CN110199711B - 一种大豆腐霉根腐病抗性资源精准鉴定方法 - Google Patents

一种大豆腐霉根腐病抗性资源精准鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种大豆腐霉根腐病抗性资源精准鉴定方法，所述方法利用高温灭菌的米粒接种腐霉菌，然后用培养好的接种体接种大豆种质资源种子，采用蛭石为基质在温室培养，对所述植株的病害进行调查、分级并计算鲜重比，通过对植株鲜重比（Ratio of weight）和病害指数（Disease Index）进行方差分析和进行聚类分析，筛选抗性和感性资源，鉴定出对腐霉菌根腐病具有抗/耐性的新种质。本发明确定了大豆资源腐霉菌根腐病抗性标准评价体系，优化了病菌培养基配方，创建了米粒接种体培养和接种方法，研发了病害指数计算方法，该方法简单、实用、高效，也适用于大豆其他卵菌病害抗性鉴定研究。

Description

一种大豆腐霉根腐病抗性资源精准鉴定方法
技术领域
本发明属于植物种质资源利用研究领域，具体涉及一种大豆腐霉根腐病抗性资源精准鉴定方法。
背景技术
大豆根腐病(Soybean root rot)是国内外大豆种植区发生比较普遍、危害较重的一种世界性土传病害，在我国东北大豆产区和黄淮地区，危害最重。
我国大豆主产区黑龙江省近几年发病面积不断扩大，其中黑龙江东北部地区的病害较重，近年来随着大豆重迎茬面积的增加，根腐病危害亦日趋严重。多年研究表明，大豆根腐病原菌主要包括疫霉菌(Phytophthora spp.)、镰孢菌(Fusarium spp.)和腐霉菌(Pythium spp.)。腐霉菌是一种危害性极强的土传真菌病害，国际上已经证实有20多个菌种对大豆致病。但由于分离比例低和与其他菌种致病性状相似等原因，对大豆腐霉根腐病研究报道还很少。复合腐霉菌是引发大豆根腐病重要病原菌，全面准确评价腐霉菌病害抗性种质资源，是大豆病害防治和抗病育种的重要前提。(王克晶，李福山；我国野生大豆(G.soja)种质资源及其种质创新利用,中国农业科技导报,2000,6(2):69-72：田清震，盖钧镒；野生大豆种质资源的研究与利用，植物遗传资源科学，2000，4(1)：61-65)
美国成功将9个疫霉根腐病抗性基因应用于商业育种，显著提高了品种抗性，我国在抗病大豆新品种的培育上与国外差距很大，亟待有新突破。本发明利用米粒接种体接种鉴定大豆种质资源，建立精准高效大豆腐霉根腐病抗性技术体系，为培育高抗大豆新品种提供基因资源，对有效利用优异种质资源进行大豆抗性改良具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是利用米粒接种法精准鉴定大豆腐霉根腐病抗性资源，本发明提供了大豆腐霉接种体制备，抗/耐性资源鉴定、筛选的新种质方法。
本发明的技术方案：
大豆腐霉根腐病抗性资源精准鉴定方法，所述大豆腐霉根腐病抗性资源精准鉴定方法利用在培养基生长的菌体和灭菌的长粒大米制备腐霉根腐病接种体，然后利用米粒接种法温室接种培养筛选出对大豆腐霉根腐病具有抗/耐性的大豆种质资源，为选育大豆新品种提供具有抗/耐腐霉根腐病的新种质。
进一步地，所述大豆腐霉根腐病抗性资源精准鉴定方法包括如下步骤：
(1)腐霉菌的超长期保存(12-36个月)：将6粒大麻种子和1ml蒸馏水放入无菌瓶中灭菌，无菌环境下取2mm×2mm菌块，放入准备好的装有大麻种子和水无菌瓶中18-20℃长期保存；
(2)腐霉菌的长期保存(2-5个月)：将土豆、胡萝卜20g清洗、研磨，过滤后收集液体，加入烧杯，加水和琼脂糖20g，最后定容至1L，待加热待琼脂糖完全溶解后灭菌；将灭菌后的土豆、胡萝卜琼脂糖培养基导入小的灭菌瓶，灭菌瓶保持45度倾斜，冷却至室温。接种方法：将步骤(1)中储藏的菌块在无菌环境下小心放入无菌瓶中培养基的斜面，4℃保存；
(3)腐霉菌活化和培养：将玉米琼脂粉17g加入蒸馏水中，搅匀定容至1L，121℃灭菌25分钟，温度降至55℃后，加入1ml氨苄西林(250mg/ml)和1ml利福平(10mg/ml),然后分装到直径9cm的平板培养皿中室温冷却。接种方法：将步骤(2)储藏的菌块在无菌环境下小心切下1mm×1mm菌块，放入平板培养皿中培养4-7d；
(4)接种体的制备，具体制备方法：取625g白色长粒大米放入1000ml灭菌袋加入400ml蒸馏水，用双层灭菌膜包好，121℃灭菌40分钟，第二天冷却后，将米粒打松，将步骤(3)所培养的菌体切成小块，在无菌的条件下放入装米粒的无菌袋，混匀封袋，每隔一天混合一次，培养14d待用。
(5)温室接种：将灭菌后的蛭石装入植物育苗穴盘，浇水饱和后，每穴打6孔，每穴放入将步骤(4)所制备的接种体，然后放入一粒种子，每个鉴定的种质资源种植12个种子，用蛭石覆盖浇水至饱和，温度20-22℃，相对湿度20％，温室培养14d，调查植株病害情况；
(6)大豆种质资源抗性鉴定：调查记录步骤(5)接种植株腐霉菌造成病害植株的重量和病害指数，不设置对照。其中，植株无病害，根无病斑，记为0级；主根及侧根腐烂，减少率10％，记为1级；主根及侧根腐烂，减少率10％，记为1级；主根及侧根腐烂，植株矮化，减少率20％，记为2级；主根及侧根腐烂，植株矮化，减少率50％，记为3级；主根及侧根腐烂，植株矮化，减少率80％，记为4级；种子腐烂，无植株，记为5级。
(7)大豆种质资源抗性分级：利用步骤(6)接种植株腐霉菌造成病害植株的重量和病害指数，计算植株鲜重比(Ratio)与病害指数(Disease Index)并进行频数统计、相关性分析和不同菌种间方差显著性分析以及抗性进行多重比较分析，确定对腐霉根腐病抗/耐/感性种质资源。
进一步地，步骤(1)中所述腐霉菌是引起大豆根腐病一类卵菌属病原菌。腐霉菌以腐生的方式在土壤中可长期存活，其菌丝体和卵孢子可在病组织和土壤中越冬。腐霉菌侵染植株根系和近地面幼茎部分，导致病株生长缓慢、黄化，引起出土前或出土后幼苗猝倒、根部腐烂。
进一步地，步骤(2)所述菌种在斜面培养基上培养。将菌种接种在斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一个保藏期再转接到新的斜面培养基上。此法简便易行，存活率高。
进一步地，步骤(6)中所述对照为利用步骤(3)中未接种菌块的培养基，放入步骤(4)中含有米粒的灭菌袋制成无菌接种体，温室接种方法同步骤(5)相同。
进一步地，步骤(7)中所述植株鲜重比(Ratio of weight)与病害指数(DiseaseIndex)并分别为：植株鲜重比(RW)＝[处理植株总鲜重/处理植株数/[对照植株总鲜重/对照植株数]；病害指数(Disease Index)＝∑[5×5级植株数+……+0×0级植株数]/[5×对照植株数]；
本发明的有益效果：
本发明利用米粒培养法制备接种体，然后在温室模拟自然环境进行接种，来深入评价大豆种质资源对腐霉根腐病抗性，准确筛选抗性资源；确定了一个准确划分腐霉根腐抗性级别的评价标准，根据腐霉根腐病病害的表现为5个级别并赋值，对植株鲜重比(Ratioof weight)与病害指数(Disease Index)进行相关性分析和方差分析确定差异显著的资源，同直接在培养基上用种子腐烂率测试法相比，大大增强了可靠性和准确性；该方法简单、实用、高效，也适用于大豆其他卵菌病害的研究。
附图说明
图1为本发明所述大豆腐霉根腐病抗性资源精准鉴定方法示意图；
图2为本发明具体实施方式大豆种质资源腐霉根腐病接种及抗病表现示意图；
图3为本发明具体实施方式大豆种质资源腐霉根腐病病害分级示意图；
图4.大豆种质资源腐霉根腐抗性统计分析图；
图5为本发明具体实施方式中变量植株鲜重比和病害指数的正态分布图；
图6为本发明具体实施方式中植株根重与植株重关系图；
图7为本发明具体实施方式植株鲜重比与病害指数关系图；
图8为变量植株鲜重比和病害指数进行方差时病菌差异显示图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细描述。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
相反，本发明涵盖任何由权利要求定义的在本发明的精髓和范围上做的替代、修改、等效方法以及方案。进一步，为了使公众对本发明有更好的了解，在下文对本发明的细节描述中，详尽描述了一些特定的细节部分。对本领域技术人员来说没有这些细节部分的描述也可以完全理解本发明。
实施例1
一种利用米粒培养基接种法鉴定大豆抗腐霉根腐病种质资源的方法。所述米粒培养基接种法利用高温灭菌的米粒接种腐霉菌，然后用培养好的接种体接种大豆种质资源种子，采用蛭石为基质在温室培养，对所述植株的病害进行调查、分级并计算鲜重比，通过对植株鲜重比(Ratio)和病害指数(Disease Index)进行方差分析，对植株鲜重比(Ratio)和病害指数(Disease Index)进行聚类分析，筛选抗性和感性资源，鉴定出对腐霉菌根腐病具有抗/耐性的新种质。(如图1所示)。
所述大豆腐霉根腐病抗性资源精准鉴定方法包括如下步骤：
(1)腐霉菌活化和培养：接种方法：将步骤(2)储藏的菌块在无菌环境下，从培养腐霉菌的V8培养基上取1个1mm2的小块，放在包含培养基的直径9cm培养基的平皿中心，培养3d。
(2)接种体的制备，具体制备方法：将含菌的培养基切成小块后放入灭菌的米粒培养基14d。
(3)温室接种：将3粒接种体同1粒大豆种子种植于蛭石培养钵。试验采用双因素多重区组设计，共3个菌种，2种米粒培养基，共10个参试品种。每个大豆品种12株，每个菌种均设3次重复，以不接菌培养基为对照。记录腐霉菌造成病害植株的重量和病害指数。
(4)病害调查与分级：植株无病害，根无病斑，记为0级；主根及侧根腐烂，减少率10％，记为1级；主根及侧根腐烂，减少率10％，记为1级；主根及侧根腐烂，植株矮化，减少率20％，记为2级；主根及侧根腐烂，植株矮化，减少率50％，记为3级；主根及侧根腐烂，植株矮化，减少率80％，记为4级；种子腐烂，无植株，记为5级。
(5)病害评价与分析：计算植株鲜重比(Ratio of weight)与病害指数(DiseaseIndex)并分别为：植株鲜重比(RW)＝[处理植株总鲜重/处理植株数/[对照植株总鲜重/对照植株数]；病害指数(Disease Index)＝∑[5×5级植株数+……+0×0级植株数]/[5×对照植株数]；分析表明，变量植株鲜重比(Ratio)和病害指数(Disease Index)均符合正态分布，其正态分布图如图5所示。
分析表明植株根重与植株重呈正相关，植株鲜重比(Ratio)与病害指数(DiseaseIndex)呈显著负相关，说明病害指数可以作为抗性评价依据，如图6和图7所示。
(6)不同菌种间方差显著性分析：
分析表明，变量植株鲜重比(Ratio)和病害指数(Disease Index)进行方差时，病菌14与23和30差异显著，如图8所示。
(7)不同培养基间方差显著性分析：
分析表明，米粒与谷粒两种培养基间，植株鲜重比(Ratio)和病害指数(DiseaseIndex)均不存在显著差异。
Test of Homogeneity of Variances
Figure BDA0002101630750000091
ANOVA
Figure BDA0002101630750000092
(8)大豆种质资源对腐霉菌抗性效应的方差分析：
方差分析表明，通过多重比较病害指数(Disease Index)可分为5个区组，其中品种9，11，5，12为相对耐抗区组，而10为相对敏感区组。植株鲜重比(Ratio)可分为3个区组，其中品种9，11，5，12等为相对耐抗区组，而10为相对敏感区组。从分析结果看二者结果相近，但病害指数(Disease Index)分析方法和均不存在显著差异。更适合品种抗性级别分析。
Index
Figure BDA0002101630750000101
Means for groups in homogeneous subsets are displayed.
a.Uses Harmonic Mean Sample Size＝18.000.
Ratio
Figure BDA0002101630750000102
Means for groups in homogeneous subsets are displayed.
a.Uses Harmonic Mean Sample Size＝18.000.
(9)腐霉菌抗性效应的方差分析：
分别对腐霉菌抗性效应的方差进行分析，不同品种之间差异与整体分析结果一致，其中上看，其中品种9和10在不同菌种中差异显著，分别为抗、感品种。以菌种14为例，可以看出，品种9和10的植株鲜重比(Ratio)和病害指数(Disease Index)均存在显著差异。
ANOVA for Disease Index
Figure BDA0002101630750000111
Index
Figure BDA0002101630750000112
Means for groups in homogeneous subsets are displayed.
Based on observed means.
The error term is Mean Square(Error)＝.002.
a.Uses Harmonic Mean Sample Size＝3.000.
b.Alpha＝.05.
ANOVA for Ratio
Figure BDA0002101630750000113
ratio
Figure BDA0002101630750000121
Means for groups in homogeneous subsets are displayed.
Based on observed means.
The error term is Mean Square(Error)＝.008.
a.Uses Harmonic Mean Sample Size＝3.000.
b.Alpha＝.05.
通过对植株鲜重比(Ratio)和病害指数(Disease Index)进行方差分析，结果表明不同菌种间、不同品种间植株鲜重比(Ratio)和病害指数(Disease Index)均存在现在差异，初步筛选到了抗性品种9和感性资源品种10，为开展种质创新奠定了基础。
以上所述的实施例，只是本发明较优选的具体实施方式的一种，本领域的技术人员在本发明技术方案范围内进行的通常变化和替换都应包含在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种大豆腐霉根腐病抗性资源精准鉴定方法，其特征在于，所述方法利用高温灭菌的米粒接种腐霉菌，然后用培养好的接种体接种大豆种质资源种子，采用蛭石为基质在温室培养，对接种大豆种质资源种子长成的植株进行病害调查、分级并计算鲜重比，通过对植株鲜重比和病害指数进行方差分析和进行聚类分析，筛选抗性和感性资源，鉴定出对腐霉菌根腐病具有抗/耐性的新种质大豆种质资源种子；
所述方法具体包括以下步骤：
(1)腐霉菌的超长期保存：
保存时间：12-36个月；
保存方法：将6粒大麻种子和1ml蒸馏水放入无菌瓶中灭菌，无菌环境下取2mm×2mm菌块，放入准备好的装有大麻种子和水的无菌瓶中18-20℃长期保存；
(2)腐霉菌的长期保存
保存时间：2-5个月；
保存方法：将土豆、胡萝卜20g清洗、研磨，过滤后收集液体，加入烧杯，加水和琼脂糖20g，最后定容至1L，加热待琼脂糖完全溶解后灭菌；将灭菌后的土豆、胡萝卜琼脂糖培养基导入灭菌瓶，灭菌瓶保持45度倾斜，冷却至室温；
接种方法：将步骤(1)中储藏的菌块在无菌环境下小心放入无菌瓶中培养基的斜面，4℃保存；
(3)腐霉菌活化和培养：将玉米琼脂粉17g加入蒸馏水中，搅匀定容至1L，121℃灭菌25分钟，温度降至55℃后，加入1ml氨苄西林(250mg/ml)和1ml利福平(10mg/ml),然后分装到直径9cm的平板培养皿中室温冷却；
接种方法：将步骤(2)储藏的菌块在无菌环境下小心切下1mm×1mm菌块，放入平板培养皿中培养4-7d；
(4)接种体的制备，具体制备方法：取625g白色长粒大米放入1000ml灭菌袋加入400ml蒸馏水，用双层灭菌膜包好，121℃灭菌40分钟，第二天冷却后，将米粒打松，将步骤(3)所培养的菌体切成小块，在无菌的条件下放入装米粒的无菌袋，混匀封袋，每隔一天混合一次，培养14d待用；
(5)温室接种：将灭菌后的蛭石装入植物育苗穴盘，浇水饱和后，每穴打6孔，每穴放入将步骤(4)所制备的接种体，然后放入一粒种子，每个鉴定的种质资源种植12个种子，用蛭石覆盖浇水至饱和，温度20-22℃，相对湿度20％，温室培养14d，调查植株病害情况；
(6)大豆种质资源抗性鉴定：调查记录步骤(5)接种植株腐霉菌造成病害植株的重量和病害指数，设置对照；
(7)大豆种质资源抗性分级：利用步骤(6)接种植株腐霉菌造成病害植株的重量和病害指数，计算植株鲜重比(Ratio)与病害指数(Disease Index)并进行频数统计、相关性分析和不同菌种间方差显著性分析以及抗性进行多重比较分析，确定对腐霉根腐病抗/耐/感性种质资源。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(6)大豆种质资源抗性鉴定方法如下：植株无病害，根无病斑，记为0级；主根及侧根腐烂，减少率10％，记为1级；主根及侧根腐烂，减少率10％，记为1级；主根及侧根腐烂，植株矮化，减少率20％，记为2级；主根及侧根腐烂，植株矮化，减少率50％，记为3级；主根及侧根腐烂，植株矮化，减少率80％，记为4级；种子腐烂，无植株，记为5级。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述腐霉菌是引起大豆根腐病一类卵菌属病原菌，腐霉菌以腐生的方式在土壤中可长期存活，其菌丝体和卵孢子可在病组织和土壤中越冬，腐霉菌侵染植株根系和近地面幼茎部分，导致病株生长缓慢、黄化，引起出土前或出土后幼苗猝倒、根部腐烂。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)菌种在斜面培养基上培养；将菌种接种在斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于4℃的冰箱中保藏，每隔一个保藏期再转接到新的斜面培养基上。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(6)中对照为利用步骤(3)中未接种菌块的培养基，放入步骤(4)中含有米粒的灭菌袋制成无菌接种体，温室接种方法与步骤(5)相同。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(7)中植株鲜重比与病害指数比分别为：
植株鲜重比(RW)＝[处理植株总鲜重/处理植株数/[对照植株总鲜重/对照植株数]；
病害指数(Disease Index)＝∑[5×5级植株数+……+0×0级植株数]/[5×对照植株数]。
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