CN112941232B

CN112941232B - 一种小麦赤霉病抗性相关分子标记及其应用

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Publication number: CN112941232B
Application number: CN202110473947.4A
Authority: CN
Inventors: 胡文静; 高德荣; 张勇; 陆成彬; 吴宏亚; 刘健; 张春梅; 李东升
Original assignee: JIANGSU LIXIAHE REGION AGRICULTURAL RESEARCH INSTITUTE
Current assignee: JIANGSU LIXIAHE REGION AGRICULTURAL RESEARCH INSTITUTE
Priority date: 2021-04-29
Filing date: 2021-04-29
Publication date: 2021-12-14
Anticipated expiration: 2041-04-29
Also published as: CN112941232A

Abstract

本发明公开了一种小麦赤霉病抗性相关分子标记及其应用。利用Wheat55K小麦高通量基因芯片获取基因型数据，检测到来源于扬麦4号的1个与赤霉病抗性相关的主效QTL位点QFhb‑6B‑YM4，其紧密连锁标记是AX111634185，并据此开发了1个KASP标记引物组，用以对赤霉病抗性高低进行高效筛选。通过本发明的引物组对小麦基因组DNA进行PCR扩增，可以直接通过KASP分型判断是否携带扬麦4号的赤霉病抗性高的基因，检测方法操作简单，检测结果非常直观，检测效果明显有效，利用该分子标记进行筛选可以大大提高分子标记辅助选择赤霉病抗性高低的小麦育种工作效率。

Description

一种小麦赤霉病抗性相关分子标记及其应用

技术领域

本发明属于小麦抗赤霉分子标记技术领域，涉及一种小麦赤霉病抗性相关分子标记及其应用。

背景技术

小麦赤霉病是一种世界性病害，主要由禾谷镰刀菌(Fusarium gramin earum)等引起，于小麦开花期侵染穗部小花，在籽粒灌浆成熟过程中不断扩展，产生和积累各种毒素，例如脱氧雪腐镰孢菌烯醇(deoxynivalenol，DON)、雪腐镰孢菌烯醇(nivalenol，NIV)和玉米赤霉烯酮(zearalenol，ZEN)；甚至扩展到穗轴，影响营养物质和水分运输，严重时导致枯白穗、籽粒干瘪，进而降低小麦产量、损害品质，毒素污染更会对人、畜健康造成巨大伤害，成为粮食安全的主要威胁。

小麦抗赤霉病的表现形式可分为5类：第一类为抗侵染(resistance toinvasion，type I)、第二类为抗扩展(resistance to spreading，type II)；第三类为籽粒抗感染(resistance to kernel infection,type III)、第四类为耐病性(toleranceagainst FHB and trichothecenes,type IV)、第五类为抗毒素积累(resistance totrichothecene accumulation，type V)。国内外学者长期以来致力于发掘小麦抗赤霉病基因/QTL，已知定位到的与5种抗性类型有关的数量性状位点(Quantitative traits loci，QTL)有200多个，分布在小麦21条染色体上，但是目前被命名的主效抗赤霉病基因只有7个，分别是Fhb1、Fhb2～Fhb7。这些已命名的抗赤霉病基因有来自苏麦3号和望水白3B染色体上的Fhb1、6B染色体上的Fhb2，大赖草7Lr#1S染色体上的Fhb3，望水白4B染色体的Fhb4和5A染色体的Fhb5，披碱草属1E(ts)#1S的Fhb6，以及长穗偃麦草7E染色体的Fhb7。虽然苏麦3号、望水白以及前面提到的一些远缘种质携带抗赤霉病主效基因的，但是这些材料的综合农艺性状差、丰产性差，与其他品种杂交后代普遍存在植株太高、易倒伏、穗子小、穗密度稀等较难克服的缺点因此无法大面积推广应用，已有报道表明，在利用一些抗源进行抗病育种时，由于抗源本身的抗病性与农艺性状存在不利连锁，会导入一些不利基因从而加大育种的难度。目前还未有利用这些材料选育出丰产性好、推广面积大的抗赤霉病品种的先例。

程顺和等提出2条抗赤霉病育种的技术路线，第2条路线的重点是亲本必须兼具丰产性和赤霉病轻的特点，对后代一方面抗赤性鉴定以中感—中抗为选择标准，另一方面是侧重丰产性，例如江苏里下河地区农科所在不同来源(冬、春性，欧、美)的种质中选用综合丰产性好、赤霉病轻的亲本进行配组，后代注重综合丰产性，兼顾以抗赤霉病为主的抗病和抗逆性选择，育成了一批中抗赤霉病的大面积丰产小麦品种，如扬麦4号，1983年小麦生长后期阴雨连绵，赤霉病重发，扬麦4号仍表现较好的丰产性，后又利用扬麦4号的抗赤与丰产协调的特性育成了扬麦5号、扬麦158等，尤其扬麦158集高产、多抗、优质、广适应性于一体的突破性小麦新品种，是我国南方麦区小麦育种继扬麦5号后又一重大突破。初步解决了世界小麦既大面积丰产又抗赤霉病的难题。成为上世纪90年代以来长江中下游冬麦区推广最大的当家品种，“是抗赤育种最成功的范例”，最大种植面积达2220万亩，是我国20世纪末种植面积最大的品种，也是长江中下游历史上推广速度最快、覆盖率最高的小麦品种，它的育成与推广促成了长江下游建国以来小麦品种第六次大面积更换，累计种植1.6亿亩以上，增产粮食56.3亿公斤，增加经济效益70亿元以上，为20世纪末我国粮食总产达5000亿公斤的战略目标发挥了重要作用，国家科委评价“扬麦158的育成是我国科技界继‘中国04机’之后为经济建设服务取得的又一重大成果”。扬麦5号和扬麦158这两个品种均获得国家科学技术发明一等奖。表明扬麦4号在小麦遗传改良中可以作为优良的抗赤霉病亲本使用。经Fhb1的功能标记检测表明，扬麦4号不含Fhb1，本实验室也通过研究发现扬麦4号不携有Fhb1—Fhb7这7个已知的抗赤霉病基因，可能存在其他不止1个主效抗赤霉病基因。因为扬麦4号的综合农艺性状和抗病性优良，其抗病性和抗病基因与农艺性状不存在连锁累赘，具有巨大的育种应用价值，因此，挖掘主栽品种扬麦4号的抗赤霉病基因，拓宽小麦赤霉病抗源，对培育赤霉病抗性好的并且产量潜力大的小麦品种具有重要意义。

分子标记辅助选择育种可在DNA水平针对目标性状进行选择，不仅结果稳定，而且可在苗期进行选择，操作简便，有利于育种早代选择。单核苷酸多态性(SNP)标记具有遗传稳定、数量多、分布广且易于检测等特点，适合于数量庞大的检测分析，目前市场中已存在多种适用于不同动植物的SNP芯片，在遗传育种中发挥十分重要的作用。通过遗传分析挖掘到重要性状的连锁标记后，需要将其转化为易于使用的分子标记。Kompetitive Allel eSpecific PCR(KASP)标记技术通过荧光探针，可以将SNP标记的不同等位变异区分，通量高、快速、稳定，是一种育种使用便捷的分子标记。

经过多年性状考察发现，扬麦4号的赤霉病发病平均病小穗率大约是18.78％—21.56％。相比而言，偃展1号是豫西农作物品展中心育成的小麦品种，赤霉病偏重，赤霉病发病平均病小穗率大约是45.91％—57.36％，扬麦4号呈现的是赤霉病抗性显著的高于普通小麦和偃展1号的赤霉病抗性，因此挖掘扬麦4号控制赤霉病抗性的主效QTL并开发成可供育种使用的连锁分子标记对于分子标记辅助选择赤霉病抗性高低的小麦育种工作十分重要。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种可供分子标记辅助选择赤霉病抗性高低的小麦育种使用的连锁分子标记。本发明利用Wheat55K小麦高通量基因芯片获取基因型数据，检测到来源于扬麦4号的1个与赤霉病抗性相关的主效QTL位点QFhb-6B-YM4，其紧密连锁标记是AX111634185，并据此开发了1个KASP标记引物组，用以对赤霉病抗性高低进行高效筛选。

第一方面，本发明提供了用于检测小麦基因组中染色体6B上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是AA、还是GG、还是A和G的物质在如下任一中的应用：

(A)鉴定或辅助鉴定小麦抗赤霉病性状；

(B)比较待测小麦籽粒的赤霉病抗性强弱；

(C)选育或筛选赤霉病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种；

(D)选育或筛选赤霉病抗性相对较弱小麦单株或株系或品系或品种；

(E)制备用于比较待测小麦赤霉病抗性强弱的产品；

(F)制备用于选育或筛选赤霉病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种的产品；

(G)制备用于选育或筛选赤霉病抗性相对较弱的小麦单株或株系或品系或品种的产品。

进一步地，所述用于检测小麦基因组中染色体6B上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是AA、还是GG、还是A和G的物质为成套引物或含有所述成套引物的试剂或试剂盒；

进一步地，所述成套引物中含有两条上游引物和一条下游引物；

进一步地，所述上游引物根据所述小麦基因组中染色体6B上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸及其上游序列进行设计，且一条所述上游引物的3’末端脱氧核糖核苷酸为所述小麦基因组中染色体6B上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸A，另一条所述上游引物的3’末端脱氧核糖核苷酸为所述小麦基因组中染色体6B上SEQ IDNo.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸G；

所述下游引物根据所述小麦基因组中染色体6B上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸的下游序列进行设计。

进一步地，所述成套引物为由SEQ ID No.1的第22-43位所示的单链DNA分子或其衍生物、SEQ ID No.2的第22-43位所示的单链DNA分子或其衍生物和SEQ ID No.3所示的单链DNA分子组成的成套引物。

进一步地，所述SEQ ID No.1的第22-43位所示的单链DNA分子的衍生物为SEQ IDNo.1的第36-43位所示的单链DNA分子的5'端连接特异荧光标签序列A；所述SEQ ID No.2的第22-43位所示的单链DNA分子的衍生物为SEQ ID No.2的第36-43位所示的单链DNA分子的5'端连接特异荧光标签序列B。

进一步地，所述试剂或试剂盒中还含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B；所述荧光探针A为与所述特异荧光标签序列A一致的序列，5’末端连接荧光报告基团A；所述淬灭探针A为所述特异荧光标签序列A的反向互补序列，3’末端连接荧光淬灭基团；所述荧光探针B为与所述特异荧光标签序列B一致的序列，5’末端连接荧光报告基团B；所述淬灭探针B为所述特异荧光标签序列B的反向互补序列，3’末端连接荧光淬灭基团；

进一步地，所述特异荧光标签序列A为荧光标签序列FAM，所述特异荧光标签序列B为荧光标签序列HEX；所述荧光报告基团A为FAM，所述荧光报告基团B为HEX；所述荧光淬灭基团为BHQ。

另一方面，本发明还提供了如下任一方法：

方法A：一种检测小麦基因组中染色体6B上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是AA、还是GG、还是A和G的方法，包括如下步骤(A1)或(A2)：

(A1)直接测序；

(A2)用本发明第一方面所述的试剂或试剂盒对待测小麦基因组DNA进行PCR扩增，将所扩增的产物进行荧光信号扫描，对扫描数据进行分析，然后按照如下确定所述待测小麦基因中染色体6B上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是AA、还是GG、还是A和G：

若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析显示为蓝色，则所述待测小麦基因组中染色体6B上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是G的纯合体；

若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析显示为红色，则所述待测小麦基因组中染色体6B上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A的纯合体；

若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析显示为绿色，则所述待测小麦基因组中染色体6B上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A和G的杂合体；

方法B：一种比较待测小麦赤霉病抗性的方法，包括如下步骤：

(B1)检测小麦基因组中染色体6B上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是AA还是GG还是A和G；

(B2)按照如下确定所述待测小麦赤霉病抗性：基因组中染色体6B上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A的纯合体的所述待测小麦赤霉病抗性强于基因组中染色体6B上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是G的纯合体或者是A和G的杂合体的所述待测小麦的赤霉病抗性；

方法C：一种选育或筛选赤霉病抗性相对较强的小麦单株或株系或品系或品种的方法，包括如下步骤：

(C1)检测小麦基因组中染色体6B上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是AA还是GG还是A和G；

(C2)选择基因组中染色体6B上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A的纯合体的待测小麦作为亲本进行选育，并在育种各世代选择基因组中染色体6B上SEQID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A的纯合体的小麦，最终获得赤霉病相对较强的小麦单株或株系或品系或品种；

方法D：一种选育或筛选赤霉病抗性相对较弱的小麦单株或株系或品系或品种的方法，包括如下步骤：

(D1)检测小麦基因组中染色体6B上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是AA还是GG还是A和G；

(D2)选择基因组中染色体6B上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是G的纯合体的待测小麦作为亲本进行选育，并在育种各世代选择基因组中染色体6B上SEQID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是G的纯合体的小麦，最终获得赤霉病抗性相对较弱的小麦单株或株系或品系或品种。

进一步地，所述方法B、所述方法C和所述方法D，所述检测小麦基因组中染色体6B上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是AA还是GG还是A和G的方法为所述方法A。

另一方面，本发明还提供了具有如下(A)-(D)中至少一种功能的物质，为本发明第一方面中所述的用于检测小麦基因组中染色体6B上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是AA还是GG还是A和G的物质；

(A)鉴定或辅助鉴定小麦抗赤霉病性状；

(B)比较待测小麦籽粒的赤霉病抗性强弱；

(D)选育或筛选赤霉病抗性相对较弱小麦单株或株系或品系或品种。

另一方面，本发明还提供了上述所有的方法或上述的物质在培育或筛选具有如下性状中至少一种的小麦品种中的应用：

(a)赤霉病抗性相对较强；

(b)赤霉病抗性相对较弱。

另一方面，本发明还提供了上述所有的方法或上述的物质在小麦分子标记辅助育种中的应用。

在本发明中，所述赤霉病抗性相对较强是指当所比较的小麦中基因组上其他影响赤霉病抗性的位点的效应相等时，基因组中染色体6B上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A的纯合体的待测小麦的赤霉病抗性相对于基因组中染色体6B上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是G的纯合体的待测小麦的赤霉病抗性更强。

在本发明中，所述赤霉病抗性相对较弱是指当所比较的小麦中基因组上其他影响赤霉病抗性的位点的效应相等时，基因组中染色体6B上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是G的纯合体的待测小麦的赤霉病抗性相对于基因组中染色体6B上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是A的纯合体的待测小麦的赤霉病抗性更弱。

在前文各方面中，所述小麦可为但不限于国内外育成六倍体小麦品种(系)中的任一种或任几种。

本发明相对于现有技术而言，本发明利用Wheat55K小麦高通量基因芯片获取基因型数据，在6B染色体上检测到来源于扬麦4号的1个与赤霉病抗性相关的主效QTL位点QFhb-6B-YM4，其紧密连锁标记是AX111634185。在此研究基础上，本发明将其区间SNP标记AX111634185转化为可用于高通量、低成本和低失误率地检测或辅助检测赤霉病抗性强弱的KASP标记，并进一步开发了KASP标记专用引物组YM4-6B-Fhb。通过实验证明：本发明所述KASP分子标记可用于小麦赤霉病抗性的主效QTL QFhb-6B-YM4的分子标记辅助选择育种。本发明为抗赤霉病的QTL位点QFhb-6B-YM4在育种中有效利用提供了良好工具，这个标记可快速对小麦赤霉病抗性进行筛选，为筛选携带优异等位变异的小麦材料提供便捷，提高育种效率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为6B染色体的部分遗传连锁图谱及赤霉病抗性QTL定位示意图。

图2为实施例1中KASP标记验证部分RIL家系的试验标记扩增检测结果示意图。

图3实施例2中KASP标记应用在小麦赤霉病鉴定圃的部分全国小麦品种(系)赤霉病抗性基因型的试验标记扩增检测结果。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。

实施例1筛选稳定的显著与赤霉病抗性相关的SNP位点并且验证

本实施例以151份来源于“扬麦4号×偃展1号”的重组自交系(F₁₀)为材料，2017年和2018年连续2个生长季将该重组自交系及其亲本种植于江苏里下河地区湾头实验基地赤霉病鉴定圃。采用随机区组设计，每个系单行种植，每行50粒，行长2.0m，行距0.23m，两次重复，常规大田管理。进一步于2018年和2019年在田间进行利用传统的小麦赤霉病抗性接种鉴定，制备赤霉菌孢子悬浮液(1×10⁵—5×10⁵孢子mL^–1)，采用单花滴注法接种，于小麦开花初期，用注射器吸取10μL孢子液注入麦穗自顶部小穗开始自上而下第6个小穗的任意一个小花中，每个品种接种30个穗子。接种后采用人工弥雾保湿(每半小时喷弥雾5min)。接种21天后调查接种穗的病小穗数，计算病小穗率。病小穗率＝发病小穗数/总小穗数×100％。抗病调查和鉴定标准按照《中华人民共和国农业行业标准NY/T 2954-2016：小麦区域试验品种抗赤霉病鉴定技术规程》。

采用CTAB法提取基因组DNA，利用illumina90K芯片获取基因型，并构建遗传图谱。采用中国农业科学院作物科学研究所与中玉金公司合作开发的小麦55K芯片对试验材料进行基因组扫描，利用IciMapping v4.1软件(http://www.isbreeding.net)过滤和去冗余基因型数据。利用JoinMap v4.0构建和校正遗传图谱，利用MapChart2.3(https://www.wur.nl/en/show/Mapcha rt.htm)绘制遗传图谱。利用IciMapping v4.1的完备区间作图法(Inclusive composite interval mapping，ICIM)检测与赤霉病抗性显著相关的QTL，LOD阈值设为2.5。为了与前人结果比较，将连锁标记或者基因序列与中国春参考基因组序列的EnsemblPlants数据库(http://plants.ensembl.org/)进行比对。

实验获得1个相对稳定的与赤霉病抗性相关的位点QFhb-6B-YM4，增效基因来源于扬麦4号，即增加赤霉病抗性、降低病小穗率的基因来源于扬麦4号，QTL峰值位置在6B染色体上33.60cM—34.00cM，对应标记区间为AX109482211—AX111634185(附图1、表1)，相距0.4个cM，位置较精细，表型贡献率达到11.35％—13.09％。

表1 QFhb-6B-YM4对抗赤霉病的遗传效应及其侧翼标记

如图1所示，本申请通过QTL作图检测到1个增效基因来源于扬麦4号的与赤霉病抗性相关的位点QFhb-6B-YM4，QTL峰值位置在6B染色体上33.60cM—34.00cM，两年对应标记区间均为AX109482211—AX1116341856，经过与小麦参考基因组比对发现位于小麦6B染色体短臂27.97Mb—29.64Mb附近，与前人报道的位于6B染色体的抗赤霉病位点完全不一致。进一步从QTL区间中依据标记同源性初步筛选SNP标记，选择区间中特异性高、与赤霉病抗性相关性最高的SNP标记进行KASP标记转化，确定6B上27.97Mb处的AX111634185标记的基因组特异性最好、与赤霉病抗性相关性最显著，其侧翼序列是SEQ ID NO:4，利用Polymarker(http://pol ymarker.tgac.ac.uk/)进行KASP引物设计，引物由北京嘉程生物科技有限公司合成。最终成功将AX111634185标记转化为KASP标记YM4-6B-Fhb，其对应的变异位点是A/G，即核苷酸序列5-’CTCTGTTTTGCTTCTTGTG GGGAATAGCCAAGTAA[A/G]TATGCGGAATTGAGTTTACACATGCTACT CTACTT–3’(SEQ ID NO.4)自5’端起第36位碱基存在A/G等位基因(SNP)位点，小麦育种来说，赤霉病抗性高的是优势等位变异，扬麦4号携有优势等位变异A，携有等位基因A的小麦赤霉病抗性高于含有等位基因G的小麦。

本实施例针对该SNP位点设计YM4-6B-Fhb引物组，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的引物1，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的引物2，以及核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的引物3。其中引物3作为共用引物，为下游引物，引物1和引物2为上游引物。下游引物(引物3)保证了PC R扩增的6B染色体特异性，上游引物(引物1和引物2)的3’末端为标记AX111634185的等位变异碱基A/G。

KASP标记引物工作液的制备：

取上游引物(核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示)各12μL(100μM)，取下游引物(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)30μL(100μM)，用无菌超纯水补充至100μL，充分混匀，作为KASP标记的引物工作液，备用。

PCR扩增反应体系：待测小麦DNA模板2μL(约30ng/μL)、引物工作液0.08μL、KASPMaster Mix 2.5μL(LGC公司，KBS-1016-002)，用无菌超纯水补充至5μL；

PCR反应程序：第一步，95℃预变性15min；第二步，95℃变性20s、65–57℃(每个循环下降1℃)60s，共9个循环；第三步，95℃变性20s、57℃复性1min，32个循环；10℃保存。实验同时设置反应体系中不添加模板DNA的空白对照(NTC)，每个板设置1个或多个空白对照。

取小麦幼苗，采用CTAB法提取待测小麦基因组DNA(参考文献：Stacey J,Isaac PG.Isolation of DNA from plants.Methods Mol.Biol.1994,28:9–15.)

以待测小麦基因组DNA为模板，采用如上KASP引物组、PCR试剂进行PCR扩增，获得PCR扩增产物。PCR反应在S1000^TMThermal Cycler PCR仪(Bio-Rad Laboratories Inc.)上进行，用多功能酶标仪(PHERAsta r Plus,BMG LABTECH，Germany)对PCR扩增产物进行扫描读取荧光值。FAM激发波长为485nm，发射波长为520nm；VIC激发波长为535nm，发射波长为556nm，系统参比荧光ROX激发波长为575nm，发射波长为610nm。采用Kluster Caller软件(KBioscience)进行基因分型，根据分析结果确定赤霉病抗性相关位点连锁的SNP标记AX111634185的基因型。

151份“扬麦4号×偃展1号的重组自交系”连同两个亲本按照如上方法进行扩增，检测结果如附图3所示。扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集在分型结果荧光信号坐标系中靠近X轴的位置(蓝色)，与扬麦4号相同，即证明这些小麦在分子标记AX111634185侧翼核苷酸序列(如SEQ ID NO.5)的第36位碱基(SNP位点)的基因型为A；而扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集在坐标系中靠近Y轴的位置(红色)，与扬麦4号分型不同，则证明这些小麦在该SNP位点的基因型为G；附图3中左下角显示为黑色的样本为空白对照。151个家系连同两个亲本的KASP检测结果、2018年和2019年两年的大田试验赤霉病平均病小穗率结果如表2、表3和图2所示。

表2 151个家系和亲本的赤霉病平均病小穗率和KASP分型结果

由表2可见，含有等位基因A的小麦赤霉病抗性高于含有等位基因G的小麦。

表3携带AX111634185不同基因型的RIL家系的平均病小穗率T测验结果

表3所示利用Excel 2019的双样本T测验151个RIL家系的基因型和表型，结果表明：扬麦4号基因型为A，偃展1号基因型为G，151个家系中基因型为G的家系比基因型为A的家系赤霉病平均病小穗率降低39.64％，在p<0.01水平上有显著差异，说明上述KASP标记YM4-6B-Fhb的引物组及基因型检测体系可以应用于小麦赤霉病抗性分子标记辅助育种中(表3统计方法为本领域常规方法，具体也可以参见文献“盖钧镒，《试验统计方法》，中国农业出版社，2000年9月”中公开的内容)。附图3显示材料分型结果良好，材料分型与芯片检测数据完全一致，说明KASP标记开发成功，可进一步用于育种材料检测。

实施例2KASP引物组育种应用

田间试验：本实施例以来源于全国122个小麦品种(系)于2018年和2019年种植于江苏里下河地区农科所湾头实验基地的小麦赤霉病鉴定圃，进一步利用传统的小麦赤霉病抗性接种鉴定在田间进行，制备赤霉菌孢子悬浮液(1×10⁵—5×10⁵孢子mL^–1)，采用单花滴注法接种，于第二年和第三年的小麦开花初期，用注射器吸取10μL孢子液注入麦穗自顶部小穗开始自上而下第6个小穗的任意一个小花中，每个品种接种30个穗子。接种后采用人工弥雾保湿(每半小时喷弥雾5min)。接种21天后调查接种穗的病小穗数，计算病小穗率。病小穗率＝发病小穗数/总小穗数×100％。抗病调查和鉴定标准按照《中华人民共和国农业行业标准NY/T 2954-2016：小麦区域试验品种抗赤霉病鉴定技术规程》。

利用实施例1获得的KASP引物组对江苏里下河地区农科所2018年和2019年种植于湾头实验基地小麦赤霉病鉴定圃的全国122个小麦品种(系)进行基因分型，2019年、2020年和两年大田试验赤霉病鉴定结果的平均值以及KASP检测结果如表4和附图3所示。扩增产物的荧光信号数据经Kl uster Caller软件分析聚集在分型结果荧光信号数据经KlusterCaller软件分析聚集与扬麦4号相同，即证明这些小麦品系在分子标记AX111634185的基因型为A；若小麦品系的扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集与扬麦4号分型不同，则证明这些小麦品系在该SNP位点的基因型为G。

表4 122份小麦品种(系)的病小穗率值和基因型检测结果

表4可以看出含有等位基因A的小麦赤霉病抗性高于含有等位基因G的小麦。

表5携带不同基因型的供试品种(系)的病小穗率值T测验结果

表5利用Excel 2019的双样本T测验结果表明：2019年基因型为A的品种比基因型为G的品种赤霉病平均病小穗率降低43.76％，T测验结果t＝8.71；2020年基因型为A的品种比基因型为G的品种赤霉病平均病小穗率降低38.97％，T测验结果t＝7.86；两年综合下来基因型为A的品种比基因型为G的品种赤霉病平均病小穗率降低41.47％，T测验结果t＝9.82，在p<0.01水平上有极显著差异，表明含有等位基因A的小麦赤霉病抗性高于含有等位基因G的小麦。同时说明上述KASP标记YM4-6B-Fhb的引物组及基因型检测体系可以应用于小麦赤霉病抗性的分子标记辅助选择育种中。

由上述实验结果可以得出：通过本发明的引物组对小麦基因组DNA进行PCR扩增，可以直接通过KASP分型判断是否携带扬麦4号的赤霉病抗性高的基因，检测方法操作简单，检测结果非常直观，检测效果明显有效，利用该分子标记进行筛选可以大大提高分子标记辅助选择赤霉病抗性高低的小麦育种工作效率。

除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏里下河地区农业科学研究所

<120> 一种小麦赤霉病抗性相关分子标记及其应用

<130> 2021

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 1

gaaggtgacc aagttcatgc tttgtgggga atagccaagt aaa 43

<210> 2

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 2

gaaggtcgga gtcaacggat tttgtgggga atagccaagt aag 43

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 3

gctggagcca aaaacattgt g 21

<210> 4

<211> 71

<212> DNA

<213> Triticum aestivum

<220>

<221> misc_feature

<222> (36)..(36)

<223> r表示a或g

<400> 4

ctctgttttg cttcttgtgg ggaatagcca agtaartatg cggaattgag tttacacatg 60

ctactctact t 71

Claims

1.用于检测小麦基因组中染色体6B上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是AA、还是GG、还是A和G的物质在如下任一中的应用：

(A)鉴定或辅助鉴定小麦抗赤霉病性状；

(B)比较待测小麦籽粒的赤霉病抗性强弱；

(E)制备用于比较待测小麦赤霉病抗性强弱的产品；

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述用于检测小麦基因组中染色体6B上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是AA、还是GG、还是A和G的物质为成套引物或含有所述成套引物的试剂或试剂盒；

所述成套引物中含有两条上游引物和一条下游引物；

所述上游引物根据所述小麦基因组中染色体6B上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸及其上游序列进行设计，且一条所述上游引物的3’末端脱氧核糖核苷酸为所述小麦基因组中染色体6B上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸A，另一条所述上游引物的3’末端脱氧核糖核苷酸为所述小麦基因组中染色体6B上SEQ IDNo.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸G；

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述成套引物由SEQ ID No.1的第22-43位所示的单链DNA分子或其衍生物、SEQ ID No.2的第22-43位所示的单链DNA分子或其衍生物和SEQ ID No.3所示的单链DNA分子组成的成套引物，

其中，所述SEQ ID No.1的第22-43位所示的单链DNA分子的衍生物为SEQ ID No.1的第22-43位所示的单链DNA分子的5'端连接特异荧光标签序列A，

所述SEQ ID No.2的第22-43位所示的单链DNA分子的衍生物为SEQ ID No.2的第22-43位所示的单链DNA分子的5'端连接特异荧光标签序列B。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述试剂或试剂盒中还含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B；所述荧光探针A为与所述特异荧光标签序列A一致的序列，5’末端连接荧光报告基团A；所述淬灭探针A为所述特异荧光标签序列A的反向互补序列，3’末端连接荧光淬灭基团；所述荧光探针B为与所述特异荧光标签序列B一致的序列，5’末端连接荧光报告基团B；所述淬灭探针B为所述特异荧光标签序列B的反向互补序列，3’末端连接荧光淬灭基团；

所述特异荧光标签序列A为荧光标签序列FAM，所述特异荧光标签序列B为荧光标签序列HEX；所述荧光报告基团A为FAM，所述荧光报告基团B为HEX；所述荧光淬灭基团为BHQ。

5.如下任一方法：

(A1)直接测序；

(A2)用权利要求4中所述的试剂或试剂盒对待测小麦基因组DNA进行PCR扩增，将所扩增的产物进行荧光信号扫描，对扫描数据进行分析，然后按照如下确定所述待测小麦基因中染色体6B上SEQ ID No.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是AA、还是GG、还是A和G：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法B、所述方法C和所述方法D，所述检测小麦基因组中染色体6B上SEQ IDNo.4所示的基因片段的第36位脱氧核糖核苷酸是AA还是GG还是A和G的方法为所述方法A。

7.具有如下(A)-(D)中至少一种功能的物质，

(A)鉴定或辅助鉴定小麦抗赤霉病性状；

(B)比较待测小麦籽粒的赤霉病抗性强弱；

其特征在于，所述的物质为成套引物或含有所述成套引物的试剂或试剂盒；

所述成套引物中含有两条上游引物和一条下游引物；

所述成套引物由SEQ ID No.1的第22-43位所示的单链DNA分子或其衍生物、SEQ IDNo.2的第22-43位所示的单链DNA分子或其衍生物和SEQ ID No.3所示的单链DNA分子组成，

其中，所述SEQ ID No.1的第22-43位所示的单链DNA分子的衍生物为SEQ ID No.1的第22-43位所示的单链DNA分子的5'端连接特异荧光标签序列A，所述SEQ ID No.2的第22-43位所示的单链DNA分子的衍生物为SEQ ID No.2的第22-43位所示的单链DNA分子的5'端连接特异荧光标签序列B。

8.根据权利要求7所述的物质，其特征在于，所述试剂或试剂盒中还含有荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B；所述荧光探针A为与所述特异荧光标签序列A一致的序列，5’末端连接荧光报告基团A；所述淬灭探针A为所述特异荧光标签序列A的反向互补序列，3’末端连接荧光淬灭基团；所述荧光探针B为与所述特异荧光标签序列B一致的序列，5’末端连接荧光报告基团B；所述淬灭探针B为所述特异荧光标签序列B的反向互补序列，3’末端连接荧光淬灭基团；

9.权利要求5或6所述的方法或权利要求7或8所述的物质在小麦分子标记辅助育种中的应用。