CN117210601B - 一种快速简便高通量鉴定小麦赤霉病抗性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速简便高通量鉴定小麦赤霉病抗性的方法，包括以下步骤：培养禾谷镰孢菌，并制备禾谷镰孢菌的孢子悬浮液；剪取小麦穗子，浸没于孢子悬浮液中，然后将充分沾有菌液的穗子置于培养箱内生长，生长后取出小麦穗子；将小麦穗子清洗，并提取DNA；用基于DNA的实时荧光定量PCR技术检测禾谷镰孢菌特有基因OSP24的量，通过计算禾谷镰孢菌OSP24基因量相对于小麦Actin基因量的比值，衡量禾谷镰孢菌在小麦穗内的生长量，进而判断小麦对禾谷镰孢菌的抗性。本发明能够快速高效地筛选出抗赤霉病的小麦材料，从而为筛选可供育种利用的小麦抗赤霉病种质资源以及定位、克隆抗赤霉病基因奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于植物病害检测技术领域，具体涉及一种能够快速高通量地鉴定小麦对禾谷镰孢菌的抗性水平的方法。
背景技术
小麦赤霉病是一种真菌性的穗部病害，发生于温暖潮湿的气候条件下，常造成小麦产量和籽粒品质的降低，是危害小麦生产的重要病害之一。该病主要由病原真菌禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)造成。禾谷镰孢菌是植物十大病原性真菌之一(Deanetal.2012)，能够侵染小麦根、茎秆、叶片、穗等多种器官。病菌在成功入侵后能够分泌脱氧雪腐镰孢菌烯醇(deoxynivalenol,DON)等毒素，这些毒素对人畜有害，会导致呕吐、腹泻等症状(Chen et al.2019)。近年来，受气候变暖、降雨量增多、秸秆还田不充分、玉米-小麦/水稻-小麦轮作等因素的影响，赤霉病频发高发，逐渐变成世界范围内小麦的流行病害(Baiet al.2018；Ma et al.2019)。
在实际生产中，常通过喷洒药剂、栽培管理、种植抗病品种等方式对小麦赤霉病进行防控。实践表明，培育并种植抗病品种是最为经济有效的基础策略。但是，目前在小麦及其近缘种中尚未发现对赤霉病免疫的抗源，生产中广泛种植的小麦抗病品种的抗性级别大多数在中抗水平，而可供育种利用的抗病基因资源十分匮乏。因此，持续不断地鉴定新抗源，发掘新的抗病基因，并将之应用于抗病育种，是应对赤霉病威胁的长久之策。
小麦赤霉病的抗性分为5种类型，分别为TypeⅠ(抗侵染)、TypeⅡ(抗扩展)、TypeⅢ(抗毒素积累)、TypeⅣ(籽粒抗性)、TypeⅤ(耐病性)(Mesterházy 1995)。TypeⅠ抗性是指小麦对病原菌初侵染的抗性，即寄主阻止病原菌定殖的能力；TypeⅡ抗性是指小麦抵御病原菌在穗部扩展的能力；TypeⅢ抗性是指小麦抑制DON等毒素积累或降解毒素的能力，一般通过测定感染赤霉病的种子中DON含量来评价；TypeⅣ代表籽粒抗病性，通常用病麦粒百分比来衡量；TypeⅤ代表耐病性，通常以受赤霉病菌侵染后小麦产量的损失大小来衡量。
无论何种抗性，准确的表型鉴定是关键。在实际生产中，小麦赤霉病的人工抗性鉴定通常采用多种方法。单花滴注法是应用最为广泛的方法，通常在小麦扬花初期对穗中部的一个小花注射孢子液，三周后统计病小穗数，以病小穗数占总小穗数的比例评价抗病性(王裕中等，1982)。在赤霉病的研究中，研究人员广泛利用单花滴注法筛选抗源、鉴定目的品种的抗病性等，但单花滴注法仅能反映TypeⅡ抗性，不能反映TypeⅠ抗性。在单花滴注法的基础上，Zhang et al.(2021)发明了穗轴接种法，在小麦扬花初期将孢子液注射到穗基部节间内部，根据第1个病小穗出现的时间以及接种21天的病小穗率来评价抗病性。该方法可作为单花滴注法的补充，反映TypeⅡ抗性。孢子喷雾或土表放置病麦粒法可以模拟自然条件下病原菌对寄主的侵染能力，通常以病穗率、病情指数等作为评价标准，能同时反映TypeⅠ和TypeⅡ抗性。但该方法受环境影响较大，喷雾次数、喷雾均匀程度、温湿度等均会影响鉴定的可靠性，导致个体间发病率差异较大。除人工接种鉴定外，还可采用重病区自然鉴定法，在赤霉病发病严重地区种植鉴定材料，或在本地试验田利用喷水等装置创造适宜病害发生的条件，完全依靠自然发病。自然鉴定易受环境条件影响，鉴定结果的一致性和稳定性较差。
上述接种方法均耗时费力，易受环境条件影响，且评价标准中需要统计发病和未发病小穗数，易受个人主观判断影响，不仅等待时间较长，还耗费大量人力物力，因此无法应用于高通量抗源精准鉴定，严重制约抗源发掘及育种工作的进展。探索简便快捷的接种方式，建立高效的评价方法，对快速摸清种质资源“家底”，抢占小麦赤霉病育种先机，加快推进种业振兴具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速简便高通量鉴定小麦赤霉病抗性的方法，以解决现有鉴定小麦赤霉病抗性的方法存在的对接种技术、环境条件要求比较高，病情鉴定依赖人工判断，耗时耗力，而且不适合进行高通量鉴定的问题。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种快速简便高通量鉴定小麦赤霉病抗性的方法，包括以下步骤：
步骤1，培养禾谷镰孢菌，并制备禾谷镰孢菌的孢子悬浮液；
步骤2，剪取小麦穗子，浸没于步骤1制备的孢子悬浮液中，然后将充分沾有菌液的穗子置于培养箱内生长，生长后取出小麦穗子；
步骤3，将小麦穗子清洗，并提取DNA；
步骤4，用基于DNA的实时荧光定量PCR技术检测禾谷镰孢菌特有基因OSP24的量，通过计算禾谷镰孢菌OSP24基因量相对于小麦Actin基因量的比值，衡量禾谷镰孢菌在小麦穗内的生长量，进而判断小麦对禾谷镰孢菌的抗性。
优选的，所述步骤1中，禾谷镰孢菌的孢子悬浮液中的孢子浓度为1×105个/mL。
所述步骤2中，选取扬花期的小麦穗子，将其完全浸没在含有Tween-20的孢子悬浮液中，2min后，取出小麦穗子，基部置于装有水的容器中，用塑料袋将小麦穗子套住以保持湿度，置于培养箱中，不超过2d后，取出小麦穗子。
优选的，所述孢子悬浮液中，Tween-20的体积浓度为0.05％。
优选的，所述步骤3中，小麦穗子剪去麦芒后，置于离心管中，用含表面活性剂的灭菌水剧烈震荡、涡旋以去除表面微生物，重复3次，每次清洗后均用干净吸水纸吸干水分。
优选的，所述表面活性剂为Silwet L-77。
优选的，所述灭菌水中，表面活性剂的体积浓度为0.02％。
优选的，所述步骤3中，采用CTAB法抽提小麦穗子DNA。
优选的，所述步骤4中，设计针对OSP24基因的特异性引物，通过PCR技术得到OSP24基因的特异产物，以此来标记禾谷镰孢菌。
优选的，所述针对OSP24基因的特异性引物如下：
OSP24-DRT-F1(5′-CTCACAATGCCCTGGAAATAAAC-3′)；
OSP24-DRT-R1(5′-CGAGCGGTAGCAAAGACAT-3′)。
有益效果：本发明的技术方案简单易操作，对环境条件要求不高，只需用病菌孢子液浸泡小麦穗子后放置于培养箱培养，之后抽提小穗DNA检测病菌基因即可完成全部流程。本发明适用于高通量鉴定，耗时短，不会消耗大量人力物力。
附图说明
图1为本发明用禾谷镰孢菌侵染小麦小穗以及鉴定小穗中病菌生长量的流程图；
图2为接种禾谷镰孢菌前后小麦小穗中病菌基因OSP24的PCR扩增产物凝胶电泳图，其中，安农8455和扬麦158分别为高感和中抗的小麦品种；
图3为用实时荧光定量PCR检测接种禾谷镰孢菌前后苏麦3号小穗中病菌基因OSP24的扩增曲线和熔解曲线；其中，A图和B图分别为接种前样品中OSP24的扩增曲线和熔解曲线，C图和D图分别为接种后样品中OSP24的扩增曲线和熔解曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做更进一步的解释。
实施例
第一步，禾谷镰孢菌的培养及孢子悬浮液的准备
本实施例所用的禾谷镰孢菌株为国际参考菌株NRRL31084(PH-1)，在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar medium,PDA)上培养至菌丝长满培养基表面后，置于4℃冰箱内长期保存。
制备禾谷镰孢菌的孢子悬浮液时，挑取禾谷镰孢菌菌块放置于新鲜PDA培养基表面，于25℃恒温培养箱内静置培养3d。随后挑取少量菌丝接种于绿豆汤培养基中，置于25℃摇床内以180r/min震荡培养3d，产生分生孢子后，吸取10μL菌液于显微镜下镜检，计算孢子数目，将所有孢子液浓度稀释至1×105个/mL，4℃保存备用。
所用的培养基配方如下：
PDA培养基：马铃薯200g/L，切成小块，用蒸馏水煮沸20min，纱布过滤后，加葡萄糖20g/L，琼脂15g/L，高温高压灭菌20min。
绿豆汤培养基：绿豆40g置于1000mL蒸馏水中煮沸20min，保持绿豆皮完整不破，用细纱布过滤上清液，121℃高温高压灭菌15min。
第二步，用禾谷镰孢菌孢子液处理小麦的穗子
选取扬花期的小麦穗子用于接种处理。实验小麦品种选取对赤霉病表现出不同抗性水平的代表性品种，包括抗病品种苏麦3号、中抗品种扬麦158和高感品种安农8455。这些品种的抗性水平稳定且经过实际生产的重复验证，是赤霉病研究中常用的对照品种。
具体的操作步骤如下：
剪掉扬花期的小麦穗子(每个品种剪取3个)，将其完全浸没在含有0.05％(v/v)Tween-20的赤霉病菌孢子悬浮液中，Tween-20的作用是用于增加黏附。2min后，取出穗子，基部置于装有自来水的烧杯中，用塑料袋将接种小麦穗子套住以保持湿度，置于培养箱中。不超过2d后，取出小麦穗子。
第三步，小麦穗DNA的抽提
采用CTAB法抽提小麦穗子DNA。接种后的小麦穗子剪去麦芒后，置于10mL离心管中，用含0.02％(v/v)Silwet L-77的灭菌水剧烈震荡、涡旋以去除表面微生物，重复3次，每次清洗后均用干净吸水纸吸干水分。之后采用如下步骤抽提DNA：
(1)将小穗放入2mL离心管，加入钢珠用液氮充分冷冻后，用研磨仪打碎成细粉。
(2)加入600μL 1.5×CTAB，充分混匀，置于65℃水浴孵育30min，每隔5min上下颠倒一次。
(3)孵育完成后取出，加入等体积的氯仿(通风橱内操作)，置于摇床上晃动孵育30min(离心管上覆盖吸水纸，用橡皮筋缠紧，防止氯仿泄漏)。
(4)室温，10000rpm，离心10min。吸取上清450μL至新的离心管中，加入等体积的异丙醇或2×体积的95％预冷乙醇，混匀后置于-20℃冷冻2h左右。
(5)室温，12000rpm，离心15min后弃去上清。
(6)加入500μL 75％乙醇，于室温下8000rpm，离心5min后弃去上清。
(7)短暂离心后，用移液器吸弃残余乙醇，超净台上吹干后用灭菌去离子水溶解。
(8)加入终浓度为1mg/mL的RNase A，37℃孵育30min，之后测量浓度，用灭菌去离子水稀释至浓度为100ng/μL。
第四步，小麦对赤霉病抗性鉴定
1.禾谷镰孢菌特异基因的选择及荧光实时定量PCR引物的设计、验证
根据文献所述(Jiang et al.2020)，OSP24基因是禾谷镰孢菌的孤儿基因，在其它物种中没有同源基因。因此可以设计针对该基因的特异性引物，通过聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction,PCR)得到该基因的特异产物，以此来标记禾谷镰孢菌。
OSP24基因编号为FGSG_11564，在GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中的注册号为XM_011324759。依据公布的序列信息，设计一对PCR引物OSP24-DRT-F1(5′-CTCACAATGCCCTGGAAATAAAC-3′)和OSP24-DRT-R1(5′-CGAGCGGTAGCAAAGACAT-3′)用于扩增实验。
以第三步中抽提的DNA作为模板，进行PCR实验，用琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物。结果显示，接种前的样本中未得到任何产物，接种后的样本中得到一条长115bp的OSP24基因的DNA片段(图2)。
将上述DNA样品再次利用上述引物进行荧光实时定量PCR实验。结果显示，接种前样品的扩增曲线为平直线，熔解曲线的导数值(指示荧光信号强度)较低，表明没有有效的扩增产物产生；而接种后样品的扩增曲线正常，熔解曲线为单峰，表明扩增产物有效且单一(图3)。这些结果表明针对OSP24基因设计的上述引物能够有效指示禾谷镰孢菌的存在。
2.不同小麦品种的抗病性分析
对安农8455、扬麦158、苏麦3号接种前后的小穗DNA进行检测，采用相对定量法进行荧光实时定量PCR实验，检测样品中的OSP24基因量。以小麦Actin基因为内参，通过计算禾谷镰孢菌OSP24基因量相对于小麦Actin基因量的比值，衡量禾谷镰孢菌在小麦穗内的相对生长量，判断小麦的抗病性。具体计算方法如下：
用OSP24基因的Ct数值(threshold cycle value,又称循环阈值)减去Actin基因的Ct数值，病菌生长量计算为2Ct(Actin)-Ct(OSP24)。
结果显示，以高抗品种苏麦3号接种8h的样品为参照，此时的禾谷镰孢菌生长量数值设为1，中抗品种扬麦158和高感品种安农8455的计算值分别为20.2和25.4；接种1d后苏麦3号的计算值为9.5，扬麦158和安农8455分别为230.3和509.1；接种2d后苏麦3号的计算值为250.9，扬麦158和安农8455分别为832.8和1916.1(表1)。这些结果表明该方法能够有效区分小麦对禾谷镰孢菌的抗性。
表1侵染不同时间后小麦穗中禾谷镰孢菌相对生长量
(a)以苏麦3号侵染8h的数值为参照，将其生长量数值计算为1，数值表示为3个数值的平均值±标准差。
(b)P值的计算以苏麦3号对应时间点的数值为参照。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种快速简便高通量鉴定小麦赤霉病抗性的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，培养禾谷镰孢菌，并制备禾谷镰孢菌的孢子悬浮液；禾谷镰孢菌的孢子悬浮液中的孢子浓度为1×105个/mL；
步骤2，选取扬花期的小麦穗子，将其完全浸没在含有Tween-20的孢子悬浮液中，2min后，取出小麦穗子，基部置于装有水的容器中，用塑料袋将小麦穗子套住以保持湿度，置于培养箱中，不超过2d后，取出小麦穗子；
步骤3，将小麦穗子清洗，并提取DNA；
步骤4，用基于DNA的实时荧光定量PCR技术检测禾谷镰孢菌特有基因OSP24的量，设计针对OSP24基因的特异性引物，通过PCR技术得到OSP24基因的特异产物，以此来标记禾谷镰孢菌；
所述针对OSP24基因的特异性引物如下：
OSP24-DRT-F1（5′- CTCACAATGCCCTGGAAATAAAC-3′）；
OSP24-DRT-R1（5′- CGAGCGGTAGCAAAGACAT-3′）；
通过计算禾谷镰孢菌OSP24基因量相对于小麦Actin基因量的比值，衡量禾谷镰孢菌在小麦穗内的生长量，进而判断小麦对禾谷镰孢菌的抗性。
2.根据权利要求1所述的一种快速简便高通量鉴定小麦赤霉病抗性的方法，其特征在于：所述孢子悬浮液中，Tween-20的体积浓度为0.05% 。
3.根据权利要求1所述的一种快速简便高通量鉴定小麦赤霉病抗性的方法，其特征在于：所述步骤3中，小麦穗子剪去麦芒后，置于离心管中，用含表面活性剂的灭菌水剧烈震荡、涡旋以去除表面微生物，重复3次，每次清洗后均用干净吸水纸吸干水分。
4.根据权利要求3所述的一种快速简便高通量鉴定小麦赤霉病抗性的方法，其特征在于：所述表面活性剂为Silwet L-77。
5.根据权利要求3或4所述的一种快速简便高通量鉴定小麦赤霉病抗性的方法，其特征在于：所述灭菌水中，表面活性剂的体积浓度为0.02%。
6.根据权利要求1所述的一种快速简便高通量鉴定小麦赤霉病抗性的方法，其特征在于：所述步骤3中，采用CTAB法抽提小麦穗子DNA。
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