CN113273489B - 一种抗赤霉病高产小麦的分子标记辅助选育方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗赤霉病高产小麦的分子标记辅助选育方法，在优良农艺性状且综合抗病性好的小麦品种或者其衍生品种(系)背景基础上，聚合穗粒数增效位点QGns‑3B、粒重增效位点QGW‑Y4、抗赤霉病主效基因Fhb1和Fhb5，低世代对株高、抗倒性和生育期等综合农艺性状进行选择，其中F3开始结合分子标记筛选，中选F4在大田种植成株行，对综合农艺性状、赤霉病抗性、综合抗病性等进行选择，分子标记辅助聚合产量相关性状增效位点和抗赤霉病基因，收获后测定千粒重和产量，F5及之后进入鉴定圃和品比圃，全面进行综合抗病性、综合农艺性状和产量鉴定，培育抗赤霉病高产小麦品种。

Description

一种抗赤霉病高产小麦的分子标记辅助选育方法
技术领域
本发明属于小麦分子育种方法技术领域，涉及一种抗赤霉病高产小麦的分子标记辅助选育方法。
背景技术
扬麦4号是江苏里下河地区农业科学研究所育成的小麦品种，具有早熟、高产、抗病等优良性状，其产量三要素中千粒重表现尤为突出，多年的性状鉴定结果显示其平均千粒重可达45.5g～47.5g，比普通品种显著高出5.56％～13.10％，以扬麦4号为亲本育成了在产量和抗病上均有突破的小麦品种扬麦5号和扬麦158及其衍生品种扬麦11、扬麦16等，前两个品种均获得国家科学技术进步一等奖，成为我国20世纪80年代末、90年代末种植面积最大的小麦品种，后面两个品种分别获得江苏省科学技术进步二等奖、中华农业科技一等奖。扬麦158是我国20世纪末种植面积最大的品种，也是长江中下游历史上推广速度最快、覆盖率最高的小麦品种，它的育成与推广促成了长江下游建国以来小麦品种第六次大面积更换，扬麦16连续八年是农业部推介主导小麦品种。以上品种为保障我国的粮食和食品安全做出了巨大贡献，这些品种的遗传背景中均不携带已知的抗赤霉病主效基因Fhb1～Fhb7，但其综合抗病性、农艺性状和产量均优良，推测其抗病性和携带的抗病基因与农艺性状可能无不利连锁，在小麦抗赤霉病遗传改良中更易于被利用。
同时，经过多年鉴定发现扬麦5号和扬麦158及其衍生扬麦11、扬麦16等品种的千粒重范围均在42.5～45g，均是由扬麦4号遗传而来，因此研究扬麦4号粒重的遗传基础，挖掘其粒重位点的优异等位变异，并开发成可供育种使用的便捷的连锁分子标记对于选择产量高的遗传背景的育种工作十分重要。目前暂未有对扬麦4号粒重的遗传基础的公开研究报道。
此外，我国是世界上最大的小麦生产和消费国，小麦生产的可持续发展对国家粮食安全和社会稳定起着至关重要的作用。目前，小麦生产仍面临着多种病害、虫害和非生物逆境等威胁，据统计真菌病害每年可导致全球产量损失15％～20％，其中小麦赤霉病(Fusarium head blight，FHB)危害尤为严峻，小麦赤霉病是由禾谷镰刀菌等引起的世界性病害，被称为小麦的“癌症”，不仅造成严重减产，还会产生DON等赤霉毒素危害人畜健康。到目前为止，在世界范围内赤霉病仍然只能采取预防措施，一旦发病不能控制，只能采取预防措施。因赤霉病发生受气象条件等影响，发病程度预测难度较大，导致年年预防，造成不必要的浪费和环境污染，与绿色生产要求相悖。其次，高感小麦品种在重发年份药剂防治收效甚微，给粮食安全带来风险。近十年我国小麦赤霉病5次大爆发，年发病面积约1亿亩，占小麦种植面积1/4，重发时减产50％，甚至绝收，小麦赤霉病已成为我国粮食和口粮安全的最大威胁。长江中下游冬麦区是我国小麦主产区，也是最大的赤霉病重发区，抗赤霉病一直是该麦区重要的育种目标，但至今未能育成大面积高抗赤霉病品种，赤霉病抗性与高产的矛盾仍是制约我国小麦育种的重要“卡脖子”问题。因此，创新小麦抗赤霉病高产育种途径和技术体系，培育具有突破性的抗赤霉病高产小麦品种，对于提升我国抗赤霉病小麦育种总体水平，增强我国种业核心竞争力，具有重要意义。
小麦抗赤霉病育种中最困难的就是赤霉病表型鉴定，因为小麦赤霉病是典型的数量性状，易受环境影响，在小麦开花期遇高温高湿环境会频发、重发，因此必须利用人工创造的条件和多年多点的鉴定结果才可靠，这样就会造成育种选择的周期颇长。利用赤霉病抗源或者抗病基因进行小麦抗赤霉病遗传改良是育种家长期努力的方向。传统的抗源例如苏麦3号、望水白等农艺性状差，利用其进行赤霉病抗性改良，一直没有取得突破性进展，虽然选育出一些赤霉病抗性强而稳定的品种(系)如宁7840等，但是农艺性状较差如植株偏高不抗倒，产量三要素不协调等推测可能其抗病性或者抗性基因与农艺性状存在连锁累赘。由于赤霉病抗性是受多基因控制的复杂数量性状，如果只依赖一个或极少数抗性基因，而忽视遗传背景的作用，在赤霉病严重流行年份不足以有效降低危害，并且导入抗病基因的同时更加要重视农艺性状和产量的提优，否则就会得不偿失。目前还未有报道利用传统抗源或者抗性基因培育出在生产上可大面积推广的赤霉病抗性与苏麦3号相当(R级)的突破性品种。
综上，选育既抗赤霉病又高产的小麦品种，是小麦生产上亟待解决的问题。
发明内容
为了克服上述技术问题，本发明提供了一种抗赤霉病高产小麦的分子标记辅助选育方法，聚合穗粒数增效位点QGns-3B、粒重增效位点QGW-Y4、抗赤霉病主效基因Fhb1和Fhb5，F2～F3代在大棚种植加代，同时对株高、抗倒性和生育期等综合农艺性状进行选择，其中F3开始结合分子标记筛选，中选F4在大田种植成株行，对综合农艺性状(株高、抗倒性、穗数、穗粒数、生育期)、赤霉病抗性、综合抗病性等进行选择，分子标记辅助聚合产量相关性状增效位点和抗赤霉病基因，收获后测定千粒重和产量，F5及之后进入鉴定圃和品比圃，抗赤霉病全面进行综合抗病性、综合农艺性状和产量鉴定，高效培育抗赤霉病高产小麦品种。
本发明提供了一种抗赤霉病高产小麦的分子标记辅助选育方法，所述方法包括以下步骤，
步骤S1，亲本选择：在累计推广面积大于500万亩、优良农艺性状且综合抗病性好的小麦品种或者其衍生品种(系)中筛选同时携带穗粒数增效位点QGns-3B和粒重增效位点QGW-Y4的目标材料为母本，筛选携带抗赤霉病主效基因Fhb1和Fhb5的目标品种(系)为父本；
步骤S2，种植父母本，配组杂交，收获F1杂交种；
步骤S3，F1自交，收获自交种F2；
步骤S4，选择综合农艺性状优良、综合抗病性好的单株标记，按照单株收获得到F3；
步骤S5，种植F3，并结合分子标记检测穗粒数增效位点QGns-3B、粒重增效位点QGW-Y4、抗赤霉病主效基因Fhb1和Fhb5，选择检测均呈阳性的单株收获得到F4；
步骤S6，在大田将中选F4种植成株行，分子标记检测穗粒数增效位点QGns-3B、粒重增效位点QGW-Y4、抗赤霉病主效基因Fhb1和Fhb5基因型，选择阳性株行标记，小麦开花期在标记株行喷施禾谷镰刀菌孢子液接种鉴定发病情况，全生育期考察标记株行的农艺性状，选择综合农艺性状优良、综合抗病性好并且赤霉病抗性达到R级的株行按中选株行混合收获脱粒，千粒重大于42克，亩产量不低于500公斤的为中选F5；
步骤S7，将F5种植成鉴定圃，设长江中下游小麦品种区域试验对照品种扬麦20为农艺性状和产量对照，选择综合农艺性状和综合抗病性好于对照并且赤霉病抗性达到R级，千粒重大于42克、亩产量不低于500公斤的品系。
进一步地，所述喷施禾谷镰刀菌孢子液接种鉴定发病情况具体操作为，参照Yu等(参考文献：YU J B,BAI G H,CAI S B,BAN T.Marker-assisted characterization ofAsian wheat lines for resistance to Fusarium head blight.Theoretical andApplied Genetics,2006,113:308-320.)方法制备赤霉菌孢子悬浮液，随机挑选50个穗子喷施浓度5×105～10×105个/mL孢子液接种，接种后立即喷水弥雾保湿，诱发赤霉病，接种后20～26天，安农8455的病穗率达到75％、感病小穗率达到75％时，停止喷水，调查接种穗子的病小穗数和总小穗数，计算发病小穗率：发病小穗数/总小穗数×100％。
进一步地，所述步骤S1中，亲本选择也可以是在优良农艺性状且综合抗病性好的小麦品种或者其衍生品种(系)中筛选携带穗粒数增效位点QGns-3B和粒重增效位点QGW-Y4的目标材料为父本，筛选携带抗赤霉病主效基因Fhb1和Fhb5的目标品种为母本。
进一步地，所述母本为镇麦9号，所述父本为扬麦18。
进一步地，所述步骤S6中，种植苏麦3号、扬麦158、扬麦13和安农8455为赤霉病高抗、中抗、中感和高感为对照。
进一步地，所述粒重增效位点QGW-Y4的检测特异性引物序列如SEQ ID NO.1、SEQID NO.2、SEQ ID NO.3所示。
进一步地，所述穗粒数增效位点QGns-3B的检测特异性引物序列为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示。
进一步地，所述抗赤霉病基因Fhb5的连锁SSR标记的特异性引物组序列为SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示。
进一步地，所述抗赤霉病基因Fhb1的连锁GSM标记的特异性引物组序列为SEQ IDNO.12、SEQ ID NO.13所示。
本发明相对于现有技术具有以下技术效果：
1)本申请首次以小麦4B染色体长臂上特异性最好、与粒重相关性最显著的粒重增效位点QGW-Y4的连锁标记GW-Y4，快速对小麦粒重进行筛选，为长江中下游麦区选育出携带粒重优异等位变异的小麦品种(系)，提高育种效率。
2)本发明利用发掘出的综合抗病性和综合农艺性状好的小麦品种(系)中携带穗粒数增效位点QGns-3B、粒重增效位点QGW-Y4的品种(系)与携带抗赤霉病主效基因Fhb1和Fhb5的小麦品种(系)杂交，聚合产量相关性状增效位点和抗赤霉病基因，实现抗赤霉病与高产的有机结合和协同提高，使高产得到保证的前提下抗赤霉病等级得到突破，为解决长江中下游麦区乃至全国的赤霉病危害的提供了有效途径。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为抗赤霉病高产小麦的方法流程图。
图2为4B染色体的部分遗传连锁图谱及粒重QTL定位示意图。
图3为实施例1中KASP标记验证部分RIL家系的试验标记扩增检测结果示意图。
图4为实施例2中KASP标记应用在部分长江中下游小麦品种(系)的试验标记扩增检测结果示意图。
图5为实施例3中QGW-Y4的KASP标记检测部分F4株行及高代品系的粒重基因型试验标记扩增检测结果示意图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
实施例1一种抗赤霉病高产小麦的分子标记辅助选育方法
亲本选择：用CTAB法提取累计推广面积大于500万亩、综合抗病性和综合农艺性状好的小麦品种或者其衍生品种(系)苗期的混合叶片DNA，分子标记筛选出同时携带穗粒数增效位点QGns-3B和粒重增效位点QGW-Y4的母本目标品种镇麦9号；同时筛选出携带抗赤霉病主效基因Fhb1和Fhb5的父本目标品种扬麦18。
筛选结果中发现“累计推广面积大于500万亩、优良农艺性状且综合抗病性好的小麦品种或者其衍生品种(系)中”镇麦9号、镇麦12、扬麦16、扬麦17和扬麦23等QGW-Y4位点携有与扬麦4号相同的增效基因型，但是符合同时携带穗粒数增效位点QGns-3B和粒重增效位点QGW-Y4的目标材料”只有镇麦9号，因此最终选择镇麦9号作为母本。
筛选结果中发现“累计推广面积大于500万亩、优良农艺性状且综合抗病性好的小麦品种或者其衍生品种(系)中”携带抗赤霉病主效基因Fhb1和Fhb5的目标材料只有扬麦18，因此最终选择扬麦18作为父本。
1)第一年8月在温室种植镇麦9号和扬麦18，10月以镇麦9号为母本，扬麦18为父本配组杂交，第一年12月收获F1杂交种。
2)第二年1月继续在温室种植F1，第二年6月收获自交种F2。
3)第二年8月在大棚种植F2，选择成熟期比对照扬麦20早、株高75～85厘米、抗倒性好；锈病、白粉病和黄花叶病等综合抗病性达到与扬麦16相当或者好于扬麦16的单株挂牌标记，第二年12月按照单株收获得到F3。
4)第三年1月在大棚种植中选F3，选择成熟期比对照扬麦20早、株高75～85厘米、抗倒性好；锈病、白粉病和黄花叶病等综合抗病性达到与扬麦16相当或者好于扬麦16的单株挂牌标记，CTAB法提取挂牌标记的单株DNA，分子标记检测穗粒数增效位点QGns-3B、粒重增效位点QGW-Y4、抗赤霉病主效基因Fhb1和Fhb5，选择检测均呈阳性的单株于第三年6月按照单株收获得到F4。
5)第三年10月在大田将中选F4种植成株行，行长2m，行距20cm，株距4.2cm，种植苏麦3号、扬麦158、扬麦13和安农8455为赤霉病高抗、中抗、中感和高感为对照各5行。分子标记检测穗粒数增效位点QGns-3B、粒重增效位点QGW-Y4、抗赤霉病主效基因Fhb1和Fhb5基因型，选择阳性株行挂牌标记。小麦开花期在挂牌标记株行随机挑选50个穗子喷施孢子液接种(浓度5×105～10×105个/mL)，接种后立即喷水弥雾保湿，诱发赤霉病，接种后20～26天，安农8455的病穗率达到75％、感病小穗率(发病小穗数/总小穗数×100％)达到75％时，停止喷水，调查接种穗子的病小穗数和总小穗数，计算发病小穗率：发病小穗数/总小穗数×100％，全生育期考察挂牌标记株行的农艺性状，选择比对照扬麦20早1～3天、株高78～89厘米、每亩有效穗数大于30万、每穗穗粒数大于38、抗倒性好、锈病、白粉病和黄花叶病等综合抗性达到与扬麦16相当或者好于扬麦16并且赤霉病发病小穗率的数值介于扬麦158和苏麦3号之间的株行于来年6月分别按中选株行混合收获脱粒，测定籽粒产量和千粒重，从中选择亩产不低于500公斤，千粒重大于42克的成F5株系。
6)第四年10月将F5在大田种植成鉴定圃，设长江中下游小麦品种区域试验对照品种扬麦20为农艺性状和产量的对照，选择综合农艺性状和综合抗病性好于对照扬麦20并且赤霉病抗性达到R级，千粒重大于42克、亩产量不低于500公斤的品系。
最终，选择的品种扬ZY18全生育期200～202天，比对照扬麦20早熟1～2天。株高83～84.5厘米，株型较紧凑，抗倒性强。综合抗病性好，整齐度好，穗层整齐，熟相好。亩穗数31.5～32.5万穗，穗粒数42.5～44.5粒，千粒重43.5～44.5克，亩产量509.4公斤～524.7公斤，同年同点长江中下游区试对照品种扬麦20平均亩产量达到452.7公斤，因此扬ZY18比对照扬麦20增产12.5％～15.9％(达极显著水平)。赤霉病抗性接种鉴定结果为平均病小穗率为6.65％，平均严重度是1.12，抗赤霉病，同年同点高感赤霉病的品种安农8455的平均病小穗率是83.14％，平均严重度是4.75，中抗赤霉病品种扬麦158的平均病小穗率为23.92％，平均严重度是2.05，公认的抗赤霉病品种苏麦3号的平均病小穗率为5.04％，平均严重度为1.01，因此扬ZY18抗病等级与苏麦3号相当，是高抗赤霉病的品种。可见，通过本发明的方法能够聚合产量相关性状增效位点和抗赤霉病基因，实现抗赤霉病与高产的有机结合和协同提高，使高产得到保证的前提下抗赤霉病等级得到突破，为解决长江中下游麦区乃至全国的赤霉病危害的提供了有效途径。
实施例2分子标记辅助选择穗粒数增效位点QGns-3B、抗赤霉病基因Fhb5方法的建立
用分子标记Xgpw1145、stm7tgag和WMC752、MAG9482的引物组检测实施例1中步骤1)、4)和5)材料是否携带穗粒数增效位点QGns-3B和抗赤霉病基因Fhb5。
1、以步骤1)提取的基因组DNA为模板，采用用于检测小麦的穗粒数增效位点QGns-3B位点连锁标记Xgpw1145、stm7tgag进行PCR扩增得到扩增产物，确定QGns-3B位点与扬麦17基因型相同的目标材料镇麦9号；采用用于检测小麦抗赤霉病基因Fhb5的连锁标记WMC752、MAG9482进行PCR扩增得到扩增产物，确定Fhb5位点与望水白基因型相同的目标材料扬麦18。
2、采用CTAB法提取镇麦9号、扬麦18、F3单株、F4株行混合叶片的基因组DNA，经稀释得到DNA浓度为约30ng/μL的模板溶液。
分子标记检测穗粒数增效位点QGns-3B、抗赤霉病基因Fhb5的连锁SSR标记的特异性引物组的序列见表1：
表1 QGns-3B、Fhb5连锁标记引物序列信息
Figure BDA0003077781230000091
Figure BDA0003077781230000101
采用PCR扩增的方法检测QGns-3B和Fhb5的对应连锁标记Xgpw11 45、MAG9482，所述PCR扩增的方法为：所述PCR扩增的体系为10μL，包含30ng/μL小麦基因组DNA 1.0μL、10×PCR buffer 1.0μL、10Mm dNTP 0.2μL、10Mm MgCl2 1.0μL、5U Taq聚合酶0.2μL、5μM的上游引物0.4μL、5μM的下游引物0.4μL和无菌去离子水5.8μL；所述PCR扩增程序为：(1)94℃预变性8min，(2)94℃变性30s，(3)Xgpw1145引物55℃退火40s；MAG9482引物52℃退火40s，(4)72℃延伸30s，36个循环，(5)72℃延伸10分钟；(6)4℃保存。
采用Xgpw1145、MAG9482引物在8％非变性聚丙乙烯酰胺凝胶电泳液中检测实施例步骤4)和5)中所涉及材料连同亲本，其中Xgpw1145目标基因型与扬麦17和镇麦9号相同视为阳性，为中选材料，MAG9482目标基因型与望水白和扬麦18相同视为阳性，为中选材料。
实施例3分子标记辅助选择抗赤霉病基因Fhb1方法的建立
用分子标记TaHRC-GSM的引物组检测实施例1中步骤1)、4)和5)材料是否携带抗赤霉病位点Fhb1。
1、以步骤1)提取的基因组DNA为模板，采用实施例1所述用于检测小麦的抗赤霉病基因的连锁标记TaHRC-GSM进行PCR扩增，得到扩增产物，确定Fhb1位点与苏麦3号基因型相同的目标材料扬麦18。
2、采用CTAB法提取镇麦9号、扬麦18、F3单株、F4株行混合叶片的基因组DNA，经稀释得到DNA浓度为约30ng/μL的模板溶液。
分子标记检测抗赤霉病基因Fhb1的连锁GSM标记的特异性引物组的序列见表2：
表2 Fhb1连锁标记引物序列信息
Figure BDA0003077781230000111
采用PCR扩增的方法检测抗赤霉病主效基因Fhb1的对应连锁标记Ta HRC-GSM，所述PCR扩增的方法为：所述PCR扩增的体系为10μL，包含30ng/μL小麦基因组DNA 1.0μL、10×PCR buffer 1.0μL、10Mm d NTP 0.2μL、10Mm MgCl2 1.0μL、5U Taq聚合酶0.2μL、5μM的上游引物0.4μL、5μM的下游引物0.4μL和无菌去离子水5.8μL；所述PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10分钟；4℃保存。
采用TaHRC-GSM引物在1％琼脂糖电泳液中检测本研究步骤4)和5)中所涉及材料连同亲本，目标基因型与苏麦3号和扬麦18相同，为中选材料。
实施例4筛选稳定的显著与粒重相关的SNP位点QGW-Y4并且验证
以151份来源于“扬麦4号×偃展1号”的重组自交系(F10)为材料，2014年和2015年连续2个生长季将该重组自交系及其亲本种植于江苏里下河地区农业科学研究所万福试验基地(江苏扬州)，试验当年扬州的小麦播期设为10月25日，试验采用随机区组设计，3行区，2次重复，每行40粒，行长1.33m，行距0.23m。田间施肥及管理参照当地大田栽培生产，及时防治病虫草害，2015年和2016年的6月待小麦成熟时各株系按小区人工收获，收获晒干后在室内调查RIL群体及亲本的千粒重。参照GB5519—88粮食和油料千粒重的测定方法(自然水分千粒重法)，数500粒小麦籽粒，每个样品重复2次，换算成千粒重，取其平均值为该株系千粒重。两次试验结果允许误差不超过6％；若超出允许误差则重新测定。
采用CTAB法提取基因组DNA，利用Wheat55K芯片获取基因型，并构建遗传图谱。利用IciMapping v4.1软件(http://www.isbreeding.net)过滤和去冗余基因型数据。利用JoinMap v4.0构建和校正遗传图谱，利用Map Chart2.3(https://www.wur.nl/en/show/Mapchart.htm)绘制遗传图谱。利用IciMapping v4.1的完备区间作图法(Inclusivecomposite interval mapping，I CIM)检测与粒重显著相关的QTL，LOD阈值设为2.5。为了与前人结果比较，将连锁标记或者基因序列与中国春参考基因组序列的EnsemblPlants数据库(http://plants.ensembl.org/)进行比对。
实验获得1个相对稳定的与粒重相关的位点QGW-Y4，增效基因来源于扬麦4号，即增加粒重的基因来源于扬麦4号，QTL峰值位置在4B染色体上20.51cM～20.60cM，对应标记区间为Marker111588547～Marker111662588(附图2、表3)，相距0.09个cM，表型贡献率达到15.31％～20.57％(表3)。
表3QGW-Y4对粒重的遗传效应及其侧翼标记
Figure BDA0003077781230000121
Figure BDA0003077781230000131
如图2所示，本申请通过QTL作图检测到1个增效基因来源于扬麦4号的与粒重相关的位点QGW-Y4，QTL峰值位置在4B染色体连锁群上20.51cM～20.60cM，对应标记区间为Marker111588547～Marker111662588，经过查阅文献和与小麦参考基因组比对发现该位置位于4B染色体长臂514.87Mb～519.40Mb，较精细，未见相同或者相近物理位置上已有粒重QTL/基因的相关报道(482.82Mb，参考文献：Jia H,Wan H,Yang S,Zhang Z,Kong Z,Xue S,Zhang L,Ma Z(2013)Genetic dissection of yield-related traits in a recombinantinbred line population created using a key breeding parent in China’s wheatbreeding.Theor Appl Genet 126:2123–2139；610.56Mb，参考文献：Huang XQ,CloutierS,Lycar L,Radovanovic N,Humphreys DG,Noll JS,Somers DJ,Brown PD(2006)Molecular detection of QTLs for agronomic and quality traits in a doubledhaploid population derived from two Canadian wheats(Triticum aestivum L.).Theor Appl Genet 113:753–766)申请人进一步从QTL区间中依据标记同源性初步筛选SNP标记，选择区间中特异性高、与粒重相关性最高的SNP标记进行KASP标记转化，确定Marker111662588标记的基因组特异性最好、与粒重相关性最显著，其侧翼序列是5’-CTTGACCACCCTACAGGTGAAGGGGAGAAT TAGCC[A/G]GTTTATGCTCTAAGGAGTACATTGATACGTCTCCA-3’(SEQ ID NO.14)，利用Polymarker(http://polymarker.tgac.ac.uk/)进行KASP引物设计，引物由北京嘉程生物科技有限公司合成。最终成功将Marker111662588标记转化为KASP标记GW-Y4，其对应的变异位点是A/G，即核苷酸序列SEQ ID NO.14自5’端起第36位碱基存在A/G等位基因(SNP)位点；小麦育种来说，粒重高的是优势等位变异，扬麦4号携有优势等位变异A，携有等位基因A的小麦千粒重高于含有等位基因G的小麦。
本实施例针对该SNP位点设计GW-Y4引物组，如表4所示，下游引物(引物3)保证了PCR扩增的4B染色体特异性，上游引物(引物1和引物2)的3’末端为标记Marker111662588的等位变异碱基A/G。
表4 QGW-Y4连锁标记引物序列信息
Figure BDA0003077781230000141
KASP标记引物工作液的制备：分别取上游引物(核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示)各12μL(100μM)，取下游引物(核苷酸序列如和SEQ ID NO.3所示)30μL(100μM)，用无菌超纯水补充至100μL，充分混匀，作为KASP标记的引物工作液，备用。
PCR扩增反应体系：待测小麦DNA模板2μL(约30ng/μL)、引物工作液0.08μL、KASPMaster Mix 2.5μL(LGC公司，KBS-1016-002)，用无菌超纯水补充至5μL；
PCR反应程序：(1)95℃预变性15min；(2)95℃变性20s、65–55℃(每个循环下降1℃)60s，共9个循环；(3)95℃变性20s、57℃复性60s，30个循环；10℃保存。实验同时设置反应体系中不添加模板DNA的空白对照(NTC)，每个板设置1个或多个空白对照。
取小麦幼苗，采用CTAB法提取待测小麦基因组DNA。以待测小麦基因组DNA为模板，采用如上KASP引物组、PCR试剂进行PCR扩增，获得PCR扩增产物。PCR反应在S1000TM ThermalCycler PCR仪(Bio-R ad Laboratories Inc.)上进行，用多功能酶标仪(PHERAstar Plus,BMGLABTECH，Germany)对PCR扩增产物进行扫描读取荧光值。FAM激发波长为485nm，发射波长为520nm；VIC激发波长为535nm，发射波长为556nm，系统参比荧光ROX激发波长为575nm，发射波长为610nm。采用Kluster Caller软件(KBioscience)进行基因分型，根据分析结果确定粒重相关位点连锁的SNP标记Marker111662588的基因型。
将151份“扬麦4号×偃展1号的重组自交系”连同两个亲本按照如上方法进行扩增，检测结果如附图3所示。扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集在分型结果荧光信号坐标系中靠近X轴的位置(蓝色)，与扬麦4号相同，即证明这些小麦在分子标记Marker111662588侧翼核苷酸序列(如SEQ ID NO.14)的第36位碱基(SNP位点)的基因型为A；而扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集在坐标系中靠近Y轴的位置(红色)，与扬麦4号分型不同，则证明这些小麦在该SNP位点的基因型为G；附图3中左下角显示为黑色的样本为空白对照。151个家系连同两个亲本的KASP检测结果、2015年和2016年大田试验收获后测定的粒重两年的平均结果如表5和附图3所示。
表5151个家系和亲本的两年千粒重平均值和GW-Y4分型结果
Figure BDA0003077781230000151
Figure BDA0003077781230000161
Figure BDA0003077781230000171
表6携带Marker111662588不同基因型的RIL家系的两年千粒重平均值T测验结果
Figure BDA0003077781230000172
由表5可见，含有等位基因A的小麦千粒重平均值高于含有等位基因G的小麦。表6所示利用Excel 2019的双样本T测验151个RIL家系的基因型和表型，结果表明：扬麦4号基因型为A，偃展1号基因型为G，151个家系中基因型为A的家系比基因型为G的家系2015年和2016年两年千粒重平均值高8.12％，在p<0.01水平上有显著差异，说明上述KASP标记GW-Y4的引物组及基因型检测体系可以应用于小麦粒重分子标记辅助育种中(表8统计方法为本领域常规方法，具体也可以参见文献“盖钧镒，《试验统计方法》，中国农业出版社，2000年9月”中公开的内容)。附图3显示材料分型结果良好，材料分型与芯片检测数据完全一致，说明KASP标记开发成功，可进一步用于育种材料检测。
实施例5 QGW-Y4的KASP引物组育种应用
田间试验：本实施例以于2014年和2015年种植于湾头实验基地的小麦品种(系)共146份为材料，试验当年扬州的小麦播期设为10月25日，试验采用随机区组设计，3行区，2次重复，每行40粒，行长1.33m，行距0.23m。田间施肥及管理参照当地大田栽培生产，及时防治病虫草害，2015年和2016年的6月待小麦成熟时各株系按小区人工收获，收获晒干后在室内调查群体及亲本的千粒重。参照GB5519—88粮食和油料千粒重的测定方法(自然水分千粒重法)，数500粒小麦籽粒，每个样品重复2次，换算成千粒重，取其平均值为该株系千粒重。两次试验结果允许误差不超过6％；若超出允许误差则重新测定。
利用实施例4获得的KASP引物组对2014年和2015年种植于湾头实验基地的小麦品种(系)共146份为材料进行基因分型，2015年、2016年和两年大田试验收获后测定的千粒重平均值以及KASP检测结果如表6和附图4所示。扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集在分型结果荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集与扬麦4号相同，即证明这些小麦品系在分子标记Marker111662588的基因型为A；若小麦品系的扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集与扬麦4号分型不同，则证明这些小麦品系在该SNP位点的基因型为G(表3)。
表7 146份品种(系)的千粒重值和基因型检测结果
Figure BDA0003077781230000181
Figure BDA0003077781230000191
Figure BDA0003077781230000201
Figure BDA0003077781230000211
表8 携带不同基因型的供试品系的千粒重平均值T测验结果
Figure BDA0003077781230000212
Figure BDA0003077781230000221
表8参考文献：“盖钧镒，《试验统计方法》，中国农业出版社，2000年9月”。双样本T测验结果表明：2015年基因型为A的品种比基因型为G的品种粒重平均值高8.67％，T测验结果t＝3.5；2016年基因型为A的品种比基因型为G的品种千粒重平均值高11.53％，T测验结果t＝5.17；2015年和2016年基因型为A的品种比基因型为G的品种平均千粒重高9.12％，T测验结果t＝4.77，均在p<0.01水平上有极显著差异，表明含有等位基因A的小麦千粒重高于含有等位基因G的小麦。同时说明上述KASP标记引物组及基因型检测体系可以应用于小麦千粒重的分子标记辅助选择育种中。
实施例6分子标记辅助选择粒重增效位点QGW-Y4方法的建立
用分子标记GW-Y4的引物组检测实施例1中步骤1)、4)和5)材料是否携带粒重增效位点QGW-Y4。
1、以步骤1)提取的基因组DNA为模板，采用实施例4所述用于检测小麦的粒重增效位点的连锁KASP标记GW-Y4进行PCR扩增，得到扩增产物，确定QGW-Y4位点与扬麦4号基因型相同的目标材料镇麦9号。
2、采用CTAB法提取镇麦9号、扬麦18、F3单株、F4株行混合叶片的基因组DNA，经稀释得到DNA浓度为约30ng/μL的模板溶液。
将步骤4)和5)中的材料连同两个亲本按照如上方法进行扩增，检测结果如附图5所示。扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集在分型结果荧光信号坐标系中靠近X轴的位置(蓝色)，与扬麦4号相同，即证明这些小麦在分子标记GW-Y4侧翼核苷酸序列(如SEQ ID NO.14)的第36位碱基(SNP位点)的基因型为A，是中选材料；而扩增产物的荧光信号数据经Kluster Caller软件分析聚集在坐标系中靠近Y轴的位置(红色)，与扬麦4号分型不同，则证明这些小麦在该SNP位点的基因型为G；附图5中左下角显示为黑色的样本为空白对照。
除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏里下河地区农业科学研究所
<120> 一种抗赤霉病高产小麦的分子标记辅助选育方法
<130> 2021
<160> 14
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 1
gaaggtgacc aagttcatgc tggtgaaggg gagaattagc ca 42
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 2
gaaggtcgga gtcaacggat tggtgaaggg gagaattagc cg 42
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 3
acgtatcaat gtactcctta gagca 25
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 4
ctttacggat ttcgaggcag 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 5
agatggaagc atgcggtaac 20
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 6
acgtgcagaa atatcacaag ctc 23
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 7
tgtgtgtgtg tgtgagagag ag 22
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 8
ccgattgtag atcaaaagcc 20
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 9
tctagagagt ctttttcccg agc 23
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 10
catgattgat tcgatgacta taatatctt 29
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 11
tctttctccc gttgcaatgt 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 12
attcctacta gccgcctggt 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 13
actggggcaa gcaaacattg 20
<210> 14
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<221> misc_feature
<223> r为A或G
<400> 14
cttgaccacc ctacaggtga aggggagaat tagccrgttt atgctctaag gagtacattg 60
atacgtctcc a 71

Claims (5)

1.一种抗赤霉病高产小麦的分子标记辅助选育方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤，
步骤S1，亲本选择：在累计推广面积大于500万亩、优良农艺性状且综合抗病性好的小麦品种或者其衍生品种中筛选出同时携带穗粒数增效位点QGns-3B和粒重增效位点QGW-Y4的目标材料为母本，同时筛选出携带抗赤霉病主效基因Fhb1和Fhb5的目标品种为父本；
步骤S2，种植父母本，配组杂交，收获F1杂交种；
步骤S3，F1自交，收获自交种F2；
步骤S4，选择综合农艺性状优良、综合抗病性好的单株标记，按照单株收获得到F3；
步骤S5，种植F3，并结合分子标记检测穗粒数增效位点QGns-3B、粒重增效位点QGW-Y4、抗赤霉病主效基因Fhb1和Fhb5，选择检测均呈阳性的单株收获得到F4；
步骤S6，将中选F4种植成株行，分子标记检测穗粒数增效位点QGns-3B、粒重增效位点QGW-Y4、抗赤霉病主效基因Fhb1和Fhb5基因型，选择阳性株行标记，小麦开花期在标记株行喷施禾谷镰刀菌孢子液接种鉴定发病情况，全生育期考察标记株行的农艺性状，选择综合农艺性状优良、综合抗病性好并且赤霉病抗性达到R级的株行按中选株行混合收获脱粒，千粒重大于42克，亩产量不低于500公斤的为中选F5；
步骤S7，将F5种植成鉴定圃，设长江中下游小麦品种区域试验对照品种扬麦20为农艺性状和产量对照，选择综合农艺性状和综合抗病性好于对照并且赤霉病抗性达到R级，千粒重大于42克、亩产量不低于500公斤的品系；
所述步骤S1-S7中，所述粒重增效位点QGW-Y4的检测特异性引物序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示，所述穗粒数增效位点QGns-3B的检测特异性引物序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、 SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示，所述抗赤霉病基因Fhb5的连锁SSR标记的特异性引物组序列如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.11所示，所述抗赤霉病基因Fhb1的连锁GSM标记的特异性引物组序列如SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述喷施禾谷镰刀菌孢子液接种鉴定发病情况具体操作为，随机挑选50个穗子喷施浓度5×105～10×105个/mL孢子液接种，接种后立即喷水弥雾保湿，诱发赤霉病，接种后20～26天，当安农8455的病穗率达到75%、感病小穗率达到75%时，停止喷水，调查接种穗子的病小穗数和总小穗数，计算发病小穗率：发病小穗数/总小穗数×100%。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中，亲本选择，在优良农艺性状且综合抗病性好的小麦品种或者其衍生品种中筛选携带穗粒数增效位点QGns-3B和粒重增效位点QGW-Y4的目标材料为父本，筛选携带抗赤霉病主效基因Fhb1和Fhb5的目标品种为母本。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述母本为镇麦9号，所述父本为扬麦18。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S6中，种植苏麦3号、扬麦158、扬麦13和安农8455为赤霉病高抗、中抗、中感和高感为对照。
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