CN110243478B - 一种利用热红外监测获取dse施加剂量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用热红外监测获取DSE施加剂量的方法。该方法依次包括如下步骤：(1)播种若干粒植物种子并施加不同剂量的微生物；(2)培养，由热红外成像仪测定植物出苗后30‑50d的冠层温度，根据植物的冠层温度确定微生物的施加剂量；植物的冠层温度越低，微生物促进植物生长的效果越好。实验证明，采用本发明提供的方法可以获取微生物施加剂量。本发明具有重要的应用价值。

Description

一种利用热红外监测获取DSE施加剂量的方法
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一种利用热红外监测获取DSE施加剂量的方法。
背景技术
深色有隔内生真菌(dark septate endophytes，DSE)是植物内生真菌的主要类群，其主要特征是菌丝颜色较深，具有明显隔膜，定植于健康植物根系的表皮、皮层甚至纤维管束组织的细胞或细胞间隙，形成共生体，而不引起植物病变。DSE可以在高山、极地、低pH土壤等逆境和极端环境中生存。据统计，DSE宿主范围涵盖114科320属的近600种植物，在菌根植物和莎草科、十字花科、藜科等传统非菌根植物的根中均发现DSE定植。DSE能促进植物生长，提高宿主植物的抗逆性和抗病性。DSE能增加宿主植物的光合效果，促进植物根系发育，从而提高植物对土壤中水分的利用率，根系可以将更多的水分运输到植物地上部分，保持水势平衡。DSE真菌的研究主要集中在真菌与植物菌苗的培养方法以及真菌对宿主植物的促生、抗逆效应研究。
热红外成像仪是通过非接触方式探测物体的红外能量，并将其转换为电信号，进而在显示器上生成热图像，并可以对热图像进行处理的一种电子检测设备。热红外成像技术是利用热红外成像仪监测物体热反应特征的一种技术。近些年，热红外成像技术在精准农业中应用较多，可有效指导生产实践。植物气孔开闭和应激产生的化学物质对植物温度的影响较大，这也是应用热红外监测植物温度的前提条件。其中，农作物在生长过程中受环境和气候的影响较大，在农产品的质量和产量上间接反应出来，运用热红外技术可以快速准确的测定农作物表面温度变化和热反应特征，并同步监测环境因子，实时监测农作物的生长状况，以探索环境因子对农作物生长生理指标的影响，对作物的生理状况，是否受到干旱、高温、盐碱、寒潮、病虫害等非生物或生物胁迫做出判断和预警。
发明内容
本发明的目的是获取具有促进植物生长功能的微生物(如链格孢(Alternariasp.)001CGMCC No.17463)的施加剂量。
本发明首先保护一种获取微生物施加剂量的方法，可包括如下步骤：
(1)播种若干粒植物种子并施加不同剂量的微生物；
(2)完成步骤(1)后，培养，根据植物的冠层温度确定微生物的施加剂量。
上述方法中，所述微生物具有促进植物生长的功能。
上述方法中，所述植物种子可为植物出芽种子。
本发明还保护一种筛选具有促进植物生长功能的目的微生物的方法，可包括如下步骤：
(a1)取植物，用待测微生物处理；
(a2)完成步骤(a1)后，培养，根据植物的冠层温度筛选目的微生物。
上述任一所述的方法中，所述“根据植物的冠层温度确定微生物的施加剂量”或所述“根据植物的冠层温度筛选目的微生物”的判定原则可为植物的冠层温度越低，微生物促进植物生长的效果越好。
上述任一所述植物可为如下c1)至c5)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)禾本科植物；c4)玉米；c5)玉米品种中糯一号。
上述任一所述的方法中，所述微生物可为真菌。所述真菌可为链格孢(Alternariasp.)真菌。
上文中，当植物为玉米品种中糯一号时，每株玉米施加的链格孢(Alternariasp.)真菌的最佳剂量可为124.4mg链格孢(Alternaria sp.)真菌的干物质。
所述链格孢(Alternaria sp.)真菌具体可为链格孢(Alternaria sp.)001，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.17463。
上述任一所述“植物的冠层温度”可为植物出苗后30-50d的冠层温度。当植物为玉米品种中糯一号时，可为出苗后30-50d(如30-35d、35-45d、45-50d、30d、35d、45d或50d)的冠层温度。
上述任一所述冠层温度可由热红外成像仪采集图像后测定。
本发明还保护上述任一所述的方法的应用，可为b1)至b3)中的至少一种：b1)植物生产；b2)植物种植；b3)调节植物生长。
本发明还保护植物的冠层温度的应用，可为d1)或d2)：d1)获取微生物施加剂量；d2)筛选目的微生物。
上文中，促进植物生长可表现为生物量增加。所述生物量可为根干重、茎干重和叶干重中的至少一种。
生物量属于玉米成熟期获得的指标。本发明通过热红外成像仪检测玉米出苗后30-50d(如玉米出苗后第35d、玉米出苗后第45d)的冠层温度，从而评价菌剂促进植物生长的效果，即获得菌剂的最佳施加剂量。玉米出苗后30-50d的冠层温度越低，则该菌剂促进植物生长的效果越好，该菌剂的施用剂量最佳。采用本发明提供的方法可以获取链格孢(Alternaria sp.)001CGMCC No.17463的最佳施加剂量。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为玉米出苗后第22d的玉米热红外图像。
图2为用软件处理玉米出苗后第22d的玉米热红外图像时选择的感兴趣区域。
图3为用软件处理玉米出苗后第22d的玉米热红外图像时获得冠层温度。
图4为各组玉米出苗后第22d、第35d和第57d的冠层温度的统计结果。
保藏说明
菌种名称：链格孢
拉丁名：Alternaria sp.
菌株编号：001
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2019年04月08日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.17463
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
玉米品种中糯一号(以下简称中糯一号)的种子为北京中农作科技发展有限公司的产品，认证号为0103006-2000。
PDA固体培养基：取去皮马铃薯200g，切成小块，加入1.0L蒸馏水，煮沸30min；纱布过滤后收集滤液，向滤液中加入葡萄糖20.0g、KH2PO4 3.0g、MgSO4.7H2O 1.5g、维生素B1 10μg和琼脂15.0g，调节pH值至6.0并用蒸馏水定容至1.0L，然后115℃灭菌15min。
PDA抗性平板：向冷却至55℃的PDA固体培养基中加入氨苄青霉素和硫酸链霉素，得到PDA抗性培养基；PDA抗性培养基中，氨苄青霉素和硫酸链霉素的浓度均为50mg/L；将PDA抗性培养基倒入无菌培养皿(直径为9cm)，自然冷却，得到PDA抗性平板。
MMN液体培养基：向适量蒸馏水中加入CaCl2 0.05g、MgSO4 0.15g、NaCl 0.025g、FeCl3 0.01g、KH2PO4 0.5g、Vitamib B1 0.0001g、(NH4)2HPO4 0.25g、Glucose 10g、Citricacid 0.2g和Malt extract 10g，调节pH值至5.5并用蒸馏水定容至1.0L，然后121℃灭菌30min。
下述实施例中的热红外成像仪为菲力尔公司的产品，型号为FLIR T630sc。热红外成像仪的主要参数见表1。
表1.热红外成像仪的主要参数
Figure BDA0002091665460000041
下述实施例中热红外成像仪采集玉米热红外图像的步骤参考说明书，具体如下：
①打开热红外成像仪，待仪器稳定后即热红外成像仪进入工作模式；
②记录热红外成像仪工作环境的温度和湿度信息；
③在热红外成像仪内设置辐射率、环境温度和湿度信息便于校正热图信息；
④使热红外成像仪的镜头对准玉米冠层，适当调节镜头与玉米冠层之间的距离，使用手动调焦或自动调焦功能，使得玉米冠层图像清晰，按下拍摄键；
⑤下一个玉米冠层热红外图像获取重复③-④步骤。
⑥拍摄完成后将热图数据导出到电脑端，在热红外专业数据处理软件(如FLIRResearchIR Max软件)中进行图像处理与分析。
下述实施例中FLIR ResearchIR Max软件处理玉米热红外图像，得到冠层温度的步骤具体如下：
①在FLIR ResearchIR Max软件中打开拍摄的玉米热红外图像；
②用矩形框选择感兴趣区域，考虑到玉米叶片弯曲和叶尖部位有枯萎的现象，感兴趣区域选择玉米顶端的两片叶子各自的中间三分之一的部位，拍摄所得的玉米叶片在图像中不一定水平，旋转矩形框使得矩形框框选在叶片中间三分之一处；
③通过添加函数计算每个感兴趣区域的平均温度，再对感兴趣区域的平均温度取平均值作为该株玉米的冠层温度。
实施例1、链格孢(Alternaria sp.)001CGMCC No.17463的分离、鉴定和保藏
一、分离
1、用无菌水充分清洗根部样品(采自内蒙古自治区锡林郭勒盟锡林浩特市北电胜利矿区的针茅根系)，然后用75％(v/v)乙醇水溶液浸泡消毒5min，无菌水冲洗2次。
2、完成步骤1后，将所述根部样品置于10％(v/v)次氯酸钠水溶液浸泡消毒5min，无菌水冲洗3次。
3、完成步骤2后，用滤纸吸去所述根部样品表面的水分，然后剪成长为1cm左右的根段。
4、完成步骤3后，将所述根段置于PDA抗性平板(每个平板上放置2-3个根段)，28℃黑暗培养14d。将在PDA抗性平板上可以生长的菌落进行分离培养并纯化。
将筛选到的真菌命名为深色有隔内生真菌001。
二、鉴定
1、形态学鉴定
将深色有隔内生真菌001接种至PDA抗性平板，28℃黑暗倒置培养14d，观察菌落特征；然后进行插片培养，观察菌丝体及产孢情况。
菌落的生长状态见图1。结果表明，菌落正面颜色为黑灰色，背面无裂痕，中央平整，边缘圆整，同心圆。
菌丝体及产孢情况如下：菌丝深灰色，局部膨大，隔间距5-25μm，厚垣孢子，聚合球形。
2、分子鉴定
(1)采用真菌基因组DNA提取试剂盒(AXYGEN公司的产品)提取深色有隔内生真菌001的基因组DNA并以其作为模板，采用ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
反应体系为50μL，由5μL 10×Ex Taq buffer(北京索莱宝科技有限公司的产品)、2μL ITS1水溶液(浓度为10μmol/L)、2μL ITS4(浓度为10μmol/L)、2μL模板、4μL dNTP Mix(浓度为2.5mM)和35μL ddH2O组成。
反应条件为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃90s，28个循环。
(2)将步骤(1)得到的PCR扩增产物进行测序。
测序结果表明，步骤(1)得到的PCR扩增产物中含有序列表中序列1所示的DNA分子。
将序列表中序列1所示的核苷酸序列提交到GenBank数据库进行Blast分析，确定其分类地位。然后用MEGA 6构建系统发育树，用于亲缘关系和系统发育分析。结果表明，深色有隔内生真菌001与链格孢(Alternaria sp.)的同源性最高。因此，深色有隔内生真菌001被鉴定为链格孢(Alternaria sp.)。
三、保藏
步骤一分离的深色有隔内生真菌001已于2019年04月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.17463。深色有隔内生真菌001的全称为链格孢(Alternaria sp.)001CGMCC No.17463，简称为DSE菌株。
实施例2、菌剂的制备
一、DSE培养菌液的制备
1、将DSE菌株接种至PDA固体培养基，28℃黑暗倒置培养14d，得到DSE菌落。
2、完成步骤1后，无菌条件下在DSE菌落上取一个菌饼，然后置于MMN液体培养基，28℃、170r/min震荡培养15d，得到DSE培养菌液。1mL DSE培养菌液中DSE菌株干物质质量为3.11mg。
二、菌剂的制备
制备菌剂1、菌剂2和菌剂3。
菌剂1由10mLDSE培养菌液和40mL MMN液体培养基混合而成。菌剂1中，DSE菌株的干物质质量为31.1mg。
菌剂2由20mLDSE培养菌液和30mL MMN液体培养基混合而成。菌剂2中，DSE菌株的干物质质量为62.2mg。
菌剂3由40mLDSE培养菌液和10mL MMN液体培养基混合而成。菌剂3中，DSE菌株的干物质质量为124.4mg。
实施例3、实施例2制备的菌剂对玉米冠层温度的影响
一、玉米芽的制备
取中糯一号的种子，先用75％(v/v)乙醇水溶液浸泡消毒5min，无菌水冲洗3次；然后用10％(m/v)次氯酸钠水溶液浸泡消毒10min，无菌水冲洗3次；最后置于铺有湿润的无菌滤纸的培养皿中，25℃黑暗培养3d，挑选长势一致的玉米芽备用。
二、DSE灭活菌液的制备
取实施例2步骤一中2制备的DSE培养菌液，121℃灭菌30min，得到DSE灭活菌液。
三、实施例2制备的菌剂对玉米冠层温度的影响
1、将粘土和沙土分别粉碎后，过筛(目数为2mm)，然后121℃灭菌2h，自然风干，依次得到风干粘土和风干沙土。
2、完成步骤1后，将风干粘土和风干沙土按照质量比为1:1充分混匀，得到混合土壤。
3、完成步骤2后，取16个塑料盆(塑料盆的规格均为外口径23.5cm，内口径20cm，高度21.5cm，底直径15cm)，先用75％(v/v)乙醇水溶液擦拭，然后用无菌水清洗数遍，晾干后装入5kg混合土壤，同时浇水至土壤最大持水量的70％，48h后加入NH4NO3、KH2PO4和KNO3晶体(作为底肥)，混匀，使土壤中N、P、K的质量分数分别为100mg/kg、25mg/kg和150mg/kg。
4、完成步骤3后，将16个塑料盆随机分成对照组、试验组1、试验组2和试验组3四组，每组4个塑料盆，进行如下实验：
对照组(即CK)：每个塑料盆播种3颗步骤一制备的玉米芽，同时每个塑料盆中加入50mLDSE灭活菌液；
试验组1(即DSE20％)：每个塑料盆播种3颗步骤一制备的玉米芽，同时每个塑料盆中加入50mL菌剂1；
试验组2(即DSE40％)：每个塑料盆播种3颗步骤一制备的玉米芽，同时每个塑料盆中加入50mL菌剂2；
试验组3(即DSE80％)：每个塑料盆播种3颗步骤一制备的玉米芽，同时每个塑料盆中加入50mL菌剂3。
5、完成步骤4后，定量浇水并使土壤湿度约为土壤最大持水量的70％。出苗后每盆定苗为1株。分别在玉米出苗后第22d、第35d和第57d，用热红外成像仪采集(采集的时刻为12:00)玉米热红外图像，然后用FLIR ResearchIR Max软件(热红外成像仪自带)处理，得到各株玉米的冠层温度；最后按组计算平均值，即获得各组玉米的冠层温度。待玉米出苗60d后收获，将根、茎、叶分离，分别测定干重(80℃烘干48h)，按组计算平均值。
玉米出苗后第22d的玉米热红外图像见图1。
用软件处理玉米出苗后第22d的玉米热红外图像时选择的感兴趣区域见图2。
用软件处理玉米出苗后第22d的玉米热红外图像时获得冠层温度见图3。
各组玉米出苗后第22d、第35d和第57d的冠层温度统计结果见表2和图4。
表2
Figure BDA0002091665460000071
注：同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
各组玉米的根干重、茎干重、叶干重和总生物量(总生物量＝根干重+茎干重+叶干重)的测定结果见表3。
表3
根干重(g) 茎干重(g) 叶干重(g) 总生物量(g)
对照组 0.74±0.29c 0.24±0.157b 1.08±0.24c 2.06
试验组1 0.72±0.12c 0.14±0.038b 0.92±0.32c 1.78
试验组2 1.83±0.56b 0.21±0.035b 1.78±0.34b 3.82
试验组3 2.63±0.30a 0.76±0.065a 3.10±0.26a 6.49
注：同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
实验结果具体如下：
(1)各组的冠层温度均低于环境温度；
(2)玉米出苗后第22d，试验组1、试验组2和试验组3的冠层温度均高于对照组；
(3)玉米出苗后第35d，随着DSE培养菌液的增加，平均冠层温度均有不同程度的降低，说明此时DSE菌株和玉米根系可能形成了良好的共生关系，施加的DSE培养菌液越多，则与玉米根系形成的共生关系越好，进而玉米根系吸收营养物质和水分也越多、玉米的气孔导度和蒸腾速率也越高，蒸腾降温效果越高，即平均冠层温度越低，Pou等在“Validationof thermal indices for water status identification in grapevine”中研究发现气孔导度可以用来确定植物水分状况，植物水势高，气孔导度高，蒸腾作用强，则植物冠层温度相对越低，Flexas等在“Diffusive and Metabolic Limitations to Photosynthesisunder Drought and Salinity in C3 Plant”中发现气孔关闭会导致碳同化率降低，影响物质积累，而张海涵在“黄土高原枸杞根际微生态特征及其共生真菌调控宿主生长与耐旱响应机制”中发现DSE真菌能够提高植物气孔导度，促进植物生长。本实验发现DSE菌液的浓度越高，DSE菌液与玉米根系共生关系越好，降温效果越高。
(4)玉米出苗后第57d，随着DSE培养菌液的增加，平均冠层温度均有不同程度的降低，但各组之间无显著差异。此时DSE菌株和玉米根系可能形成了良好的共生关系，施加的DSE培养菌液越多，则与玉米根系形成的共生关系越好，进而玉米根系吸收营养物质和水分也越多。
(5)随着DSE培养菌液的增加，玉米的根干重、茎干重和叶干重也显著增加；试验组3中玉米的根干重、茎干重和叶干重均显著高于对照组、试验组1和试验组2。试验组2和试验组3的总生物量相比对照组分别提高了85.44％和215.05％。
上述结果表明，从玉米热反应特征来看，菌剂2和菌剂3与玉米的共生效果较好；综合生物量分析，认为最佳菌剂为菌剂3。由于生物量属于玉米成熟期获得的指标，为了节省人力、物力和财力，可通过热红外成像仪检测玉米出苗后30-50d(如玉米出苗后第35d、玉米出苗后第45d)的冠层温度，从而评价菌剂促进植物生长的效果，即获得DSE培养菌液的最佳施加剂量。玉米出苗后30-50d的冠层温度越低，则该菌剂促进植物生长的效果越好，该菌剂的施用剂量最佳。
<110> 中国矿业大学（北京） 北京合生元生态环境工程技术有限公司
<120> 一种利用热红外监测获取DSE施加剂量的方法
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 608
<212> DNA
<213> 链格孢（Alternaria sp.）
<400> 1
cccttccgta gggtgaacct gcggagggat cattacacaa tatgaaagcg ggctggatac 60
tctgtagtag tggattgctt tacggcgtgc gctgctggag agcctagcct tgctgaatta 120
ttcacccgtg tcttttgcgt acttcttgtt tccttggtgg gctcgcccgc cacaaggaca 180
actcataaac cttttgtaat agcaatcagc gtcagtaaca acataataat tacaactttc 240
aacaacggat ctcttggttc tggcatcgat gaagaacgca gcgaaatgcg atacgtagtg 300
tgaattgcag aattcagtga atcatcgaat ctttgaacgc acattgcgcc ctttggtatt 360
ccaaagggca tgcctgttcg agcgtcattt gtaccctcaa gctttgcttg gtgttgggcg 420
tcttgtctcc agtccgctgg agactcgcct taaagtcatt ggcagccggc ctactggttt 480
cggagcgcag cacaagtcgc actcttttcc agccaaggtc agcgtccaac aagccttttt 540
tcaacttttg acctcggatc aggtagggat acccgctgaa cttaagcata tcaataagcg 600
gaggaaaa 608

Claims (2)

1.一种获取微生物施加剂量的方法，包括如下步骤：
(1)播种若干粒植物种子并施加不同剂量的微生物；
(2)完成步骤(1)后，培养，根据植物的冠层温度确定微生物的施加剂量；
所述“根据植物的冠层温度确定微生物的施加剂量”的判定原则为植物的冠层温度越低，微生物促进植物生长的效果越好；所述促进植物生长表现为生物量增加；生物量为根干重、茎干重和叶干重中的至少一种；
所述“植物的冠层温度”为植物出苗后35d的冠层温度；
所述植物为玉米；
所述微生物为链格孢(Alternaria sp.)001，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.17463。
2.权利要求1所述的方法的应用，为b1)至b3)中的至少一种：
b1)植物生产；
b2)植物种植；
b3)调节植物生长；
所述植物为玉米。
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