CN106987541A

CN106987541A - 一株具有抗逆、促生性能的高效苜蓿根瘤菌及其应用

Info

Publication number: CN106987541A
Application number: CN201710303203.1A
Authority: CN
Inventors: 罗明; 马霞; 韩剑; 何媛; 郭海玉; 皇甫彩娟; 李卫军
Original assignee: Xinjiang Agricultural University
Current assignee: Xinjiang Agricultural University
Priority date: 2017-05-03
Filing date: 2017-05-03
Publication date: 2017-07-28
Anticipated expiration: 2037-05-03
Also published as: CN106987541B

Abstract

本发明公开了一株具有抗逆、促生性能的高效苜蓿根瘤菌及其应用。该菌株为苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）XGL026，是从新鲜的紫花苜蓿根瘤中分离纯化获得，已于2013年1月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.7179。本发明的高效固氮苜蓿根瘤菌株XGL026抗逆性强、具有溶解无机磷和有机磷性能、兼具有分泌IAA能力，与新疆主栽苜蓿品种匹配亲和性好、竞争结瘤能力强、固氮效率高的优良苜蓿根瘤菌株。在新疆紫花苜蓿生产区应用，具有适用性强、高效结瘤，提高苜蓿产草量，改善品质，并且增强苜蓿植株生长的整体性能，与不接种的对照差异达显著水平。

Description

一株具有抗逆、促生性能的高效苜蓿根瘤菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种生物菌种资源，具体的说，本发明涉及一种能够与苜蓿共生固氮且具有优良抗逆、促生性能及田间竞争结瘤能力突出的根瘤菌株。

背景技术

根瘤菌是一类革兰氏阴性杆状细菌，在合适条件下能侵染豆科植物并与之进行共生结瘤固氮，将空气中游离态的氮气转化成植物可以利用的化合态氮。根瘤菌-豆科植物共生是自然界最重要的生物固氮体系，固氮量约占生物固氮总量的65%~70%。苜蓿（Medicago sativa L.）是世界种植面积最大的饲草作物，被誉为“牧草之王”。其根系强大、适应性强、产草量高、营养品质好，既是优质的高蛋白饲料，又可固氮改良土壤，培肥地力，在人工草地建设，保障奶业及草地畜牧业健康发展和退耕还草、生态环境治理中都发挥着重要作用。研究和生产实践证明，利用优良的根瘤菌菌株接种，可以促进苜蓿结瘤、增加固氮量、增加苜蓿产草量和蛋白质含量，是提高苜蓿产量、改善品质，增加土壤肥力的重要举措。

应用根瘤菌接种的固氮效率受根瘤菌基因组、宿主基因组和土壤环境因子等多方面因素的影响，制约固氮作用的充分发挥。根瘤菌分布具有明显的生物地理学特性，不同菌株具一定的结瘤基因谱系对生态条件适应性各不相同。从外地引进或国外进口的菌剂，对地域环境“水土不服”，和当地主栽品种（系）的亲和匹配性不强，与土壤中大量存在的土著根瘤菌相比竞争力弱，是导致接种效果不理想的重要原因。土壤环境因素也是豆科植物—根瘤菌共生固氮作用充分发挥的重要限制因子。土壤水分、酸碱度、温度、有机质的C/N比和化合态氮含量均能不同程度地影响接种根瘤菌的结瘤和共生固氮效率。在我国，苜蓿主要栽培区域多集中在西北干旱、半干旱地区。新疆苜蓿栽培种植面积已达30.1万 hm²，预计将递增至50万 hm²，新疆干旱、高温、土壤盐碱化普遍、有机质含量低、温差变化剧烈为其生态条件的显著特征，严重制约了接种根瘤菌的结瘤及共生固氮效率。因此，分离、筛选出与苜蓿品种匹配性好、固氮效率高，同时具有抵抗环境能力和促性能、竞争结瘤能力强的苜蓿根瘤菌株，为研制适应新疆干旱、半干旱地区环境特点的高效根瘤菌剂提供菌种资源，对于充分发挥根瘤菌的固氮效率及苜蓿的高效生产具有重要意义。

发明内容

本发明目的是为了解决接种根瘤菌与苜蓿品种的亲和力不强、竞争结瘤能力不佳和固氮效率不高的问题，而提供一株在干旱及半干旱环境条件下具有较强的抗逆、促生及竞争结瘤能力、固氮效率高的优良根瘤菌菌株。

本发明所提供的一株根瘤菌，它为苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）XGL026。该菌株已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。保藏日期是2013年1月21日，保藏编号为CGMCC NO.7179。

本发明所述的苜蓿中华根瘤菌XGL026应用于新疆紫花苜蓿生产。

具体的，本发明从新疆南、北疆12个市（县、团场）的紫花苜蓿根瘤中分离并筛选出一株根瘤菌XGL026。该菌株生物学特性如下：生长最适温度为28 ℃，好氧性培养物。在YMA平板培养基上，形成圆形或近似圆形、粘稠、光滑、突起、灰白色或乳白色菌落。光学显微镜下为短杆状，呈环节状，大多数运动，鞭毛周生，无芽孢，革兰氏染色阴性。对本发明所分离菌株的16S rDNA基因序列进行测序，利用GenBank数据库中的BLAST程序对测序结果进行相似性检索，并通过DNAStar、MEGA 4.1软件进行多重序列比对及系统发育树的构建，结果发现本发明提供的根瘤菌菌株的16S rDNA基因序列与苜蓿中华根瘤菌属（Sinorhizobium meliloti）的模式菌株具有较高的相似性，其中与Sinorhizobium meliloti EAS1-2（登录号：JF496434）的同源性最高，相似性达99.6%，从而确定分离出的根瘤菌XGL026为苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）。

进一步，通过对根瘤菌菌株XGL026进行人工模拟各种胁迫环境（耐盐、耐酸碱、耐NH₄ ⁺、耐干旱及耐高低温处理）、促生性能（溶磷、分泌生长素）及田间竞争结瘤能力的测定，发现分离菌株XGL026是一株具有优良抗逆、促生及竞争结瘤能力的根瘤菌。具有以下有益效果。

1.本发明的根瘤菌菌株XGL026具有较强的抗逆能力，对盐碱、高温、酸碱、干旱等不利环境因子表现出很强的耐受性。能够耐受10% NaCl或20% Na₂SO₄盐离子浓度；在pH3~12，-0.3~-1.5 mPa渗透势，0~10 mmol/L的NH₄ ⁺浓度范围，4~40 ℃生长温度范围内均可生长。

2.本发明的根瘤菌菌株XGL026具有较强的促生能力，具有较强溶解无机磷和有机磷的能力，并兼具有分泌生长素(IAA)的能力。

3.本发明的根瘤菌菌株XGL026具有高效的田间竞争结瘤能力，接种根瘤菌菌株XGL026的田间占瘤率显著高于外来根瘤菌株和土著根瘤菌。

4.本发明的根瘤菌菌株XGL026在田间接种，较不接种对照，3茬苜蓿平均结瘤数增加54.5%，固氮量增加113.52 kg/hm²，干草产量增加28.7%，苜蓿品质明显改善，粗蛋白含量加1.53%，酸性洗涤纤维（ADF）和中性洗涤纤维（NDF）分别降低4.67%和3.41%。

附图说明

图1所示为苜蓿中华根瘤菌XGL026在YMA培养基上的菌落形态。

图2所示为苜蓿中华根瘤菌XGL026经革兰氏染色后在光学显微镜下的菌体形态图。

图3所示为苜蓿中华根瘤菌XGL026的16S rDNA系统发育树图。

图4所示为琼脂管法回接苜蓿中华根瘤菌XGL026的根系照片。

图5所示为琼脂管法未接菌的对照根系照片。

图6所示为苜蓿中华根瘤菌XGL026在有机磷固体培养基平板上产生的溶磷圈。

图7所示为苜蓿中华根瘤菌XGL026在无机磷固体培养基平板上产生的溶磷圈。

图8所示为BOX-PCR电泳图谱。图中M指100 bp DNA Ladder，泳道1为根瘤菌ACCC17544总DNA，泳道2～10为接种根瘤菌ACCC17544的苜蓿根瘤总DNA，泳道12为根瘤菌XGL026总DNA，泳道13～21为接种根瘤菌XGL026的苜蓿根瘤总DNA，泳道11和泳道22为未接根瘤菌的苜蓿根瘤总DNA。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

本领域技术人员应理解，这些实施例仅用于说明本发明而绝不对本发明的范围构成任何限制。除另有说明外，本申请中的所有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。

本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

本发明供试苜蓿品种为：新牧1号紫花苜蓿（Medicago sativa Xinmu No.1），由新疆农业大学草业与环境科学学院提供。

本发明供试参比根瘤菌菌株：苜蓿中华根瘤菌ACCC17544，由中国农业微生物菌种保藏管理中心提供，分离自新疆紫花苜蓿。

实施例1菌株的分离、纯化与鉴定

1. 菌株的分离及纯化

分别从新疆南、北疆12个（县、团场）紫花苜蓿人工草地采集新鲜根瘤。选择生长健壮的植株主、侧根上个大、饱满的红色根瘤，将根瘤用无菌水冲洗后，75%的乙醇浸泡5 min，再用0.1%的升汞（HgCl₂）消毒5 min后，用无菌水冲洗，取最后一次无菌水清洗液涂布YMA平板培养72 h进行无菌检验。用无菌镊子压破单个根瘤，用接种环挑取菌悬液在YMA平板培养基上划线，28 ℃恒温条件下培养2~4 d，多次纯化菌株，挑取单菌落转接斜面，4 ℃低温保存，并将获得的一株菌株命名为XGL026。

YMA固体培养基（酵母汁甘露糖琼脂培养基）的组成为（g/L）：10 g 甘露醇，0.1 gNaC1，0.2 g MgSO₄·7H₂O，1.0 g 酵母粉，0.5 g K₂HPO₄，16 g琼脂粉，1000 mL蒸馏水，pH值7.0-7.2。

2. 菌株的鉴定

（1）菌株的形态和培养特征观察

将菌株XGL026接种在YMA固体培养基上进行培养，并观察记录。培养48 h后，菌落为圆形，灰白色或乳白色、粘稠、光滑、突起(见图1)。随着培养时间增长，菌落不断扩展突起，边缘整齐，菌落表面光滑，生长在其上的细胞物质易在液体中分散。光学显微镜下菌体为短杆状、细胞内染色不均呈环节状，大多数运动，鞭毛周生，无芽孢，菌体单个或成对，革兰氏染色呈粉红色，为革兰氏阴性菌(见图2)。

（2）生理生化鉴定

参照《常用细菌系统鉴定手册》，对菌株进行生理生化鉴定，鉴定结果（见表1）所示。

表1 菌株XGL026生理生化鉴定项目及结果

注:“+”表示阳性结果;“-”表示阴性结果。

（3）菌株16S rDNA基因的序列测定及分析

提取菌体总DNA。利用通用引物对P1（5′-CGGGATCCAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3′）和P6（5′-CGGGATCCTACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′）扩增16S rDNA序列。PCR反应体系(50 µL): 10×PCR Buffer 5.0 µL，2.5 mmol/L的MgCl₂ 3.0 µL，10 µmol/L的引物P1/P6各1.0 µL，2.5 mmol/L的dNTP 8.0 µL，5 U/µL的TaqDNA聚合酶0.5 µL，模板2.5 µL，灭菌ddH₂O 29 µL。反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，扩增32个循环；72℃补偿延伸6 min。扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测后，由上海生工生物工程股份有限公司对PCR产物进行克隆测序，测序结果见SEQ ID No:1。

将所得的序列结果在美国国立生物信息中心（NCBI）进行BLAST检索，选择相似性高的模式菌株作为参比菌株，利用MEGA4.1软件中的邻接法（Neighbor-joining）进行16SrDNA 基因系统发育树的构建，自展值（Bootstrap）1000。由比对结果和系统发育树（见图3）可知，根瘤菌XGL026 16S rDNA基因序列与模式菌株中华根瘤菌Sinorhizobium meliloti EAS1-2（JF496434）相似性最高，为99.6%，并与苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）位于同一进化分支。

基于以上生物学特征，将菌株XGL026鉴定为苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）。该菌株已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。保藏日期是2013年1月21日，保藏编号为CGMCC NO.7179。

实施例2苜蓿中华根瘤菌XGL026的回接试验及匹配性试验

苜蓿中华根瘤菌XGL026的回接试验采用琼脂管法：选择粒大、饱满的无损伤的新牧1号紫花苜蓿种子，用95%乙醇浸泡5 min，倒去乙醇，再加入质量体积分数为0.1%的升汞溶液表面消毒5 min，最后用无菌水清洗4~6 次，每次5 min。消毒后的种子置于琼脂平板上，28 ℃催芽2 d，将生长一致的催芽种子定置于1%琼脂无氮培养液试管斜面上，出现第一片真叶时接菌（每管接菌液1 mL），重复4管，另设空白不接菌对照，在光照培养箱中培养，出苗后10~30 d，观察、记载结瘤结果。回接试验结果（见图4，图5）显示，菌株XGL026表现出良好的结瘤能力，平均结瘤数达到5.5 个/株，且结瘤植株生长良好，叶片为绿色，幼苗生物量干重较对照提高18.5%；而未接种的对照植株，矮小且叶片发黄。同样方法测定XGL026与新疆主栽苜蓿品种新牧2号紫花苜蓿、和田大叶苜蓿的匹配性，均表现出较好的结瘤能力，接菌植株生物量干重较对照提高14.5%~16.7%，表明所述XGL026菌株与3个供试的苜蓿品种匹配亲和性良好。

实施例3苜蓿中华根瘤菌XGL026的抗逆能力测定

对苜蓿中华根瘤菌XGL026的抗逆能力主要进行了耐盐、耐酸碱、耐NH₄ ⁺能力、耐干旱及生长温度范围测定。以YMA培养基为基础培养基，均以pH7.0，28 ℃培养的YMA液体培养基或固体培养基平板作为阳性对照，每个处理重复3次。耐盐、耐酸碱、耐NH₄ ⁺、耐干旱能力的测定均是将菌株在YMA培养基平板上活化后，接种于YMA液体培养基中，28 ℃，160 rpm/min培养2 d（OD₆₀₀值0.800）作为接种液，以2%的接种量接种于各处理的培养液中，28 ℃，160 rpm/min震荡培养4 d，UV-2000型分光光度计在600 nm波长处测定各处理菌悬液的光密度值，作为菌株生长量指标。生长温度范围测定采用点接种方法。

耐盐性测定：分别配制含NaCl、Na₂SO₄的YMA培养液，其中NaCl的质量体积分数为6%、7%、8%、9%、10%；Na₂SO₄的质量体积分数为2%、6%、8%、9%、10%、12%。

耐酸、碱能力测定：用NaOH或HCl调节YMA培养液初始pH值，pH值依次为3.0、5.0、7.0、9.0、10.0、12.0。

耐NH₄ ⁺能力测定：采用的铵盐为(NH₄)₂SO₄，培养液中NH₄ ⁺浓度依次为0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、2.0 mmol/L、4.0 mmol/L、6.0 mmol/L、8.0 mmol/L、10.0 mmol/L。

耐干旱性测定：用聚乙二醇6000（Polyethylene Glycol 6000，PEG6000）人工模拟干旱条件，在基础培养基中加入不同量的PEG6000，使培养液的渗透势Ψ分别为0、-0.3mPa、-0.6 mPa、-0.9 mPa、-1.2 mPa、-1.5 mPa共6个水平。

生长温度范围测定：将所述菌株接种于YMA平板培养基上，共设8个温度处理，分别在4 ℃、10 ℃、15 ℃、25 ℃、28 ℃、35 ℃、40 ℃恒温培养箱中培养14 d、14 d、7 d、7 d、7d、7 d、7 d后观察并记录菌落生长情况。另一处理为60 ℃下热激处理10 min后，再置于28℃下培养7 d后观察并记录菌落生长情况。

试验结果表明中华根瘤菌XGL026抗逆能力较强。具有较强的耐盐能力，能够在含10% NaCl或20% Na₂SO₄的培养液中生长。能在pH3~12的培养液中生长，说明菌株XGL026具有较强的耐酸碱能力，耐碱能力优于耐酸能力。在NH₄ ⁺浓度小于2 mmol/L时，菌株XGL026生随NH₄ ⁺浓度增加而增长；NH₄ ⁺浓度超过2 mmol/L时，对菌株的生长有产生抑制作用。菌株XGL026能在渗透式-0.3~-1.5 mPa范围内生长，在渗透式-0.3 mPa处理下生长情况优于对照，说明该菌株有较好的耐干旱能力；菌株XGL026的生长温度范围较广，在4~40 ℃温度范围内均能生长，并且该菌株在60 ℃热激处理10 min后仍能存活，说明该菌株能耐受短时间的高温。

实施例4：苜蓿中华根瘤菌XGL026的促生能力

苜蓿中华根瘤菌XGL026的促生能力主要考察其溶磷能力和分泌生长素能力。

1. 溶解有机磷和无机磷的能力

采用用溶磷圈法。有机磷源为卵磷脂，无机磷源为磷酸钙（Ca₃(PO₄)₂）均为市售分析纯试剂。

测定溶解有机磷能力的培养基用蒙金娜有机磷培养基，配方（g/L）：0.3 g NaCl，0.5 g (NH₄)₂SO₄，0.3 g KCl，0.03 g MnSO₄·4H₂O，0.03 g FeSO₄·7H₂O，5.0 g CaCO₃，10.0g葡萄糖，0.2 g卵磷脂，0.4 g酵母膏，16.0 g琼脂，1000 mL蒸馏水，pH值7.0，其中卵磷脂用75%的酒精加热溶解后，单独灭菌，温度降低至60 ℃后再与培养基混合后倒平板。

测定溶解无机磷能力的培养基用PKO无机磷培养基，配方（g/L）：0.5 g (NH₄)₂SO₄，5.0 g Ca₃(PO₄)₂；0.2 g NaCl，0.2 g KCl，0.03 g MgSO₄·7H₂O，0.003 g FeSO₄，0.03 gMnSO₄，10.0 g葡萄糖，0.5 g酵母膏，16.0 g琼脂，1000 mL蒸馏水，pH值7.0，其中Ca₃(PO₄)₂用研钵碾碎后过300目筛并单独干热灭菌后，与灭菌温度降至60 ℃左右的培养基混合倒平板。

将活化的根瘤菌菌株XGL026点接种于PKO无机磷、蒙金娜有机磷固体培养基平板上，重复3次，28 ℃恒温培养箱培养7 d后观察菌株是否生长及是否有溶磷圈产生，并测量溶磷圈的大小。溶磷圈直径与菌落直径比值（D/d）越大，说明菌株的溶磷性能越强，D/d比值越小，其溶磷性能越弱，当D/d=1时表示菌株无溶磷能力。结果表明（见图6，图7）苜蓿中华根瘤菌XGL026对磷酸钙和卵磷脂均具有较强的溶解能力，卵磷脂、磷酸钙平板上测定的D/d比值分别为1.31、1.16。

2. 分泌生长素（IAA）能力测定

采用比色法测定，将活化的根瘤菌菌株XGL026接种于装有50 mL YMA培养液的三角瓶中，120 r/min，28 ℃培养，重复3次，培养12 d后，取根瘤菌悬浮液100 µL滴置于白色陶瓷比色板上，同时加50 µL比色液（比色液的组成：4.5 g FeCl₃，H₂SO₄ 30 mL），对照只在比色液中加入50 µL的植物生长素(IAA)。将陶瓷比色板置于室温下15 min后观察其颜色变化。颜色变为粉红色为阳性，表示菌株能够分泌IAA，颜色越深表示分泌IAA的强度越大；不变色为阴性，表示菌株不能分泌IAA。实验结果显示根瘤菌菌株XGL026生长的培养液颜色变为深粉红色，说明苜蓿中华根瘤菌XGL026分泌IAA能力较强。

实例5 苜蓿中华根瘤菌XGL026田间竞争结瘤能力测定

本试验设在新疆呼图壁县种牛场新疆农业大学草地生态试验站，采用田间大区试验，试验地前茬作物为苏丹草，供试苜蓿品种为新牧1号紫花苜蓿。试验采用3×3二因素设计，因素1为不同灌溉方式（喷灌、地下滴灌和传统漫灌），因素2为不同根瘤菌的接种处理(接种参比菌株苜蓿中华根瘤菌ACCC17544、接种苜蓿中华根瘤菌XGL026和不接根瘤菌对照处理CK），共9个处理区。每个处理区面积为0.8 hm²，春季播种，播种量为22.5 kg·hm^-2。播种前将制备好的根瘤菌菌悬液（OD₆₀₀值为0.8）与种子混匀、拌种。对照处理用无菌YMA液体培养基拌种。种植过程中以三料过磷酸钙（有效P₂O₅含量43%，300 kg·hm^-2）作为基肥一次性施入，但未施用过任何氮肥。播种后分别采用喷灌、地下滴灌和漫灌方式进行灌溉，常规田间管理。

播种后60 d，从不同灌溉方式、不同根瘤菌接种处理的9个处理区，随机采集苜蓿植株上的根瘤，表面灭菌后破碎根瘤，利用硅藻土吸附法直接提取根瘤总DNA及供试根瘤菌菌株总DNA。并以根瘤总DNA和供试根瘤菌菌株总DNA为模板，利用BOXAIR（5'-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3'）为引物进行BOX-PCR扩增，PCR反应体系（25 µL）：10×PCRBuffer 2.5 µL，25 mmol/L MgCl₂ 3.5 µL，10 µmol/L BOXAIR 1.0 µL，2.5 mmol/L dNTP4.0 µL，10 mg/mL BSA 0.5 µL，DMSO 2.5 µL，2.5 U/µL的TaqDNA聚合酶 0.5 µL，DNA模板1.0 µL，ddH₂O 9.5 µL。反应条件：95 ℃预变性2 min；94 ℃变性1 min，52 ℃退火1 min，65 ℃延伸8 min，扩增30个循环；65 ℃补偿延伸18 min。反应结束后取8 µL扩增产物，15g/L的琼脂糖凝胶电泳分析。

根据BOX-PCR扩增电泳图谱（见图8）计算不同处理条件下的田间占瘤率，结果显示（见表2），在3种灌溉方式下，接种根瘤菌株XGL026和ACCC17544较未接菌对照均能显著增加苜蓿结瘤数，提高田间占瘤率。根瘤菌株XGL026菌株较参比菌株ACCC17544，苜蓿单株结瘤数增加1.1-7.2 个/株、占瘤率提高5.0%-10.7%，差异达显著水平（P<0.01），说明在本试验地根瘤菌株XGL026具有更强的田间竞争结瘤能力，接种效果优于ACCC17544。

表2 不同处理下的苜蓿根瘤数及占瘤率

注：表中不同小写字母表示处理间差异显著（P < 0.05），不同大写字母表示处理间差异极显著（P < 0.01）。

实例6苜蓿中华根瘤菌XGL026的田间接种应用

本试验设在新疆呼图壁县种牛场新疆农业大学草地生态试验站。采用田间小区试验，设接种苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）XGL026菌株和不接种对照处理，未施用化学肥料和有机肥，采用田间随机区组排列，每处理3次重复，小区面积25.9 m²。供试苜蓿品种为新疆种植面积最大的主栽苜蓿品种新牧1号紫花苜蓿。对苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）XGL026菌株进行绿色荧光蛋白基因（Green-FluorescentProtein，GFP）基因标记。将制备好标记的根瘤菌菌液（OD₆₀₀约1.0），活菌浓度为2.0×10⁹个•mL^-1）与种子混匀、拌种，阴干后播种。采用条播，播种深度为2～3 cm，行距30 cm，播种量3 kg·hm^-2。对照采用无菌YMA培养液拌种。苜蓿于现蕾期刈割，分别于2015年7月3日、8月17日和10月11日刈割3次。其间常规田间管理，适时浇水，除草等。在苜蓿分枝期连根完整挖取10-15株苜蓿植株，统计根瘤总数、标记根瘤占瘤率。各茬苜蓿收获后，用1 m²样方取样，每个样方取1 kg鲜草样，75 ℃烘干后，测定干草率及叶茎比。每小区收割后、称重，测定实际产量。将植株样75 ℃烘干、粉碎，精密同位素质谱仪测定茎叶¹⁵N%和全氮含量，计算不同处理的根瘤菌固氮百分率、固氮量。品质指标测定粗蛋白含量、中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）。

实验结果显示（见表3），接种中华苜蓿根瘤菌XGL026菌株的处理，3茬苜蓿平均单株结瘤数较对照增加54.5%。3茬苜蓿的平均固氮量增加113.52 kg/hm²，干草总产量增加28.7 %，与对照差异达极显著水平；苜蓿品质明显改善，粗蛋白含量加1.53%，酸性洗涤纤维（ADF）和中性洗涤纤维（NDF）分别降低4.67%和3.41%(P<0.01)。

表3 根瘤菌XGL026菌株田间接种效果

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 新疆农业大学

<120> 一株具有抗逆、促生性能的高效苜蓿根瘤菌及其应用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1398

<212> DNA

<213> 苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）

<400> 1

tgatctgaca ggcttacaca tgcaagtcga gcgccccgca aggggagcgg cagacgggtg 60

agtaacgcgt gggaatctac ccttttctac ggaataacgc agggaaactt gtgctaatac 120

cgtatgagcc cttcggggga aagatttatc gggaaaggat gagcccgcgt tggattagct 180

agttggtggg gtaaaggcct accaaggcga cgatccatag ctggtctgag aggatgatca 240

gccacattgg gactgagaca cggcccaaac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg 300

gacaatgggc gcaagcctga tccagccatg ccgcgtgagt gatgaaggcc ctagggttgt 360

aaagctcttt caccggtgaa gataatgacg gtaaccggag aagaagcccc ggctaacttc 420

gtgccagcag ccgcggtaat acgaaggggg ctagcgttgt tcggaattac tgggcgtaaa 480

gcgcacgtag gcggattgtt aagtgagggg tgaaatccca gggctcaacc ctggaactgc 540

ctttcatact ggcaatctag agtccagaag aggtgagtgg aattccgagt gtagaggtga 600

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Claims

1.一株具有抗逆、促生性能的高效苜蓿根瘤菌及其应用，其特征在于所述菌株保藏名称为苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）XGL026，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期是2013年1月21日，保藏编号为CGMCC NO.7179。

2. 根据权利要求1所述的苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）XGL026的应用，其特征在于应用于新疆紫花苜蓿的生产。