CN105506057A - 一种利用水稻离体叶片进行纹枯病接种和抗性评价的方法 - Google Patents

Abstract

本发明设计了一种精确控制水稻离体叶片纹枯病接种条件的纹枯病接种和抗性评价方法，包括水稻种植、纹枯菌培养、纹枯病菌接种、水稻离体叶片接种后病情调查及统计、接种纹枯病菌水稻材料的取样、水稻RNA提取及RT-PCR鉴定等步骤，建立了对离体叶片发病程度进行量化评价和精确地进行分子检测检的实验程序，从而提高水稻抗纹枯病种质材料的筛选和研究效率。

Description

一种利用水稻离体叶片进行纹枯病接种和抗性评价的方法

技术领域

本发明涉及水稻纹枯病，尤其是一种利用水稻离体叶片进行纹枯病接种和抗性评价的方法。

背景技术

水稻纹枯病是水稻的重要病害之一。其病原物为立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)，属于寄主范围较广泛的半腐生性真菌，一般在高温高湿的环境条件下侵染分蘖期水稻，由靠近水面的叶鞘开始侵染和扩展，也可以危害叶片、茎秆甚至稻穗，引起结实率下降，严重的导致植株枯死。水稻纹枯病分布于大部分水稻种植区，可以造成高达50％以上的产量损失。随着矮秆品种推广、氮肥用量增加以及气候变化等，水稻纹枯病的危害逐渐加重，成为水稻稳产和高产的严重障碍。

水稻对纹枯病的抗性属于典型的数量性状。迄今为止，还没有发现高抗或免疫的主基因抗病水稻材料，开展纹枯病抗病遗传育种研究难度较大。水稻纹枯病接种和抗性评价方法是筛选抗纹枯病遗传资源和培育抗病品种的重要前提。水稻纹枯病大田成株期接种方法，可靠性和重复性较好，但是田间鉴定的环境可控性差，受季节限制，试验周期较长。水稻纹枯病苗期接种具有实验规模小、发病环境可控、鉴定周期短等优点，然而对接种稻苗进行病情调查的时间点不易把握，不同品种的生长势差异等都会影响鉴定结果。

发明内容

本发明要解决上述现有技术的缺点，提供一种用于精确控制纹枯病接种实验条件，精确评价病害发生程度，从而提高水稻抗纹枯病种质材料的筛选和研究效率的利用水稻离体叶片进行纹枯病接种和抗性评价的方法。

本发明解决其技术问题采用的技术方案：

一种利用水稻离体叶片进行纹枯病接种的方法，包括以下步骤：

1)水稻种植：种植不同品种的水稻，从分蘖期的水稻植株中，剪取生理状态一致的叶片组织，进行纹枯病接种；

2)纹枯菌培养：将带有纹枯菌菌丝的琼脂块接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基的平板上进行培养；

3)纹枯病菌接种：将剪取的叶片组织背面朝上紧贴在水琼脂上，分别接种含有不同纹枯病菌株的马铃薯葡萄糖琼脂块，并进行培养；

4)水稻离体叶片接种后病情调查及统计：利用数字扫描仪，将同一培养皿中不同水稻品种的离体叶片同时进行扫描，对扫描照片上的病斑面积进行像素换算，计算相对病斑面积，作为衡量病害严重程度的评价指标；

一种利用水稻离体叶片进行抗性评价的方法：包括以下步骤：

1)接种纹枯病菌水稻材料的取样：权利要求1中在纹枯病菌接种24h和48h的时间点，分别从菌株和无菌对照的水稻材料取样；

2)水稻RNA提取及RT-PCR鉴定：对其中水稻病程相关基因进行实时定量RT-PCR分析。

其中，供试水稻材料为：纹枯病抗性品种YSBR1，感病品种Lemont和泰粳394。供试纹枯病菌系为YN-7和MH12。

发明有益的效果是：本研究利用含有苯并咪唑保鲜剂的水琼脂进行接种，提高了离体叶片接种方法的稳定性和准确性；采用病斑面积积分换算方法，计算水稻叶片的相对病斑面积，将发病程度进行量化，取得了较好的效果。

附图说明

图1：利用水稻离体叶片进行抗纹枯病接种鉴定。其中A是纹枯菌生长3d的PDA培养基(左)，长满菌丝的菌块已切出，供纹枯病接种(右)；B是接种纹枯病菌的水稻离体叶片。

图2：不同水稻品种分别接种纹枯病菌株YN-7和MH12。其中A代表纹枯菌菌株YN-7接种水稻品种YSBR1、Lemont、泰粳394离体叶片第三天时照片；B代表纹枯菌菌株MH12接种水稻品种YSBR1、Lemont、泰粳394离体叶片第三天时照片。

图3：水稻接种纹枯病菌后，病程相关基因的相对表达量变化。其中Y代表水稻供试品种YSBR1，L代表水稻供试品种Lemont；h代表水稻材料未接种纹枯病菌，hpi代表水稻材料接种纹枯病菌；24和48分别代表材料处理后的两个时间点；*代表处理组与对照组基因相对表达量存在显著差异(P＜0.05)，**代表处理组与对照组基因相对表达量存在极显著差异(P<0.01)。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步说明：

实施例：

水稻种植：将YSBR1、Lemont和泰粳394的种子封装于羊皮纸袋中进行浸种发芽，发芽第6d挑选长势基本一致的稻芽点播于育秧田中，25d后将生长良好的秧苗移栽大田。在水稻分蘖时期(大约移栽后30d)，从叶色浓绿、无病虫害、生长健壮的分蘖，剪取完全展开的倒一叶或倒二叶，进行纹枯病接种。

纹枯菌培养：用无菌手术刀将带有纹枯菌菌丝的琼脂块切成0.4～0.5cm小块，接种到含0.005％四环素(wt·vol)和20ml马铃薯葡萄糖琼脂(potatodextroseagar，PDA)培养基的平板上，封口膜封口，倒置放在28℃培养箱中，进行活化培养2～3d，培养基表面长满白色菌丝后拿出。将来自活化培养的菌块，接种到新的PDA培养基，相同条件下进行扩大培养。

纹枯病菌接种：剪取叶片中间4-5cm长的部分，平铺于含有苯并咪唑(0.0001g·ml)的水琼脂培养基(0.005g·mlagar)上。叶片正面紧贴培养基表面。在含纹枯菌的培养皿相同半径处，用表面灭菌的打孔器取直径7mm带菌丝的PDA琼脂块(图1-A)，将菌块置于离体叶片中间部位，带菌丝的一面紧贴叶片背轴面(图1-B)。封口膜封口，置28℃培养。每个含有水琼脂的培养皿作为1个接种重复，其中每个水稻品种取1个离体叶片组织，接种1个带菌琼脂块。用无菌琼脂块接种相同水稻材料，作为对照。

水稻离体叶片接种后病情调查及统计：接种纹枯病菌后72h，利用数字扫描仪，将同一培养皿中不同水稻品种的离体叶片同时进行扫描。利用Photoshop软件，对扫描照片上的病斑面积进行像素换算，计算相对病斑面积(relativelesionarea,RLA)，即单位叶面积的病斑面积，作为衡量病害严重程度的评价指标。RLA的计算公式为：RLA＝病斑面积/叶片面积＝病斑区域像素/叶片区域像素。通过Tukey法进行品种间病级的多重比较，确定不同品种的纹枯病抗性。

接种纹枯病菌水稻材料的取样：在接种24h和48h的时间点，于无菌操作台中打开培养皿，分别从YN-7菌株和无菌对照的水稻材料取样。剪取以琼脂块为中心的菌丝扩展区域(叶片径向约2cm长)，5～6块叶组织混合，迅速置于液氮冷冻，然后于-80℃保存备用。

水稻RNA提取及RT-PCR鉴定：用TRIzol试剂(Invitrogen,USA)提取水稻RNA。1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，用NanoDrop紫外-可见光分光光度计(NanoDrop8000UV-VisSpectrophotometer)检测RNA浓度和纯度。RNA反转录采用PrimeScriptTMRTreagentKit试剂盒(TaKaRa公司)并按说明书进行操作。以反转录的cDNA为模板，利用水稻病程相关基因的特异引物(表1)，进行实时定量RT-PCR分析。设置3次重复，采用SYBRPremixExTaqⅡ(2x)实时定量试剂盒(TaKaRa公司)的反应体系。以EF-1α为内参基因，采用2^-⊿⊿Ct方法，进行RT-PCR数据分析。

表1：水稻病程相关基因的RT-PCR引物

水稻大田成株期纹枯病接种鉴定：2014年4～10月在扬州大学进行水稻品种YSBR1、Lemont和泰粳394的大田成株期纹枯病接种试验。水稻种子于5月3～7日发芽，5月9日播种。秧苗于6月9日移栽大田，每个小区栽插3行，每行12个单株。每个品种种植3次重复，随机区组设计。在水稻分蘖末期(7月27～29日)，取小区第2行(即中间行)的10个植株，每株取3个分蘖，采用嵌入法，接种纹枯病菌系YN-7。在抽穗后30d(10月9～12日)，采用Rush等提出的0～9级病情评价体系，评定个体病级。

水稻苗期纹枯病接种鉴定：采用本实验室优化的纹枯病“微室”接种法，进行水稻苗期抗纹枯病接种鉴定。接种后7～9天，测量水稻植株病斑高度和叶枕高度，计算单株病级，利用DPS生物统计软件进行病级数据的方差分析。通过Tukey法进行品种间病级的多重比较。

结果与分析：

水稻离体叶片纹枯病菌接种的病级数据分析：为了检测水稻品种YSBR1、Lemont、泰粳394对纹枯病菌的抗感程度，从分蘖期的水稻植株，剪取生理状态一致的叶片组织，背面朝上紧贴在水琼脂上，分别接种含有纹枯病菌株YN-7和MH12的PDA琼脂块，于28℃恒温箱中培养。在接种第三天时观察，不同品种的叶片出现面积大小不等的纹枯病病斑(图2)。YSBR1叶片的大部分保持青绿色，病斑面积较小；Lemont和泰粳394的叶色发黄，病斑蔓延叶片2/3以上。

利用数字扫描仪，对接种3d的离体叶片进行扫描。用Photoshop软件，将扫描照片上的病斑面积进行像素换算，计算相对病斑面积(RLA)，然后对YSBR1、Lemont和泰粳394的RLA数据进行方差分析(表2)。在YN-7菌株和MH12菌株的接种试验中，YSBR1和泰粳394的RLA数据均呈显著差异(P<0.05)，YSBR1表现抗病，泰粳394感病。Lemont的离体叶片材料，用以上两个菌株进行了6次接种试验。除了用MH12菌株接种的第3次试验，在其它5次试验中，Lemont和YSBR1的RLA数据均表现显著差异(P<0.05)。在以上离体叶片的接种试验中，感病品种Lemont和泰粳394的相对病斑面积均无显著差异(P>0.05)。

注1:分别用2个不同的纹枯病菌株接种3个水稻品种，每个菌株做3次重复，每个重复包括10皿；根据病斑面积积分换算的方法，计算每皿离体叶片的相对病斑面积。

注2:对3个水稻品种的平均相对病斑面积进行方差分析和多重比较；带有不同字母的品种平均相对病斑面积具有显著差异(P<0.05)。

表2：纹枯病菌侵染水稻离体叶片相对病斑面积的统计分析

离体叶片接种后水稻病程相关基因的qRT-PCR分析：受到病原菌侵染的植物会启动一系列复杂高效的保护机制，包括病程相关基因的激活，以抵抗病原菌的侵袭。在接种24h和48h，取纹枯病菌株YN-7和无菌对照的离体叶片材料，对其中水稻病程相关基因OsPR1b、OsPR3、PBZ1、转录因子E2F以及PDR进行实时定量RT-PCR分析。比较接种处理和无菌对照的基因相对表达量，结果表明：以上5个基因，在YSBR1和Lemont的24h或48h接种材料中均表现上调(接种处理的基因相对表达量显著或极显著高于对照的相应表达量，图3)。OsPR1b、PBZ1和PDR在YSBR1中相对表达量的峰值，高于Lemont中的相应峰值。YSBR1中E2F相对表达量的峰值，则低于Lemont的相应峰值。OsPR3在YSBR1和Lemont中的表达模式相差不大。根据上述结果，离体叶片材料中水稻病程相关基因呈典型诱导表达，说明纹枯病菌已侵染水稻叶片组织。

供试水稻品种田间成株期和苗期微室法接种验证：对YSBR1、Lemont和泰粳394进行了大田成株期纹枯病接种试验。根据Rush等的0～9级病情评价体系，YSBR1、Lemont和泰粳394的平均病级分别为：2.85(抗病)，7.60(感病)，4.31(中等感病)，相互之间呈显著差异(表3)。此外，根据水稻苗期“微室”接种试验结果，YSBR1、Lemont和泰粳394的苗期平均病级分别为2.98(抗病)，7.65(感病)和6.19级(感病)，相互呈显著差异(表4)。因此，上述结果验证了抗病和感病品种YSBR1和Lemont之间，以及YSBR1和泰粳394之间的纹枯病病级差异。

注1:每个水稻单株接种3个分蘖，计算每个分蘖的纹枯病病级，根据分蘖病级的平均数，计算水稻单株病级。

注2:对3个水稻品种的单株病级进行方差分析和多重比较，带有不同字母的品种平均病级具有显著差异(P<0.05)。

表3：水稻品种的大田成株期纹枯病接种病情调查数据和品种间多重比较

注1：每个微室作为一次实验重复，接种4～5个单株，基于“叶枕高”计算单株平均病级，作为每个重复的平均病级。

注2：对3个水稻品种的微室平均病级进行方差分析和多重比较，带有不同字母的品种平均病级具有显著差异(P<0.05)。

表4：基于“叶枕高”的纹枯病病级以及水稻品种病级数据的多重比较

讨论：

本发明对接种条件进行更精确的控制，并采用了量化的病情调查方法。其中采用水琼脂进行接种的好处是：在水琼脂的表面比较平展，水稻叶片组织的各个局部区域，都能获得比较均匀的供水和保湿效果；水琼脂相当于培养基，在其中加入了含有苯并咪唑的植物激素类有机化合物，能够保持离体叶片细胞的生命活力以及产生保绿的效果，通过水琼脂提供给叶片细胞苯并咪唑的持续性和均匀性比较好；水琼脂培养基经过灭菌，可以减少离体叶片接种过程中污染的细菌和真菌所产生的干扰。另外，在关于两个纹枯病菌株的6次重复接种试验中，有5次试验取得了抗病和感病品种的相对病斑面积表现显著差异的结果。大田接种试验以及苗期“微室”接种试验进一步验证了上述结果。改进的离体叶片接种方法具有快速简便和易于重复的优点，适用于大规模水稻种质材料抗纹枯病性状的筛选。

根据水稻离体叶片病程相关基因的RT-PCR分析结果，在纹枯病接种条件下，OsPR1b、OsPR3、PBZ1、E2F和PDR呈典型的诱导表达。并且，抗病品种OsPR1b、PBZ1和PDR诱导表达的水平，显著高于感病品种。Wang等对抗纹枯病的OsWRKY4过表达转基因水稻和未转化品种进行RT-PCR分析，OsPR1b和PBZ1在纹枯病菌侵染条件下呈诱导表达，并且抗病株系诱导表达的峰值，显著高于未转化感病品种。因此，水稻病程相关基因表达量的变化，验证了纹枯病菌对水稻离体叶片组织的侵染。这种在精确控制的环境条件下检测水稻基因表达的实验体系，可以运用于水稻和纹枯病菌分子互作的研究。

本发明对水稻离体叶片抗纹枯病接种方法、大田成株期以及苗期接种方法进行了比较。在抗病品种和感病品种的差异显著性方面，3种方法取得了一致的试验结果。对于抗感差异较小的中感品种和感病品种，离体叶片接种的相对病斑面积差异性不显著。因此，在水稻抗纹枯病种质筛选过程中，建议利用离体叶片方法快速简便的优势，先用该方法筛选抗性水平较高的水稻材料，再结合其它接种方法，对筛选材料进行验证，从而满足大规模水稻抗性种质资源筛选的需求。

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims (4)

1.一种利用水稻离体叶片进行纹枯病接种的方法，包括以下步骤：

1)水稻种植：种植不同品种的水稻，从分蘖期的水稻植株中，剪取生理状态一致的叶片组织，进行纹枯病接种；

2)纹枯菌培养：将带有纹枯菌菌丝的琼脂块接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基的平板上进行培养；

3)纹枯病菌接种：将剪取的叶片组织背面朝上紧贴在水琼脂上，分别接种含有不同纹枯病菌株的马铃薯葡萄糖琼脂块，并进行培养；

4)水稻离体叶片接种后病情调查及统计：利用数字扫描仪，将同一培养皿中不同水稻品种的离体叶片同时进行扫描，对扫描照片上的病斑面积进行像素换算，计算相对病斑面积，作为衡量病害严重程度的评价指标。

2.根据权利要求1所述的利用水稻离体叶片进行纹枯病接种的方法，其特征是：步骤1)中水稻品种分别有YSBR1、Lemont和泰粳394。

3.根据权利要求1所述的利用水稻离体叶片进行纹枯病接种的方法，其特征是：步骤3)中纹枯病菌株的菌系分别有YN-7和MH12。

4.一种利用水稻离体叶片进行抗性评价的方法：包括以下步骤：

1)接种纹枯病菌水稻材料的取样：权利要求1中在纹枯病菌接种24h和48h的时间点，分别从菌株和无菌对照的水稻材料取样；

2)水稻RNA提取及RT-PCR鉴定：对其中水稻病程相关基因进行实时定量RT-PCR分析。