:5体积比混合。
(4)荧光定量PCR程序：95℃预变性15min；95℃变性20s，61℃退火延伸60s，循环10次，每次退火延伸温度降低0.6℃；95℃变性20s，55℃退火延伸40s，循环34次；25℃60s，采集荧光信号。
将PCR扩增产物进行测序，测序结果如下：
注：阴影部分为突变碱基位点，【N】代表G/T。
(5)分析PCR产物的具体方法如下：大刍草Dip和玉米BD017显示FAM荧光的植物基因型(即SEQ ID NO:4所示序列突变碱基为G)，记为A型，为含有玉米抗茎基腐病基因的株系，玉米B73和BD003表现为HEX的荧光信号(即SEQ ID NO:4所示序列突变碱基为T)的植物基因型记为B型，为不含有玉米抗茎基腐病基因的株系。大刍草Dip、玉米BD017、B73和BD003用K1207引物做基因型分型的结果见图2。
实施例3玉米抗茎基腐病基因位点qFCR9的分子标记的应用
(1)群体检测过程中引物序列K1207-F1/F2/R的适用性
以玉米BD017为母本，玉米BD003为父本杂交得到F1，F1自交获得F2，通过单粒传法加代至F6代重组自交系群体。
(2)温室鉴定所述亲本及群体植株的抗茎腐病表型。
(a)禾谷镰刀菌孢子悬浮液的提取
将禾谷镰刀菌Fg接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基，25℃条件下培养5-7天；使用灭菌的细胞针划一个小菌块，放入100ml的CMC培养基中，28℃下180rpm振荡培养7天以上；已灭菌的双层纱布过滤掉菌丝，滤液在5000rpm下离心5min，收集孢子悬浮液于2.0ml离心管中；用1ml无菌ddH2O重悬孢子，5000rpm离心5min后弃上清；用1ml灭菌后的ddH2O重悬孢子，保存于-20℃备用；接种前，在孢子悬浮液中加入终浓度为0.1％的吐温20。
(b)温室接种及表型鉴定
将种子消毒发芽后种植在15×15×10cm3的黑色塑料盆内，在14天左右选择大小相近的玉米植株采用注射法接种，参照Sun等方法(Sun Y,Ruan X,Ma L,Wang F and GaoX.2018 Rapid screening and evaluation of maize seedling resistance to stalkrot caused by Fusarium spp.Bio-protocol,8(10):e2859-e2859.doi:10.21769/BioProtoc.2859)有所改动，具体方法如下：
使用1ml注射器吸取0.1ml孢子悬浮液斜刺入玉米茎秆中。将种植玉米植株的花盆水平排列在100×80×10cm的塑料方盘中，并在托盘底部铺上一层纸巾并添加250ml无菌水，使纸巾完全湿润，以便保持托盘内的湿度维持在75％左右。利用塑料薄膜密封塑料方形托盘上以保持湿度，并在塑料薄膜上划6-8个均匀的条孔(长度约为2厘米)进行空气交换。最后，将接菌后的幼苗在24±2℃的14小时光照/10小时黑暗的条件下保持5天。每天检查湿度，及时补水，使湿度保持在75％左右。在接种5天后和10天后分别对各株系的茎基腐病症状进行病情鉴定，病情分级标准为：1级：没有观察到明显的菌丝，植株没有变色。2级：注射部位周围菌丝稀疏，感染部位周围组织开始腐烂。3级：注射部位周围菌丝明显，注射部位呈棕色，感染部位腐烂软化明显，茎部仍粗壮直立。4级：菌丝在感染部位2-3cm处向外扩张，接种部位腐烂，感染部位周围有明显的浸水现象。5级：接种部位明显出现块状白色菌丝，菌丝向上向下扩展，腐烂部分呈深褐色，举起后茎极易弯曲。(3)病情指数的计算根据公式：病情指数＝100×∑(调查株数×各株病情等级)/(调查总株数)，计算病情指数。
(3)群体检测过程中引物序列K1207-F1/F2/R的适用性
(a)提取上述群体中鉴定到的极端抗病材料与感病材料各4株系两叶期的叶片DNA。
(b)以步骤(a)所得的DNA作为模板，基于KASP检测平台技术设计引物，进行荧光定量PCR扩增。
(c)荧光定量PCR扩增反应体系：2×KASP Mastermix 5μL，KASP Assay Mix 1.4μL，浓度为100ng/μL的模板DNA1μL、Dnase/RNase-free去离子水2.6μL；其中，KASP AssayMix中含有引物K1207-F1、K1207-F2和K1207-3，体积比为2:2:5。即，在KASP Assay Mix中，将浓度为100μM的引物K1207-F1、K1207-F2和K1207-R按2:2:5体积比混合。
(4)荧光定量PCR程序：95℃预变性15min；95℃变性20s，61℃退火延伸60s，循环10次，每次退火延伸温度降低0.6℃；95℃变性20s，55℃退火延伸40s，循环34次；25℃60s，采集荧光信号。
(5)分析PCR产物的具体方法如下：含有玉米抗茎基腐病基因位点qFCR9的玉米品种均出现与玉米BD017相同的基因型，记为A型，而不含有玉米抗茎基腐病基因位点qFCR9的玉米品种均出现与玉米BD017明显不同的荧光信号，记为B型，结果如图3所示。结果表明，实际结果与预期结果一致，说明本发明的玉米抗茎基腐病基因位点qFCR9确实具有显著增强玉米抗茎基腐病能力的作用，且分子标记K1207可以用于跟踪鉴定玉米抗茎基腐病基因位点qFCR9。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (8)
1.一种分子标记K1207在筛选抗茎基腐病的玉米品种或品系中的应用，其特征在于，所述分子标记K1207的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，在所述核苷酸序列的第21位碱基处，碱基突变为G或T；
若所述分子标记K1207的碱基突变为G，则玉米品种或品系为抗茎基腐病的玉米品种或品系；若所述分子标记K1207的碱基突变为T，则玉米品种或品系为非抗茎基腐病的玉米品种或品系。
2.一种引物组，其特征在于，包括用于扩增权利要求1中所述分子标记K1207的两条特异性正向引物和一条特异性反向引物，两条所述特异性正向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：1-2所示，所述特异性反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
3.一种检测权利要求1中所述分子标记K1207的试剂盒，其特征在于，包含权利要求2所述的引物组。
4.一种权利要求1中所述的分子标记K1207或权利要求2所述的引物组或权利要求3所述的试剂盒的应用，其特征在于，用于如下任一项应用中：
（1）筛选抗茎基腐病的玉米品种或品系；
（2）玉米分子标记辅助育种；
（3）改良玉米种质资源。
5.一种筛选抗茎基腐病的的玉米株系方法，其特征在于，包括以下步骤：
以待测玉米样品的基因组DNA作为模板，利用权利要求2所述的引物组对模板进行荧光定量PCR扩增，利用扩增结果判断玉米株系；
若扩增结果显示权利要求1中的所述分子标记K1207的碱基突变为G，则待测玉米样品为抗茎基腐病的玉米株系；若扩增结果显示所述分子标记K1207的碱基突变为T，则待测玉米样品为非抗茎基腐病的玉米株系。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR扩增的反应体系为：2×KASP Mastermix 5μL，KASP Assay Mix 1.4μL，模板DNA 1μL、Dnase/RNase-free去离子水2.6μL；其中，所述KASP Assay Mix包含如SEQ ID NO：1-3所示的引物组，如SEQ ID NO：1所示的引物、如SEQ ID NO：2所示的引物和如SEQ ID NO：3所示的引物的体积比依次为2：2：5。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR扩增的程序为：95℃预变性15min；95℃变性20s，61℃退火延伸60s，循环10次，每次退火延伸温度降低0.6℃；95℃变性20s，55℃退火延伸40s，循环34次；25℃ 60s，采集荧光信号。
8.根据权利要求5-7任一项所述的方法在玉米分子育种、培育转基因玉米和玉米种质资源改良中应用。
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