CN108118010A - 一种蚕豆根瘤菌株系Blgs20-1及其应用 - Google Patents

Abstract

一种蚕豆根瘤菌株系Blgs20‑1及其应用，该菌株是从新鲜的蚕豆根瘤中分离纯化得到的，属于根瘤菌属Rhizobium新种菌株，该菌株系于2017年10月23日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2017615。本发明的根瘤菌株系Blgs20‑1是一种共生固氮能力强、对四川蚕豆品种适应范围广，兼具有分泌IAA、溶无机磷和有机磷能力、抗逆性强的优良广谱蚕豆根瘤菌菌株；与四川的主栽蚕豆品种匹配亲和性好，在四川不同品种的蚕豆生产中，不施氮肥、接种Blgs20‑1使蚕豆增产33％以上，与不接种对照的差异达显著水平。

Description

一种蚕豆根瘤菌株系Blgs20-1及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及一种蚕豆根瘤菌株系Blgs20-1及其应用。

背景技术

中国是最大的蚕豆生产国，干蚕豆产量占世界35％(FAO2014)，是我国传统对外贸易的重要农产品资源，出口量在全国杂粮中居第二(刘玉皎等，2002)。四川省蚕豆播种面积约30万公顷，仅次于云南，总产达6亿公斤(杨武云，2003)。以蚕豆为原材料的四川郫县豆瓣全国闻名，需求量大，每年所需蚕豆达12万吨，但现在主要靠从外地进口。除了收获干蚕豆，也可以收鲜蚕豆作为经济价值较高的蔬菜，还可以用作绿肥，因此在四川种植蚕豆具有很大潜力，但是，近年来由于氮素肥料的大量投入使用，导致生产面积逐年下降，产量也较西方国家有所下降，并且氮素肥料生产成本高、利用率低，同时污染生态环境，不利于生态环境的保护和农业的可持续发展。

豆科作物接种匹配高效的根瘤菌是国际上公认的一种有效的生物固氮技术，生物固氮优质，利用率高，释放氮素过程持续，后效长，浪费少，对环境无污染 (葛诚，2007)，有利于生态环境的保护和农业的可持续发展，前人研究认为，蚕豆—根瘤菌这一共生体系固定氮素量大，其生长所需80％的氮素均来自于根瘤菌固氮，一个生长季节能够固定并提供约200Kg N/ha，远远高于大豆(100Kg N/ha) (Hardarson et al，2003)。韩梅等(2016)在青海省接种根瘤菌可以显著地提高蚕豆的产量，增加土壤肥力；王文丽等(2010)在甘肃省的蚕豆生产中接种根瘤菌以后较不接种处理生物量增加了6.48％～12.86％。面对国家化肥零增长及减施增效的重大科技需求，蚕豆的生产是可以用匹配的高效根瘤菌来实现优质高产的。

由于根瘤菌的群体分布具有地理局限性，需要注意其对应用地区环境的适应能力(陈文新等，2004)。一般来说，在某个区域内最为有效的根瘤菌往往来自本地区或者与本地区条件相似地区的菌株(崔雅琪，2014；陈文新等，2011)。因此，在根瘤菌高效固氮菌株的筛选中，不仅要考虑根瘤菌与豆科植物品种的匹配性，还必须重视菌剂应用的地域性。

现有研究表明，极少数根瘤菌还具有溶磷、、分泌生长激素(IAA)等促生特性。师尚礼(2007)等对730余株苜蓿根瘤菌进行研究，仅从这29株根瘤菌筛选到10株分泌IAA能力强的根瘤菌，对这29株菌进行溶磷能力的测定，发现全部菌株没有溶解无机磷的能力，这29个苜蓿根瘤菌都能够溶解有机磷，但溶磷能力差异较大，仅8个菌株有较强的溶解有机磷的能力，其余菌株有弱或微弱的溶有机磷的能力。

目前有关蚕豆高效根瘤菌的筛选应用，除了青海、甘肃地区(刁治民，2002；韩梅等，2010；王文丽等，2010)、及河北地区(王瑞，2016)有相关性报道外，还未见其他报道。为此，针对四川的主栽品种进行蚕豆广谱优良菌株的筛选，对四川蚕豆生产中充分发挥生物固氮作用，筛选优良菌株资源，减少化肥施用或不施氮肥，同时对于保护生态环境，推动农业可持续发展具有重要实践价值。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种高效固氮的蚕豆根瘤菌株系Blgs20-1，具有分泌IAA、一定溶磷能力，并有较好的田间生产应用前景。

本发明采取的技术方案：

一种蚕豆根瘤菌株系Blgs20-1，其分类命名为Rhizobiumsp.Blgs20-1，是快生根瘤菌属(Rhizobium)的一个潜在新种，于2017年10月23日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2017615。

所述蚕豆根瘤菌株Blgs20-1应用于四川蚕豆主产区成都平原地区蚕豆的生产。

本发明的有益效果：

本发明的根瘤菌株Blgs20-1是一种共生固氮能力强、对四川蚕豆品种适应范围广，兼具有分泌IAA、溶无机磷和有机磷能力、抗逆性强的优良广谱蚕豆根瘤菌菌株；与四川的主栽蚕豆品种匹配亲和性好，在四川不同品种的蚕豆生产中，不施氮肥、接种Blgs20-1使蚕豆增产33％以上，与不接种对照的差异达显著水平。

附图说明

图1为蚕豆根瘤菌株系Blgs20-1在YMA培养基上的菌落形态；

图2为蚕豆根瘤菌株系Blgs20-1的16S rRNA基因序列的系统发育图；

图3为蚕豆根瘤菌株系Blgs20-1的glnII、atpD、recA三个持家基因联合构建的系统发育图。

具体实施方式

实施例1 根瘤菌的分离、纯化和保存

从四川省凉山州冕宁县红壤土上种植的蚕豆中，选择健壮植株主根上大且饱满红色的根瘤，将根瘤擦洗干净，带部分根皮采下，用纸吸干并将其放在装有无水氯化钙并覆有脱脂棉的小管中。在实验室将采集的根瘤用无菌水浸泡吸胀后，用95％的乙醇处理5min，接着用0.1％m/v的升汞表面灭菌5min，再用无菌水冲洗6次，在无菌操作的情况下，将单个根瘤夹破后在加有刚果红的YMA培养基(甘露醇10g，酵母粉0.8g，KH₂PO₄ 0.25g，MgSO₄.7H₂O0.2g，CaCl₂.6H₂O 0.1g，NaCl 0.1g，钼酸钠(1％)2ml，硼酸(1％)2ml，刚果红(1％)2.5ml，琼脂18～20g，水1000ml，pH6.8-7.0)上划线，在28℃的恒温箱中培养。

待长出菌落后，从平板上挑选不吸红、形态上像根瘤菌的菌落在平板上稀释划线培养。3d左右观察菌落形态，一直观察到15d左右，因慢生根瘤菌需7～15d 出现菌落。重复稀释划线反复分离，直到纯化为止。根据以下两方面进行初步判定是否为根瘤菌：(1)加刚果红的YMA培养基上的菌落形态：不吸红，菌落圆形、乳白色、隆起、边缘整齐不蔓延、表面光滑、较粘稠、较湿润。培养3-5d 就长出菌落的为快生根瘤菌，培养5-10长出菌落的为慢生根瘤菌。(2)细胞形态：对确认的根瘤菌菌落作标记，制片进行革兰氏染色，根瘤菌的镜检结果为细胞呈小杆状且形态一致，无芽孢，细胞内常含β-羟基丁酸而呈环节状，革兰氏阴性(G^-)。如果上述标记菌落具有上述两方面特征，则将该菌落接入YMA培养基的试管斜面培养保存。

本实施例分离纯化得到的菌株Blgs20-1为快生根瘤菌，在加刚果红的YMA 培养基上培养，菌体不吸红，菌落较小、圆形、乳白色、粘稠、隆起度较高、稍透明，3～4d长出菌落。经革兰氏染色镜检为G^-，呈小杆状。

实施例2 根瘤菌的回接及匹配性试验

根瘤菌的回接试验用的蚕豆品种是“大白蚕豆”，在光照室(控温22～24℃，光照强度2700～3000勒克斯，日照时间14hr)进行，种植46d收获。与“大白蚕豆”回接成功后再与其他的主栽蚕豆品种(“成胡14”，“成胡15”，“攀枝花蚕豆”) 进行匹配亲和性试验，也用水培法进行。在上述光照室培养41d收获。定期补充无菌无氮营养液。将快生蚕豆根瘤菌Blgs20-1与上述蚕豆品种形成不同组合，水培器采用250ml的细颈瓶(医院用的玻璃输液瓶)，以不接种所述蚕豆根瘤菌的同品种植株为对照。收获后用蚕豆植株的根瘤数及植株干重来评价蚕豆根瘤菌 Blgs20-1的接种效果。回接试验与匹配性试验的菌液培养、种子的催芽、水培器的制作及种植方法一致。

(1)菌液培养：将上述蚕豆根瘤菌Blgs20-1接种于YMA液体培养基中，放置摇床上用120rpm/min转速，28℃培养至对数生长期(约3～4d)。

(2)种子的催芽：选择粒大、饱满的无损伤的蚕豆种子，用95％酒精浸5min，倒去酒精，加入0.1％的升汞溶液表面灭菌5min，最后用无菌水清洗4～6次，每次5min，28℃催芽，待主根长到2～3cm左右，须根未长出时播种。

(3)水培器的制作：用250ml的细颈瓶(医院用的玻璃输液瓶)作水培器。先制作无氮营养液，将配制好的无氮水培营养液注入清洗后的瓶内，瓶口覆盖一层牛皮纸，在瓶口正中央开一小孔(直径约1cm)，小孔塞上棉花，外罩一层耐高温的塑料薄膜，在121℃温度下灭菌备用。

(4)种植及测定指标：将催芽种子置于无菌培养皿中用菌液浸泡15min，用无菌镊子将种苗的根插入水培器小孔内，每瓶1株，然后每棵种苗再加入菌液 1ml，种子周围用原来孔内的棉花塞好，防止尘埃落入瓶内造成污染。另设不接种处理的同品种植株为对照(CK)。种植时先种CK，各处理重复3次。水培试验结果列于表1。

表1结果表明，所述蚕豆根瘤菌Blgs20-1与4个供试蚕豆品种(四川主栽品种)的匹配亲和性均好，均表现出较好的结瘤能力和共生固氮能力；接种根瘤菌Blgs20-1的处理较不接种根瘤菌处理，植株干重提高了41.9％～72.5％。可见，所述蚕豆根瘤菌Blgs20-1是与四川蚕豆品种匹配性好的优良广谱菌株，而目前与四川主栽蚕豆品种高效匹配的根瘤菌还未见相关报道。

表1 蚕豆根瘤菌Blgs20-1的水培试验结果

注：数据为三次重复的平均值。

实施例3 所述根瘤菌Blgs20-1的抗逆能力

对所述的根瘤菌Blgs20-1的抗逆能力主要进行了耐酸碱、耐盐及生长温室范围测定。以YMA培养基为基础培养基，均以pH7、28℃培养7d的YMA平板为阳性对照。将上述的Blgs20-1的YMA斜面培养物用无菌水刮洗待用。采用点接种方法，3次重复，以YMA培养基为耐酸碱性测定的基础培养基，用HC1 和NaOH调节pH值，pH值依次为4.0、5.0、6.0、8.0、9.0、10.0、11.0。耐盐性测定同样以YMA培养基为基础培养基，将所述菌株点接种在含有NaC1的平板上，NaC1的质量体积分数为0.2％、0.4％、0.6％、1.0％、1.5％、2.5％、3.5％和4.5％。耐酸碱、耐盐试验的平板均在28℃培养7d后观察记载结果。

生长温度范围测定，将所述菌株接种于YMA培养基上，共设5个温度处理，分别在8℃、15℃、37℃、45℃生化培养箱中培养30d、10d、7d、7d，另一处理为60℃下热激处理30min后，转到28℃下培养7d。试验结果表明，所述根瘤菌 Blgs20-1抗逆能力较强，能在pH4～11的平板上生长，说明该菌株的抗酸碱性比较好；耐盐能力一般，能在0.6％NaCl的YMA平板上生长；生长温度范围较广，能在10～28℃温度范围内生长，并且该菌株在60℃热激处理30min后仍能存活，说明该菌株能忍受短时间的高温。

实施例4 所述的根瘤菌Blgs20-1的促生能力

所述的根瘤菌Blgs20-1的促生能力主要考察了分泌植物生长素(IAA)(比色法)、溶磷能力(溶磷圈法)。

(1)分泌植物生长素能力的测定

采用比色法测定根瘤菌分泌植物生长素(IAA)的能力(师尚礼等，2007)，测定培养基采用改良的刚果红液体培养基，培养基组成：0.5g K₂HPO₄.3H₂O、0.2g MgSO₄.7H₂O、0.1gNaCl、1g酵母膏、10g甘露醇、10ml 0.25％刚果红、1g NH₄NO₃、100mg L-色氨酸、1000ml蒸馏水、pH7.0。比色液配方：0.5M FeCl₃ 1ml、浓H₂SO₄ 30ml、蒸馏水50ml。

将菌株接种于盛有50ml培养基的三角瓶中，置于转速125rpm/min，温度28℃的摇床培养，3次重复，培养12d后，取根瘤菌悬浮液100μl置于白色塑料比色板上，加100μl的比色液，15min后观察颜色变化。粉红色为阳性，表示菌株能够分泌IAA，粉红色颜色越深表示分泌IAA能力越大；无色为阴性，表示菌株不能分泌IAA。在比色液中分别加入等量的10mg/L(CK1)、30mg/L (CK2)、50mg/L(CK3)IAA作阳性对照进行粉红色颜色深度的比较(席林乔等，2005；师尚礼等，2007)。结果表明，所述根瘤菌Blgs20-1的比色反应为浅粉色，说明所述根瘤菌Blgs20-1分泌IAA的量低于10mg/L。

(2)溶有机磷和无机磷的能力

用溶磷圈法。有机磷源为卵磷脂，无机磷源为磷酸钙(Ca₃(PO₄)₂)、磷酸铝(AlPO₄.2H₂O)、磷酸铁(FePO₄.2H₂O)，均为市售分析纯试剂。

测定溶解有机磷能力的培养基用蒙金娜培养基，配方(g/L)：10g葡萄糖， 0.5g(NH₄)₂SO₄，0.3g NaCl，0.3g KCl，0.03g FeSO₄.7H₂O，0.03g MnSO₄.4H₂O， 0.2g卵磷脂，5gCaCO₃，0.4g酵母粉，20g琼脂，1000ml蒸馏水，pH值6.8～7.0。其中卵磷脂用75％酒精加热溶解，单独灭菌，与灭菌冷却至60℃左右的培养基混合后倒平板。

测定溶解无机磷能力的培养基用PKO培养基，配方(g/L)：10g葡萄糖， 3.0g上述无机磷源物质，0.5g(NH₄)₂SO₄，0.2g NaCl，0.2g KCl，0.03g MgSO₄.7H₂O， 0.03g MnSO₄，0.003g FeSO_4.7H₂O，0.5g酵母粉，20g琼脂，1000ml蒸馏水，pH 值6.8～7.0。其中磷酸钙、磷酸铝、磷酸铁用研钵碾碎过300目筛并单独干热灭菌后，与灭菌温度降至60℃左右的培养基混合倒平板，待用。菌种制备及点接种方法同实施例3抗逆性试验，重复3次。28℃培养箱培养7d后观察菌株是否生长及是否有溶磷圈出现。结果表明所述快生根瘤菌Blgs20-1对磷酸钙、磷酸铝和有机磷源物质均具有一定的溶解能力，无溶解磷酸铁能力。

由此可见，菌株Blgs20-1不仅高效固氮，还具有溶解磷酸钙、磷酸铝及有机磷卵磷脂的能力，以及分沁植物生长素(IAA)等促生作用，同时该菌株生长温度范围较广、耐酸耐碱能力强。

实施例5 所述根瘤菌Blgs20-1的16S rRNA基因及其他持家基因glnII、atpD、recA的扩增及系统发育分析

提取菌株总DNA，用表2所示引物分别对上述4个基因进行PCR扩增，PCR 反应用Bio-RAD MyCycler^TM仪器，PCR扩增产物在1.0％的琼脂糖凝胶电泳上检测后，送到英俊公司进行序列的测定，用软件DNAman 6.0进行基因序列相似度的计算。

表2 本试验中所用PCR引物

注：Y＝C or T,H＝A,C or T,R＝A or G,S＝C or G,K＝G or T,N＝A,C,G or T,I＝inosine,

M＝A or C,N＝any base..

(1)16S rRNA基因的扩增及系统发育树的构建

以总DNA为模板，用表2通用引物P1和P6扩增16S rRNA基因。PCR反应体系(50μl)：2×PCR Mix 25μl，引物P1和P6(10μM)各1μl，DNA模板1μl，加超纯水补足至50μl。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性1min，56℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；72℃最终延伸10min。扩增产物按上述方法检测后英俊公司测序的结果如SEQID No1。

SEQID No1 16S rRNA基因序列：

CTGACGTAGCTTACCATGCAAGTCGAGCGCCCCGCAAGGGGAGCGGCAGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAATCTACCCTTGACTACGGAATAACGCAGGGAAACTTGTGCTAATACCGTATGTGTCCTTCGGGAGAAAGATTTATCGGTCAAGGATGAGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCACCGGAGAAGATAATGACGGTATCCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGATCGATCAGTCAGGGGTGAAATCCCAGGGCTCAACCCTGGAACTGCCTTTGATACTGTCGATCTGGAGTATGGAAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGTCCATTACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGTTAGCCGTCGGGCAGTATACTGTTCGGTGGCGCAGCTAACGCATTAAACATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCCCTTGACATGCCCGGCTACTTGCAGAGATGCAAGGTTCCCTTCGGGGACCGGGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGGGACTGCCGGTGATAAGCCGAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGGTGACAGTGGGCAGCGAGCACGCGAGTGTGAGCTAATCTCCAAAAGCCATCTCAGTTCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGTTTTACCCGAAGGTAGTGCGCTAACCGCAAGGAGGCAGCTAACCACGGT AGTCGCGTCAT*

将所得的序列结果在EzTaxon(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon)进行比对，发现根瘤菌Blgs20-1的16S rRNA基因序列单独分为一支，与之相似度最近的为Rhizobiumlaguerreae FB 206^T、Rhizobium anhuiense CCBAU 23252^T、Rhizobiumsophorae CCBAU 03386^T，相似度为99.9％。应用序列在NCBI上比对的结果，选择相似性高的模式菌株作为参比菌株，构建系统发育树。用Mega5软件中的邻接法(Neighbor-joining)进行16S rRNA基因系统发育树的构建，自展值 (bootstrap)1000，其系统发育树见图2。

(2)多位点基因序列的联合系统发育树的构建

为进一步更准确地确定所述快生根瘤菌Blgs20-1的分类地位，另选择3个位点的持家基因atpD、recA和glnII序列进行联合系统发育树的构建。

扩增recA用引物recAF2、recAR2，atpD用引物atpDF1和atpDR，glnII用引物GSII-5和GSII-6，引物序列如表2所示。反应体系为50μl，反应液组成如下：反应体系(50μl)为：2×PCR Mix 25μl；10mM的正向引物和反向引物各0.5μl； DNA模板1μl；ddH₂O 23μl。

(1)recAPCR扩增条件：95℃预变性5min；94℃变性45s，59℃退火45s， 74℃延伸1.5min，循环30次；74℃最终延伸6min。

(2)atpD的PCR扩增条件：95℃预变性5min；94℃变性45s，57.5℃退火45s，74℃延伸1.5min，循环30次；74℃最终延伸6min。

(3)glnII扩增条件：92℃预变性3min；94℃变性1min，56℃退火1.5min， 72℃延伸2min，循环30次；72℃最终延伸10min。

扩增产物按上述方法检测后送英俊公司测序，对每个基因进行两向测序(正、反引物的序列)，然后将正、反引物序列用DNAman 6.0软件拼接，去掉正、反引物的序列后分别获得atpD、glnII、recA序列大小为496nt、637nt、483nt，序列结果分别如SEQID No2、SEQIDNo3、SEQID No4。

SEQID No2 atpD基因序列：

CATCGGTGAGCCGGTCGACGAAGCCGGTCCGCTGGTCACCGCTCACAAGCGTGCCATCCACCAGGATGCACCATCCTATGTCGAGCAGTCGACGGAATCGCAGATTCTGGTCACCGGCATCAAGGTCGTCGATCTTCTGGCTCCCTATGCACGCGGCGGCAAGATCGGCCTCTTCGGCGGCGCCGGCGTCGGCAAGACCGTTTTGATCATGGAACTGATCAACAACGTCGCCAAGGCGCATGGTGGTTACTCGGTTTTCGCAGGCGTCGGTGAACGTACCCGTGAAGGTAACGACCTCTACCACGAAATGATCGAATCGAACGTCAACAAGCATGGCGGCGGCGAAGGCTCGAAGGCTGCGCTGGTTTACGGTCAGATGAACGAACCGCCGGGCGCCCGCGCCCGCGTCGCCCTGACCGGCCTGACGGTCGCCGAGCACTTCCGCGATCAGGGCCAGGACGTTCTGTTCTTCGTCGATAACATCTTCCGCTTCACG

SEQID No3 glnII基因序列：

CGATGGGTACACTCCGGTACCGAACCTGCGTGGCAAGACGCAGATCAAGGAATTCGACGTATTCCCGACGCTGGAACAGCTTCCGCTCTGGGGCTTTGACGGATCCTCGACGCAGCAGGCTGAAGGCCGCAGCTCCGATTGCGTGCTGAAGCCGGTCGCCATCTATCCCGACCCGGCCCGTACCAACGGCGCTCTCGTCATGTGCGAAGTCATGATGCCGGATGGCGTCACGCCGCACGCATCGAATGCCCGCGCCACCATCCTCGACGACGAAGATGCATGGTTCGGCTTCGAGCAGGAATATTTCTTTTACCAGAACGGCCGTCCGCTCGGCTTCCCTGAGCAGGGCTACCCCGCTCCGCAGGGCCCGTACTACACCGGCGTCGGCTATTCGAACGTCGGCGACGTTGCCCGCGAAATCGTCGAAGAGCATCTCGACCTCTGCCTCGCTGCCGGCATCAATCACGAAGGCATCAATGCCGAAGTGGCCAAGGGCCAGTGGGAATTCCAGATTTTCGGCAAGGGCTCCAAGAAGGCCGCCGACCAGATCTGGATGGCACGCTACCTCCTGCAGCGCCTGACCGAAAAGTACGGCATCGACATCGAGTATCACTGCAAGCCGCTCGGCGA CACCGAC

SEQID No4 recA基因序列：

CACTGACTCGGCTCACGAGATGTTGTCGAGATCGAGACGATCTCGACCGGCTCGCTTGGTCTCGATATTGCACTCGGCGTTGGTGGCCTGCCGAGGGGCCGCATCATCGAAATCTACGGGCCGGAAAGCTCCGGTAAGACGACGCTTGCACTGCAGACGATTGCCGAAGCGCAGAAGAAGGGCGGCATCTGCGCCTTCGTCGATGCCGAACATGCGCTCGATCCCGTCTATGCCCGCAAGCTTGGCGTCGACCTGCAGAACCTTCTGATCTCGCAGCCCGATACCGGCGAGCAGGCGCTTGAAATCACCGATACGCTGGTGCGCTCCGGCGCCGTCGACGTTCTCGTCGTCGACTCGGTTGCGGCATTGACGCCCCGCGCCGAAATCGAAGGCGAAATGGGCGACAGCCTTCCCGGCCTGCAGGCACGATTGATGAGCCAGGCGCTGCGCAAGCTCACCGCTTCGATCTCGAAGTCGAACACT

将所得的序列结果在美国国立生物信息中心(NCBI)进行比对，选择与根瘤菌Blgs20-1的atpD、recA和glnII三个位点持家基因的序列相似度高的种的模式菌株作为建树的参比菌株。

3个基因(atpD、glnII和recA)联合系统发育树的构建：先将atpD、glnII、 recA 3个持家基因的序列分别与参比菌株的相应基因序列，用MEGA5比对，以最小长度为标准剪齐，将剪齐后的序列保存为FASTA格式，剪齐后三个基因序列长度分别为350nt、460nt、341nt。以记事本格式打开将3个序列拼接在一起，用MEGA5软件中的邻接法(Neighbor-joining)进行联合系统发育树的构建，自展值(bootstrap)1000，atpD、glnII、recA联合系统发育树如图3所示。

将快生根瘤菌Blgs20-1的三个基因序列分别与其相应参比菌株用 DNAman6.0软件进行相似的计算，发现Blgs20-1的atpD、recA和glnII三个相似最高的模式种分别为Rhizobium laguerreae FB 206^T、Rhizobium sophorae CCBAU 03386^T、Rhizobiumsophorae CCBAU 03386^T：相似度分别为96.3％、97.8％、 97.1％，三个位点持家基因序列相似度不是很高，且四个基因(包括16S rDNA) 相似度最高的模式种还不一致，Blgs20-1的16S rRNA基因序列的聚类图(图2)，以及atpD、glnII、recA 3个持家基因联合序列的聚类图(图3)显示，Blgs20-1 单独分为一支，但尤其是持家基因联合序列聚类图相距较远，与之相似度最高的模式菌株为Rhizobium sophorae CCBAU 03386^T，相似度为96.9％，国际上一般将97％相似性作为定种的标准。综上，菌株Blgs20-1可能是快生根瘤菌属(Rhizobium)的一个潜在新种菌株。

实施例6田间接种效果

所述菌株的田间接种效果试验选择在成都平原地区崇州市进行。

本试验共设两个处理，接种根瘤菌Blgs20-1和不接种对照处理(CK)，豆种选择四川主栽品种成胡15，未施用任何化学肥料和有机肥，采用田间随机区组排列，试验于2016年10月～2017年4月进行。将制备好的根瘤菌菌剂(活菌数5.2×10⁸CFU/g菌剂)与蚕豆拌种，阴干后穴播，每窝3粒，定苗2株，小区面积10.8m²，窝距30cm，行距50cm，播种时先播CK，以避免CK处理受接种根瘤菌的影响。在植株盛花期(生育期105d)采样，测定植株株高、根瘤数、地上部分植株干重；收获期(生育期200d)测定产量。期间的管理按农户种植蚕豆的常规管理执行。

表3 田间接种效果

目前有关蚕豆根瘤菌的田间应用效果，只有不同根瘤菌菌剂对蚕豆/禾本科间作体系的固氮效果及产量影响的相关研究，结果表明接种根瘤菌以后蚕豆产量较不接种根瘤菌处理仅增产了13.7％(房增国，2009)，目前还未见蚕豆根瘤菌对蚕豆单作体系的固氮效果及产量影响的相关报道。本课题研究中，通过接种根瘤菌处理后，在盛花期株高、植株干重、根瘤数均比不接种的高，产量比CK显著增加，增产33.0％，可见，接种的优良根瘤菌对植株盛花期后生长的作用更明显，所以根瘤菌Blgs20-1是适合本生态区的优良根瘤菌。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种蚕豆根瘤菌株系Blgs20-1及其应用

<141> 2017-12-26

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1383

<212> DNA

<213> 根瘤菌(rhizobium xin)

<400> 1

ctgacgtagc ttaccatgca agtcgagcgc cccgcaaggg gagcggcaga cgggtgagta 60

acgcgtggga atctaccctt gactacggaa taacgcaggg aaacttgtgc taataccgta 120

tgtgtccttc gggagaaaga tttatcggtc aaggatgagc ccgcgttgga ttagctagtt 180

ggtggggtaa aggcctacca aggcgacgat ccatagctgg tctgagagga tgatcagcca 240

cattgggact gagacacggc ccaaactcct acgggaggca gcagtgggga atattggaca 300

atgggcgcaa gcctgatcca gccatgccgc gtgagtgatg aaggccctag ggttgtaaag 360

ctctttcacc ggagaagata atgacggtat ccggagaaga agccccggct aacttcgtgc 420

cagcagccgc ggtaatacga agggggctag cgttgttcgg aattactggg cgtaaagcgc 480

acgtaggcgg atcgatcagt caggggtgaa atcccagggc tcaaccctgg aactgccttt 540

gatactgtcg atctggagta tggaagaggt gagtggaatt ccgagtgtag aggtgaaatt 600

cgtagatatt cggaggaaca ccagtggcga aggcggctca ctggtccatt actgacgctg 660

aggtgcgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg 720

atgaatgtta gccgtcgggc agtatactgt tcggtggcgc agctaacgca ttaaacattc 780

cgcctgggga gtacggtcgc aagattaaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag 840

cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgcagaac cttaccagcc cttgacatgc 900

ccggctactt gcagagatgc aaggttccct tcggggaccg ggacacaggt gctgcatggc 960

tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aaccctcgcc 1020

cttagttgcc agcatttagt tgggcactct aaggggactg ccggtgataa gccgagagga 1080

aggtggggat gacgtcaagt cctcatggcc cttacgggct gggctacaca cgtgctacaa 1140

tggtggtgac agtgggcagc gagcacgcga gtgtgagcta atctccaaaa gccatctcag 1200

ttcggattgc actctgcaac tcgagtgcat gaagttggaa tcgctagtaa tcgcggatca 1260

gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt 1320

tggttttacc cgaaggtagt gcgctaaccg caaggaggca gctaaccacg gtagtcgcgt 1380

cat 1383

<210> 2

<211> 496

<212> DNA

<213> 持家基因(atpd)

<400> 2

catcggtgag ccggtcgacg aagccggtcc gctggtcacc gctcacaagc gtgccatcca 60

ccaggatgca ccatcctatg tcgagcagtc gacggaatcg cagattctgg tcaccggcat 120

caaggtcgtc gatcttctgg ctccctatgc acgcggcggc aagatcggcc tcttcggcgg 180

cgccggcgtc ggcaagaccg ttttgatcat ggaactgatc aacaacgtcg ccaaggcgca 240

tggtggttac tcggttttcg caggcgtcgg tgaacgtacc cgtgaaggta acgacctcta 300

ccacgaaatg atcgaatcga acgtcaacaa gcatggcggc ggcgaaggct cgaaggctgc 360

gctggtttac ggtcagatga acgaaccgcc gggcgcccgc gcccgcgtcg ccctgaccgg 420

cctgacggtc gccgagcact tccgcgatca gggccaggac gttctgttct tcgtcgataa 480

catcttccgc ttcacg 496

<210> 3

<211> 637

<212> DNA

<213> 持家基因(glnii)

<400> 3

cgatgggtac actccggtac cgaacctgcg tggcaagacg cagatcaagg aattcgacgt 60

attcccgacg ctggaacagc ttccgctctg gggctttgac ggatcctcga cgcagcaggc 120

tgaaggccgc agctccgatt gcgtgctgaa gccggtcgcc atctatcccg acccggcccg 180

taccaacggc gctctcgtca tgtgcgaagt catgatgccg gatggcgtca cgccgcacgc 240

atcgaatgcc cgcgccacca tcctcgacga cgaagatgca tggttcggct tcgagcagga 300

atatttcttt taccagaacg gccgtccgct cggcttccct gagcagggct accccgctcc 360

gcagggcccg tactacaccg gcgtcggcta ttcgaacgtc ggcgacgttg cccgcgaaat 420

cgtcgaagag catctcgacc tctgcctcgc tgccggcatc aatcacgaag gcatcaatgc 480

cgaagtggcc aagggccagt gggaattcca gattttcggc aagggctcca agaaggccgc 540

cgaccagatc tggatggcac gctacctcct gcagcgcctg accgaaaagt acggcatcga 600

catcgagtat cactgcaagc cgctcggcga caccgac 637

<210> 4

<211> 483

<212> DNA

<213> 持家基因(reca)

<400> 4

cactgactcg gctcacgaga tgttgtcgag atcgagacga tctcgaccgg ctcgcttggt 60

ctcgatattg cactcggcgt tggtggcctg ccgaggggcc gcatcatcga aatctacggg 120

ccggaaagct ccggtaagac gacgcttgca ctgcagacga ttgccgaagc gcagaagaag 180

ggcggcatct gcgccttcgt cgatgccgaa catgcgctcg atcccgtcta tgcccgcaag 240

cttggcgtcg acctgcagaa ccttctgatc tcgcagcccg ataccggcga gcaggcgctt 300

gaaatcaccg atacgctggt gcgctccggc gccgtcgacg ttctcgtcgt cgactcggtt 360

gcggcattga cgccccgcgc cgaaatcgaa ggcgaaatgg gcgacagcct tcccggcctg 420

caggcacgat tgatgagcca ggcgctgcgc aagctcaccg cttcgatctc gaagtcgaac 480

act 483

Claims (3)

1.一种蚕豆根瘤菌株系Blgs20-1，其特征在于：于2017年10月23日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2017615。

2.根据权利要求1所述的蚕豆根瘤菌株系Blgs20-1的应用，其特征在于：该蚕豆根瘤菌株系应用于四川蚕豆主产区成都平原地区蚕豆的生产。

3.根据权利要求2所述的蚕豆根瘤菌株系Blgs20-1的应用，其特征在于：将含活菌数5.2×10⁸CFU/g的蚕豆根瘤菌菌剂Blgs20-1与蚕豆拌种，阴干后穴播。