CN109321466B

CN109321466B - 一种提高根瘤菌液体菌剂活菌数和结瘤固氮效果的辅料及应用

Info

Publication number: CN109321466B
Application number: CN201811369756.8A
Authority: CN
Inventors: 李友国; 杜倩; 王宏丽; 陈大松
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2018-11-17
Filing date: 2018-11-17
Publication date: 2021-10-08
Anticipated expiration: 2038-11-17
Also published as: CN109321466A

Abstract

本发明公开了一种提高根瘤菌液体菌剂接种效果的辅料，包括：聚乙二醇1g/L‑10g/L、海藻酸钠0.5g/L‑2g/L、羟甲基丙基纤维素0.5g/L‑5g/L，其余为生理盐水。利用本发明提供的配方，与根瘤菌配伍制备成根瘤菌液体菌剂，可提高根瘤菌的活菌数量，同时提高根瘤菌的结瘤固氮效果，促进豆科植物生长。与不加辅料的根瘤菌剂相比，其结瘤数量以及根瘤固氮酶活性均有显著提高。因此，本发明提供的辅料具有良好的市场应用前景，适用于大规模生产。

Description

一种提高根瘤菌液体菌剂活菌数和结瘤固氮效果的辅料及应用

技术领域

本发明属于根瘤菌剂生物技术在农业领域上的应用，涉及一种提高根瘤菌液体菌剂活菌数和结瘤固氮效果的辅料及应用，利用本发明提供的辅料制备成液体根瘤菌剂适合于豆科植物，有利于豆科植物的结瘤固氮。

背景技术

大豆的产量在我国占有很大比重，而氮肥是提高豆科植物产量的关键。根瘤菌与豆科植物的共生固氮作用是比较重要的植物与微生物相互作用的模式之一，它固氮量大、抗逆性强，是生物固氮体系中最高效的体系，固氮量约占生物固氮总量的80％(林稚兰，黄秀梨.2000)。施用化肥和农药早已是不可或缺的措施，但是化学氮肥均来源于高温高压下由氮气和氢气合成的氨，化学氮肥的生产不仅浪费能源，而且施用后会因流失而污染环境，造成土壤理化性质变化，团粒结构破坏，土壤板结，保水力下降等后果(Stamatiadiset al 1999)。不仅如此，施用化肥的利用率也会下降，Zhu and Chen等报道施用的氮肥只有三分之一被作物吸收利用，农药和化肥的施用也会威胁食品安全。

如此，微生物菌剂应运而生。微生物菌剂是微生物肥料的一种，微生物肥料(microbial fertilizer)又称生物肥料(biofertilizer)、菌肥、接种剂(microbialinoculant)，是一类以微生物生命活动及其产物导致农作物得到特定肥料效应的微生物活体制品，通过其中所含微生物的生命活动，增加植物养分的供应量或促进植物生长，提高产量，改善农产品品质及农业生态环境。而根瘤菌与豆科植物共生成为豆科植物固氮的重要方式，它可以为豆科植物提供所需氮量的1/2-1/3。土壤中有效根瘤菌的数量是决定豆科植物产量的重要因素，而根瘤菌剂的使用可有效提高土壤中根瘤菌数量。

研发高效的根瘤菌剂成为我们关注的焦点。目前，根瘤菌剂作为一种有效提高豆科植物产量的微生物菌剂，已得到了较为全面开发。目前市售的根瘤菌剂主要有液态、固态和颗粒 3种剂型。液体菌剂使用方便、浓缩度高，但是存在易污染、难储存的缺点。固体菌剂主要以草炭、蛭石或珍珠岩为吸附剂，近年来，又开发了许多新吸附剂，如海藻酸钠、污泥等。既节约了成本，又可达到很好的吸附效果。颗粒菌剂是将根瘤菌液喷在草炭等固体载体上制成，通过充分混合、造粒流程，具有使用效果好，运输方便等特点(Solaiman andRabbani 2006)。

现在商业化的根瘤菌剂应用的确增加了作物生产力，而质量好的根瘤菌应具备高效固氮和竞争结瘤能力。针对液体菌剂，菌株必须是具有活性的，要保证储存活菌数大于10⁹CFU/ml，无杂菌、无毒害，要保证维持液体菌剂保藏过程中的生理生化因素稳定，如酸度、水含量、温度等(Lupwayi et al.2000)。我国根瘤菌剂的研究可追溯到20世纪30年代，经过科研工作者的不懈努力，现在我国在根瘤菌的菌种收藏和分类研究方面处于领先地位，制备根瘤菌剂的技术也趋于成熟。例如，秦皇岛领先科技有限公司的根瘤菌液体菌剂保藏12个月，活菌数超过2×10⁹CFU/ml(刘佳音，2011)。但是我国豆科植物接种根瘤菌剂面积仅占总播种面积1％-3％，远远低于国际平均水平(朱铁霞，2005)。而且，存在产品类型相对单一、应用效果不甚显著、稳定性不足等问题。因此，只有通过进一步筛选优良根瘤菌株、规范产品标准、不断加大推广力度，才能使我国根瘤菌剂产业更上一层楼。

在根瘤菌剂的相关研究进程中，通过相互比对和优化，液体浓缩菌剂的应用更具前景。本发明提供的菌剂辅料，可在保证菌体纯度和活性的基础上，提高根瘤菌剂的有效活菌数，提升根瘤菌的存活率，使用辅料延长根瘤菌剂的保藏期限，降低生产成本，为根瘤菌剂的商业化、规模化、标准化投产和应用提供方案。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高根瘤菌液体菌剂保藏效果的辅料。该辅料溶水性好、透明度高，具有一定增稠性和粘着性，保藏效果好，体系均一稳定。在浓缩液体根瘤菌剂的保藏周期中，可提高根瘤菌的活菌数。

本发明的目的在于提供一种提高根瘤菌剂效果的辅料的应用。将辅料与根瘤菌液混合后，利用本发明提供的辅料，与根瘤菌混合后，可在液体根瘤菌剂的保藏过程中提高根瘤菌的存活率，降低活菌数的死亡速率，延长有效根瘤菌活菌数范围内的根瘤菌剂的保藏周期，提高豆科植物的结瘤固氮效果。

为了达到上述目的，本发明采取如下措施：

一种提高根瘤菌剂保藏效果的辅料，包括：聚乙二醇1g/L-10g/L、海藻酸钠0.5g/L-2g/L、羟甲基丙基纤维素0.5g/L-5g/L，其余为生理盐水；

所述的聚乙二醇为聚乙二醇4000、聚乙二醇6000或聚乙二醇8000。

以上所述的辅料，包括(优选范围)：聚乙二醇5g/L-10g/L、海藻酸钠1g/L-2g/L、羟甲基丙基纤维素1g/L-5g/L，其余为生理盐水。

一种提高根瘤菌剂效果的辅料的应用，包括该辅料用于制备成根瘤菌剂，或者用于提高根瘤菌液体菌剂活菌数，或者用于提高根瘤菌液体菌剂结瘤固氮效果。

以上所述的应用中，优选的，当用于制备成根瘤菌剂时，所述的菌剂包括：费氏中华根瘤菌HN01(Sinorhizobium fredii HN01)和辅料；其中辅料包括：聚乙二醇4000 10g/L、羟甲基丙基纤维素5g/L，海藻酸钠2g/L，其余为生理盐水。

以上所述的应用中，优选的，当用于制备成根瘤菌剂时，所述的菌剂包括：华癸中慢生根瘤菌7653R(Mesorhizobium huakuii 7653R)和辅料；其中辅料包括：聚乙二醇600010g/L、羟甲基丙基纤维素5g/L、海藻酸钠2g/L，其余为生理盐水。

以上所述的应用中，优选的，当用于制备成根瘤菌剂时，所述的菌剂包括：大豆慢生根瘤菌USDA110(Bradyrhizobium japonicum USDA110)和辅料；其中辅料包括：聚乙二醇6000 5g/L、羟甲基丙基纤维素1g/L、海藻酸钠2g/L，其余为生理盐水。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.浓缩液体根瘤菌剂为半透明乳白色偏黄的液体，有利于存储和施用；

2.辅料成分为多聚物，经济适用，性能稳定；

3.辅料成分明显提高了根瘤菌存活率，使得在6个月时活菌数还保持在10亿CFU/mL；

4.辅料成分在保藏中缓冲性好，pH值维持在6.4-7.3之间，有利于根瘤菌剂和豆科植物生长；

5.辅料成分的增稠性和粘着性降低了菌体水分的缺失，使得保藏体系维持在适宜水平。

6.利用本发明所提供辅料制备的根瘤菌剂，其优异性能超越了目前的根瘤菌剂保护剂效果，符合微生物液体菌剂的出厂指标和有效期内指标。本发明的根瘤菌剂可以用于豆科植物的根部，以提高豆科植物的结瘤固氮效果。

附图说明

图1为费氏中华根瘤菌HN01(Sinorhizobium fredii HN01)植物盆栽验证结果。

图2为华癸中慢生根瘤菌7653R(Mesorhizobium huakuii 7653R)植物盆栽验证结果。

图3为华癸中慢生根瘤菌7653R(Mesorhizobium huakuii 7653R)植物盆栽验证结果。

图4为大豆慢生根瘤菌USDA110(Bradyrhizobium japonicum USDA110)植物盆栽验证结果。

具体实施方式

本发明实施例所用试剂如下：

其余未特别涉及的试剂或材料均来源于商业渠道。

本发明实施例中，将聚乙二醇简写为PEG，将海藻酸钠简写为Alginate，将羟丙基甲基纤维素简写为HPMC。

实施例1：

一种提高根瘤菌剂效果的辅料在制备根瘤菌剂中的应用：

本实施例以提高费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)HN01的效果为例，对本发明提供的辅料进行说明。

一种提高根瘤菌剂效果的辅料：

配方1：PEG4000 10g/L，Alginate 2g/L，HPMC 5g/L，其余为生理盐水；

配方2：PEG4000 1g/L，Alginate 0.5g/L，HPMC 0.5g/L，其余为生理盐水；

配方3：PEG6000 10g/L，Alginate 2g/L，HPMC 5g/L，其余为生理盐水；

配方4：PEG6000 1g/L，Alginate 0.5g/L，HPMC 0.5g/L，其余为生理盐水；

配方5：PEG8000 10g/L，Alginate 2g/L，HPMC 5g/L，其余为生理盐水；

配方6：PEG8000 1g/L，Alginate 0.5g/L，HPMC 0.5g/L，其余为生理盐水；

配方7：PEG4000 10g/L，Alginate 2g/L，HPMC 5g/L，其余为生理盐水；

活化费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)HN01(李友国，周俊初，2002)，并培养至对数生长期，离心，获得菌体。离心后的菌体用PBS洗涤后，用生理盐水重悬，重悬后的菌液浓度是20*10¹⁰CFU/mL，具体见下表；按照配方1-7加入各组分(辅料与菌液的体积比是4:1)，混合均匀，并且测定生理生化指标pH，即得根瘤菌剂；制备完成的根瘤菌剂于 4℃保藏；用稀释平板法和微平板法辅助定期监测根瘤菌剂的活菌数，为期3-6个月。

本发明提供的辅料在提高费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)HN01活菌数中的效果如下：

本表中的数字代表活菌数，活菌数的单位为10⁹CFU/mL。

在保藏初期至保藏6个月期间，保藏体系的pH值变化范围为6.40-7.63。

实施例2：

一种提高根瘤菌剂效果的辅料在制备根瘤菌剂中的应用：

本实施例以提高华癸中慢生根瘤菌7653R(Mesorhizobium huakuii 7653R)的效果为例，对该进行说明。

配方1：PEG4000 10g/L，Alginate 2g/L，HPMC 5g/L，其余为生理盐水；

配方3：PEG6000 10g/L，Alginate 2g/L，HPMC 5g/L，其余为生理盐水；

配方5：PEG8000 10g/L，Alginate 2g/L，HPMC 5g/L，其余为生理盐水；

配方8：PEG6000 10g/L，Alginate 2g/L，HPMC 5g/L，其余为生理盐水；

活化华癸中慢生根瘤菌7653R(Mesorhizobium kuakuii 7653R)(李友国，周俊初，2003)，并培养至对数生长期，离心，获得菌体。离心后的菌体用PBS洗涤后，用生理盐水重悬，重悬后的菌液浓度是20*10¹⁰CFU/mL左右，具体见下表；按照上述配方1-6，8加入各组分(辅料与菌液的体积比是4:1)，混合均匀，并且测定生理生化指标pH，即得根瘤菌剂；制备完成的根瘤菌剂于4℃保藏；用稀释平板法和微平板法辅助定期监测根瘤菌剂的活菌数，为期3-6个月。

本发明提供的辅料在提高华癸中慢生根瘤菌7653R(Mesorhizobium huakuii7653R)活菌数中的效果如下：

本表中的数字代表活菌数，活菌数的单位为10⁹CFU/mL。

在保藏初期至保藏6个月期间，保藏体系的pH值变化范围为6.71-7.43。

实施例3：

一种提高根瘤菌剂效果的辅料在制备根瘤菌剂中的应用：

本实施例以提高大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)USDA110的效果为例，对该配方进行说明。

配方1：PEG4000 10g/L，Alginate 2g/L，HPMC 5g/L，其余为生理盐水；

配方3：PEG6000 10g/L，Alginate 2g/L，HPMC 5g/L，其余为生理盐水；

配方5：PEG8000 10g/L，Alginate 2g/L，HPMC 5g/L，其余为生理盐水；

配方9：PEG6000 5g/L，Alginate 2g/L，HPMC 1g/L，其余为生理盐水；

活化大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)USDA110(戴美学等2003)，并培养至对数生长期，离心，获得菌体。离心后的菌体用PBS洗涤后，用生理盐水重悬，重悬后的菌液浓度是20*10¹⁰CFU/mL；按照上述配方1-6，9加入各组分(辅料与菌液的体积比是4:1)，混合均匀，并且测定生理生化指标pH，即得根瘤菌剂；制备完成的根瘤菌剂于4℃保藏；用稀释平板法和微平板法辅助定期监测根瘤菌剂的活菌数，为期3-6个月；

本发明提供的辅料在提高大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)USDA110活菌数中的效果如下：

本表中的数字代表活菌数，活菌数的单位为10⁹CFU/mL。

在保藏初期至保藏6个月期间，保藏体系的pH值变化范围为6.9-7.30。

实施例4：

一种提高根瘤菌剂效果的辅料在制备根瘤菌剂中的应用：

费氏中华根瘤菌HN01和大豆慢生根瘤菌USDA110的共生植物为大豆，华癸中慢生根瘤菌7653R的共生植物为紫云英。将上述三种菌株分别接种其共生植物，以考察本发明提供的辅料对豆科植物结瘤固氮的影响。

具体步骤如下：

1.豆科植物盆栽结瘤

1)沙子处理

用自来水冲洗沙子，洗去沙子中的泥和石子，晾干水。

a.用花盆栽培：将晾干的沙子放入布袋子中灭菌，灭菌条件：121℃灭菌1h。花盆用70％乙醇或次氯酸钠擦洗，盆地垫上纱网或小石块，以防漏沙，然后将沙放入盆中。

b.用塑料杯子种：将晾干的沙子装入事先准备好的塑料水杯(将一次性塑料纸杯底部烫一小孔，将纱布条穿过小孔)，然后在外面套一个装了无氮Fahraeus营养液的玻璃瓶子，用厚纸封口，然后一并灭菌。

2)种子处理

a.紫云英种子：挑选个大饱满绿色的紫云英种子放在PA瓶中，浸入75％(v/v)的乙醇5min，倒去乙醇，再以5％(v/v)NaClO表面消毒10min，无菌水洗涤8-10次(用无菌水浸泡4-6h)，平铺在1-2％的水琼脂平板上，28℃培养箱内倒置培养。每天观察，及时将已发芽的种子挑出放4℃保存。以便在播种时，种子生长进度一致。

b.大豆种子：挑选个大饱满的大豆种子放在三角瓶中，浸入75％(v/v)的乙醇5min，倒去乙醇，再以5％(v/v)NaClO表面消毒3min，无菌水洗涤8-10次，无菌水浸泡不超过30min, 平铺在1-2％的水琼脂平板上，28℃培养箱内培养。每天观察，及时将已发芽的种子挑出放4℃保存。以便在播种时，种子生长进度一致。

3)盆栽方法

a.用盆栽种紫云英

播种前，盆钵用5％(v/v)NaClO浸泡至少15min，冲去残留的NaClO，与紫外灯下照射，装入冲洗干净并灭菌的砂子，以无菌Fahraeus无氮营养液浇透(盆底垫上灭菌纱布和小石头，以防漏沙)。将发芽的种子无菌条件下浅播于灭菌砂钵中，每个盆中播种5-7颗。为防水分蒸发和杂菌污染，可在盆上覆盖保鲜膜。于光照室培养，待5-6天后幼苗子叶展开，第一片真叶挺出，揭去保鲜膜，即可接种Mesorhizobium huakuii 7653R。

b.用塑料杯栽种大豆

播种时将灭菌完成的砂钵用灭过菌的镊子小心撕破杯子口上的纸，选取催芽后发芽较好的种子，将种子胚根向下插入砂子中，使种子固定住。每盆砂钵中播种三颗，放入光照室培养。培养6d后，幼苗子叶展开，第一片真叶挺出，即可分别接种HN01和USDA110。

4)接菌方法

根瘤菌活化后，接入液体TY和YMA培养基中，28℃振荡培养。培养好的根瘤菌转入灭菌离心管中，于4℃7000r/min离心5min，收集菌体，以无菌Fahraeus无氮营养液洗涤并离心2 次，最后再加入无氮营养液，振荡混匀，以每棵植物接1mL菌液浇于幼苗根部。

每种菌共设置四组：

a、不接菌组；

b、菌原液组；

c、为b组20倍浓度的菌原液组；

d、加入本发明提供的辅料的菌剂组；

其中：c组和d组中的菌浓度相同；HN01菌体OD₆₀₀值为10.156，7653R菌体OD₆₀₀值为10.248，USDA110菌体OD₆₀₀值为7.848。

d组又分别设置了3种候选配方：

费氏中华根瘤菌HN01菌剂：辅料为上述配方7，配方2，以及新配方10：包括PEG600010g/L，Alginate 2g/L，HPMC 0.5g/L；

华癸中慢生根瘤菌7653R菌剂：辅料为上述配方8，配方5，以及新配方11：包括PEG4000 5g/L，Alginate 0.5g/L，HPMC 1g/L；

大豆慢生根瘤菌USDA110菌剂：辅料为上述配方9，配方3，以及新配方12：包括PEG6000 5g/L，Alginate 1g/L，HPMC 1g/L。

5)植物培养结瘤

于24-28℃的光照培养室内培养植物，根据环境湿度适时向盆中或塑料杯中浇适量营养液，光照生长30天，收取植物，测定植物株高，地上鲜重，根瘤重，根瘤数及固氮酶活。

2.根瘤固氮活性测定

根瘤中的固氮酶能将氮气还原为氨，也能将乙炔还原为乙烯。所以一般用气象色谱技术检测根瘤将乙炔还原为乙烯的量来检测固氮酶活性，具体操作方法见《微生物实验操作》。

2.1费氏中华根瘤菌HN01固氮酶活的测定结果(图1，表1)

表1费氏中华根瘤菌HN01菌剂盆栽实验测定指标

据表1可以看出，20倍HN01菌原液组较1倍HN01菌原液组，结瘤量增加22个，固氮酶活增加4.32个单位，固氮酶活增加了37.4％。同比，配方7菌剂组结瘤量较20倍HN01 菌原液组结瘤量增加接近一倍，固氮酶活增加3.667个单位，同比增加了31.8％。配方2菌剂组结瘤量较20倍HN01菌原液组，结瘤量平均增加30个，固氮酶活增加2.81个单位，同比增加了24.4％。配方10菌剂组结瘤量较20倍HN01菌原液组，结瘤量增加26个，固氮酶活增加1.23个单位，同比增加了11％。同时，从图1上可看出，菌剂组具备促进植物生长的效果。a和b分别表示与对照组相比，p<0.05和p<0.01。

2.2华癸中慢生根瘤菌7653R固氮酶活测定结果(图2，图3，表2)

表2华癸中慢生根瘤菌7653R菌剂盆栽实验测定指标

据表2可以看出，20倍7653R菌原液组较1倍7653R菌原液组的结瘤量增加3个，固氮酶活增加0.4个单位，固氮酶活增加了2.6％。同比，配方8菌剂组结瘤量较20倍7653R 菌原液组结瘤量增加接近一倍，固氮酶活增加3.491个单位，同比增加了29％。配方5菌剂组结瘤量较20倍7653R菌原液组结瘤量增加2个，固氮酶活增加1.49个单位，同比增加了 12％。配方11菌剂组结瘤量较20倍7653R菌原液组结瘤量增加2个，固氮酶活增加1.757 个单位，同比增加了14.6％。同时，从图2、图3上可看出，菌剂组具备促进植物生长的效果。a和b分别表示与对照组相比，p<0.05和p<0.01。

2.3大豆慢生根瘤菌USDA110固氮酶活测定结果(图4，表3)

表3大豆慢生根瘤菌USDA110菌剂盆栽实验测定指标

据表3可以看出，20倍USDA110菌原液组较1倍USDA110菌原液组，结瘤量增加 31个，固氮酶活增加1.1个单位，固氮酶活增加了11.8％。同比，配方9菌剂组结瘤量较20 倍USDA110菌原液组，结瘤量增加14个，固氮酶活增加2.864个单位，同比增加了27.6％。配方3菌剂组结瘤量较20倍USDA110菌原液组，结瘤量增加4个，固氮酶活增加0.36个单位，同比增加了3.5％。配方12菌剂组结瘤量较20倍USDA110菌原液，结瘤量增加8 个，固氮酶活增加2.277个单位，同比增加了21％。同时，从图4上可看出，菌剂组具备促进植物生长的效果。a和b分别表示与对照组相比，p<0.05和p<0.01。

Claims

1.一种根瘤菌剂，包括：华癸中慢生根瘤菌7653R、聚乙二醇6000 10g/L、羟甲基丙基纤维素5g/L、海藻酸钠2g/L，其余为生理盐水。

2.一种根瘤菌剂，包括：大豆慢生根瘤菌USDA110、聚乙二醇6000 5g/L、羟甲基丙基纤维素1g/L、海藻酸钠2g/L，其余为生理盐水。