CN107881130B - 具有高效解磷能力的根瘤菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株具有高效解磷能力的根瘤菌及其应用。本发明首先公开了一株具有高效解磷能力的根瘤菌，其微生物保藏编号为：CGMCC No.14614。本发明所分离的该根瘤菌菌株具有极强的解磷能力，而且具有较强的固氮能力，在干旱胁迫下仍具有较好的固氮酶活性。在缺磷条件下，该根瘤菌对植株的促生能力明显，能够显著提高紫花苜蓿的产量。本发明进一步公开了所述的根瘤菌在提高豆科植物产量、提高豆科植物对磷的吸收以及提高豆科植物固氮效率中的应用。本发明还公开了所述的根瘤菌在制备解磷菌肥或固氮菌肥中的应用。本发明所分离的具有高效解磷能力的根瘤菌，在提高豆科植物紫花苜蓿的产量中具有重要的应用前景。

Description

具有高效解磷能力的根瘤菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株分离的具有高效解磷能力的根瘤菌(Rhizobium sp.)，还涉及所述根瘤菌在提高豆科植物紫花苜蓿产量中的应用，属于具有高效解磷能力的根瘤菌的分离及应用领域。
背景技术
根瘤菌，指可以与豆科牧草形成共生根瘤而具有将空气中的游离氮转化成可供植物吸收利用的铵态氮的一类细菌。根瘤菌对植物的促生作用除了固氮之外，还可以通过其他途径对植物进行促生，主要途径有：分泌一些特殊的化合物，促进植物对营养物质的摄入；分泌有机酸，使土壤中的难溶性元素溶解后植物易于吸收，如解磷菌；分泌生长促进物质，如三吲哚乙酸。目前，对根瘤菌研究利用的常规方法为：(1)大田取样：在植株营养生长期选取特征地块长势较好的植株，在不伤害根系的情况下将植株整株挖出。尽量选取饱满的粉色根瘤采下后放入装有干燥剂的离心管，4度保存尽快带回实验室。(2)回实验室后将干燥的根瘤取出放入蒸馏水中浸泡，待根瘤恢复饱满状态，表面消毒后放入灭过菌的研钵加少许无菌水研碎，将研碎的液体接入YMA固体培养基培养。待培养基上有根瘤菌长出后选取单独菌落继续转接，直至平板培养基上菌落均一。(3)将分离纯化好的根瘤菌接入YMA液体培养基中培养48小时，与灭菌后的40％甘油1:1接入2ML离心管，放入-80度超低温冰箱保存。(4)理化性质及促生能力测试：对获得的菌株进行一系列理化性质及促生能力的测试(代时，解磷能力，生长素分泌能力，泌酸能力，固氮酶活性等)，进行筛选后留下表现优秀的菌株。(5)生产测试：表现优异的菌株进入实际生产促生能力阶段。菌株进行发酵培养后，进行接种，接种方式为菌液浸泡种子和固体菌剂拌种两种方式。大田测试后促生效果良好的菌株就可认为是优质促生菌株。
紫花苜蓿(Medicago sativa)是一种多年生豆科草本植物，因其抗逆性强、产量高、品质好、利用方式多、适口性好、经济价值高，具有其他豆科牧草不能比拟的许多优点。现有的紫花苜蓿性质差别较大，且在与土著菌的竞争中处在劣势。紫花苜蓿筛选过程中较少发现具有高效解磷能力的根瘤菌。因此，从紫花苜蓿上分离获得具有高效解磷能力的根瘤菌，对于提高紫花苜蓿产量将具有重要意义和应用价值。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一株分离的具有高效解磷能力的根瘤菌；
本发明所要解决的第二个技术问题是提供所述具有高效解磷能力的根瘤菌在提高豆科植物，尤其是紫花苜蓿产量中的应用。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
本发明从吉林省取样获得紫花苜蓿根瘤若干，经分离纯化共获得根瘤菌菌株123株。
本发明对所分离的根瘤菌菌株进行理化性质测试，包括解磷能力、生长素分泌能力、泌酸能力以及固氮酶活性，并将理化性质测试中表现优异的菌株进行盆栽回接试验。理化性质测试结果表明，其中一株根瘤菌菌株具有极强的解磷能力，其在PKO固体培养基培养11d后溶磷圈直径与菌落直径比(D/d)为4.28(3/0.7)，在PKO液体培养基培养7d后该根瘤菌发酵液溶磷量达163mg/L。而且该根瘤菌具有较强的固氮能力，经植株培养60d后的根瘤在血清瓶中反应两小时后固氮酶活性为27.9μmol/g/1h。固氮酶活性试验结果表明，该菌株回接形成的根瘤在离体96h后注入乙炔反应2h后测定固氮酶活性为7.2μmol/g/1h，说明该根瘤菌在干旱胁迫下仍具有较好的固氮酶活性。盆栽回接试验结果表明，在缺磷条件下，该根瘤菌对植株促生能力明显，回接该解磷根瘤菌菌株的盆栽生长60d后较无菌株回接的CK地上生物量高42.9％，植株地上部分粗蛋白含量高于对照23.9％。
本发明所分离的其它大多根瘤菌不具有解无机磷能力，少量具有解无机磷能力的根瘤菌在PKO平板上培养11d后D/d多在1.5-2.5之间，在液体PKO培养基培养7d后发酵液总溶磷量多在20-80mg/L。固氮酶活性试验结果表明，本发明所分离的其它大多根瘤菌菌株回接形成的根瘤离体后14h就不再有乙烯生成。
本发明将分离的具有高效解磷能力的根瘤菌提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.14614；分类命名为：根瘤菌Rhizobium sp.。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2017年9月14日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明进一步公开了所述具有高效解磷能力的根瘤菌在促进豆科植物生长或提高豆科植物产量中的应用。其中，所述促进豆科植物生长包括使豆科植物植株地上部分生物量增加或使植株地上部分粗蛋白含量提高。
本发明进一步公开了所述具有高效解磷能力的根瘤菌在提高豆科植物对磷的吸收中的应用。
本发明进一步公开了所述具有高效解磷能力的根瘤菌在提高豆科植物固氮效率中的应用，尤其是在逆境胁迫下提高豆科植物固氮效率中的应用。其中，所述逆境胁迫包括干旱胁迫。
本发明所述根瘤菌的上述应用的具体方法，包括：将所述具有高效解磷能力的根瘤菌进行发酵培养得到菌液，然后接种豆科植物种子。所述接种的方式包括：用菌液浸泡种子，或者将菌液制备成固体菌剂，进行拌种。其中，固体菌剂的制备方法为本领域技术人员所熟知。
本发明所述的豆科植物包括但不限于紫花苜蓿(Medicago sativa)。
本发明还公开了所述具有高效解磷能力的根瘤菌在制备解磷菌肥或固氮菌肥中的应用。
本发明还公开了一种解磷菌剂，其中包括：所述具有高效解磷能力的根瘤菌。
本发明还公开了一种固氮菌剂，其中包括：所述具有高效解磷能力的根瘤菌。
本发明所述解磷菌剂或固氮菌剂中，还可以包括肥料制备中可接受的载体，例如以鸡粪等动物粪便经腐熟的有机肥为载体，以甘蔗渣、椰子皮堆沤处理作载体，或以蛭石、栽培食用菌的下脚料--菌糠为载体。
本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明从紫花苜蓿上分离获得一株具有高效解磷能力的根瘤菌，该根瘤菌具有较强的固氮能力，而且该根瘤菌形成的根瘤离体后在脱水状态下依然能较长时间的保持固氮酶活性。该根瘤菌对植株促生能力明显，在缺磷条件下建植紫花苜蓿人工草地时接种该根瘤菌，能够显著提高紫花苜蓿的产量。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1具有高效解磷能力的根瘤菌的分离和鉴定
1、试验方法
2015年5月，在吉林省白城畜牧兽医学院试验地取样获得紫花苜蓿根瘤若干，带回实验室后分离纯化，方法如下：
1、取样获得的根瘤放入干燥剂中迅速脱水后冷藏保存，并尽快带回实验室。
2、回实验室后，将脱水根瘤放入无菌水中浸泡，待根瘤恢复饱满状态后加95％乙醇浸泡30S消除表面张力，然后直接加入0.2％的HgCL2消毒2min，用无菌水冲洗6次后，用无菌不锈钢镊子捣碎后接到平板YMA培养基中(每个根瘤接三个重复平板培养基)。
3、最终共分离获得根瘤菌菌株123株。对这些根瘤菌菌株进行理化性质(解磷能力，生长素分泌能力，泌酸能力，固氮酶活性)测试。
(1)解磷能力：a、固体培养基用固体PKO培养基，各3个重复培养皿，每培养皿4个接菌点，置生化培养箱28℃下恒温培养，培养11d后测量根瘤菌菌落直径和溶磷透明圈直径，计算根瘤菌菌落溶磷透明圈直径与菌落直径的比值，比值越大，溶磷能力越强，比值越小，溶磷能力越弱，比值为1时表示菌落无溶磷能力。b、液体培养基利用PKO液体培养基，25℃、120rpm振荡培养7天后利用钼蓝比色法测发酵液中磷含量。
(2)生长素分泌能力：采用比色法测定根瘤菌分泌生长素(IAA)能力，测定培养基采用改良的刚果红液体培养基，组成：0.5gK2HPO4.3H2O，0.2gMgSO4.7H2O，0.1gNaCl，1g酵母膏，10g甘露醇，1gNH4NO3，100mg/L色氨酸，1000mL蒸馏水，pH值7.0；PC比色液配方：0.5mol/mLFeCl3，H2SO430mL，蒸馏水50mL。将菌株接种于盛有50mL培养基的三角瓶中，置于转速125r/min、温度28℃的摇床培养，每一菌株3个重复，培养12d。取上述培养12d培养液在10000r/min下4℃离心10min，取上清液1mL加1mL PC比色液在黑暗下静置30min后，迅速用分光光度计比色(波长530nm)。
(3)泌酸能力：1000ml液体YMA培养基中加入0.5％溴麝香草酚兰溶液5ml(0.5％溴麝香草酚兰溶液配制：称取0.5g BTB，用少量无水酒精溶解后，加入蒸馏水至100mL。)，用已灭菌的NaOH溶液调节pH至7.0，使得培养基呈草绿色，将在液体YMA培养基上生长48±6h的各菌株悬浮液调节至相同浓度后，取1ml接至灭菌后溴麝香草酚兰液体培养基中，3次重复，置于28℃摇床上培养3～7d观察结果。产酸变黄，产碱变蓝，用酸度计测定菌液pH值。
(4)固氮酶活性：将生长60天的试管苗无损伤洗出，用无菌手术刀将根瘤切下，放入5ml抗凝管中。达到气密状态用注射器抽出1ml的空气再注入1ml纯度为99.999％的乙炔，28℃反应两小时后利用气相色谱仪测定血清瓶中乙烯含量。气相色谱仪反映条件：AL2O3毛细柱，柱温50℃，进样器温度150℃，检测器温度180℃；检测器为氢火焰检测器(FID)。
4、将理化性质测试中表现优异的菌种进行盆栽回接试验，盆栽基质为蛭石。在无菌工作台中将供试的根瘤菌菌株接入灭菌的YMA液体培养基中，置于28℃控温摇床中培养约48±6h(摇床转速为120r/min)后，用分光光度计测定该培养菌液的OD600nm值，以较低OD600nm值菌液为基准(一般要求OD600nm值大于0.5)，将各菌株培养液通过加入无菌水稀释，配制成OD600nm值相等的标准悬浮菌液。选取籽粒饱满、无损伤、大小一致的紫花苜蓿种子，按10粒/管播种量置于90mm的培养皿中，用等量标准悬浮菌液浸泡4h后，菌液和种子一起均匀播种于试管中，供试苜蓿品种为农菁1号，每个菌株设3次重复，以10g/kg的量添加粒径为1-2mm、经干热灭菌的磷酸钙颗粒。试管蛭石缺水时适量浇Hoagland's无磷营养液。设不接种根瘤菌试管苗为对照(CK)。温室生长60d后测紫花苜蓿地上部分鲜重和粗蛋白。地上部分鲜重用万分之一电子天平，粗蛋白用凯氏定氮法。
2、试验结果
2.1解磷能力测试结果
菌株促生能力测试结果表明(表1)：本发明分离获得的一株根瘤菌(即保护菌株：CGMCC No.14614)具有极强的解磷能力，在PKO固体培养基(以磷酸三钙Ca3(PO4)2为难溶性磷源)培养11d后溶磷圈直径与菌落直径比(D/d)为4.28(3/0.7)；在PKO液体培养基培养7d后该根瘤菌发酵液溶磷量达163mg/L。而分离的其他普通根瘤菌大多不具有解无机磷能力；少量具有解无机磷能力的根瘤菌在PKO(无机磷细菌培养基)平板上培养11d后D/d多在1.5-2.5之间；液体PKO培养基培养7d后发酵液总溶磷量多在20-80mg/L。
表1根瘤菌菌株的解磷能力测试结果
菌株编号 11天溶磷圈D\d 7天有效磷增量(溶磷量)
BC-3-3-2 (4.3/1.8)2.39 55.63792mg/L
BC-3-4-5 (3.3/2.1)1.57 71.97325mg/L
BC-3-A — 45.39373mg/L
BC-3-4-11 (3.6/1.7)2.12 67.91249mg/L
BC-3-5-10 — 80.00248mg/L
BC-3-5-4 (4.1/2.1)1.95 73.51631mg/L
保护菌株 (3/0.7)4.28 163.47532mg/L
2.2固氮酶活性测试结果
固氮酶活性测试结果表明，该菌株(即保护菌株：CGMCC No.14614)有较强的固氮能力，植株培养60d后的根瘤在血清瓶中反应两小时后固氮酶活性为27.9μmol/g/1h(表2)。
固氮酶活性试验中，大多根瘤菌菌株回接形成的根瘤离体后14h就不再有乙烯生成；但该菌株在离体96h后注入乙炔反应2h后测定固氮酶活性为7.2μmol/g/1h。说明该根瘤在干旱胁迫下仍会有较好的固氮酶活性。
表2根瘤菌菌株的固氮酶活性测试结果
菌株编号 2h(μmol/g/1h) 96h(μmol/g/1h)
BC-3-3-2 17.52 /
BC-3-4-5 13.4 /
BC-3-A 26.5 /
BC-3-4-11 9.3 /
BC-3-5-10 21.6 /
BC-3-5-4 37.2 /
保护菌株 27.9 7.2
2.3盆栽回接试验结果
盆栽回接试验表明，该菌株(即保护菌株)在缺磷条件下，对植株促生能力明显。回接该解磷根瘤菌菌株的盆栽生长60d后较无菌株回接的CK地上生物量高42.9％，植株地上部分粗蛋白含量高于对照23.9％。

Claims (9)

1.一株分离的具有高效解磷能力的根瘤菌（Rhizobium sp.），其特征在于，其微生物保藏编号为：CGMCC No.14614。
2.权利要求1所述的根瘤菌在促进豆科植物生长或提高豆科植物产量中的应用。
3.权利要求1所述的根瘤菌在提高豆科植物对磷的吸收中的应用。
4.权利要求1所述的根瘤菌在提高豆科植物固氮效率中的应用。
5.权利要求1所述的根瘤菌在逆境胁迫下提高豆科植物固氮效率中的应用；所述逆境胁迫是干旱胁迫。
6.按照权利要求2至5任何一项所述的应用，其特征在于，所述豆科植物包括紫花苜蓿。
7.权利要求1所述的根瘤菌在制备解磷菌肥或固氮菌肥中的应用。
8.一种解磷菌剂，其特征在于，包括：权利要求1所述的根瘤菌。
9.一种固氮菌剂，其特征在于，包括：权利要求1所述的根瘤菌。
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