CN112679280A

CN112679280A - 一种高效生防促生人参复合微生物菌肥制备方法

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Publication number: CN112679280A
Application number: CN202011523873.2A
Authority: CN
Inventors: 罗云清; 许永华; 赵玥; 卢宝慧; 董岭; 刘文丛
Original assignee: Jilin Agricultural University
Current assignee: Jilin Agricultural University
Priority date: 2020-12-22
Filing date: 2020-12-22
Publication date: 2021-04-20

Abstract

一种高效生防促生人参复合微生物菌肥制备方法，它涉及人参生态种植技术领域，解决现有非林地栽培人参主要通过化肥农药等方式达到提高人参产量的目的。制备方法：一、采集；二、筛选分离；三、复合微生物菌肥制备。优点：一、4种菌株具有抗逆性强、增殖能力强且相互促进生长；二、活菌数量之大，可达16.67×109 CFU·ml^‑1；三、活化肥效，增加氮、磷、钾再利用及促进人参根系吸收，具有缓释性、持效性和肥效长，提高人参产量和质量；四、改善土壤微生物菌群结构特征，增加有益菌群多样性，具有生防功能；五、操作简单、成本低廉、见效显著、环境友好等特点。本发明主要用于人参生态种植生防、增加肥效及增产。

Description

一种高效生防促生人参复合微生物菌肥制备方法

技术领域

本发明属于药用植物生态种植技术领域，具体为一种高效能、活化肥效、微生物多抗生防的复合微生物菌肥制备方法。

背景技术

人参（Panax ginseng C. A. Mey.）素有百草之王的美誉，因其具有出众的功效和良好的现代药理学活性而备受瞩目。长期以来，由于过度采挖和人为环境破坏，野生人参资源现已濒临灭绝。因野生人参资源的稀缺，大量人工栽培人参已是必然。近些年来，随着国家退耕还林等政策的实施、药用植物生态种植观念的不断深入以及广大参农对于参地保护意识和人参产品意识的提高，具有良好经济价值与商品市场的人参生态种植，尤其是非林地人参的生态种植越来越受到更广泛的关注，所以非林地人参生态种植已经成为一种必然的发展趋势。

人参起源于大森林、喜冷凉、湿润气候环境，适宜在林下疏松肥沃的腐殖土中生长。迄今为止我国人参种植方式主要是采用伐林栽参，这样就造成了森林资源、生态环境被极大破坏。随着国家天然林保护工程的实施，人参产业可持续发展受到极大影响。自从2000年以来我国全面禁止天然林采伐，非林地栽参成为了人参种植的主流方式。然而，近几年来由于在农田种植土地上大量不合理使用化肥与农药，土壤正迅速板结和日渐贫瘠，不但污染了土地和水源，更重要的是还污染了农产品，同时造成一些农产品日益退化、农药残留超标、质量下降、色香味越来越差，严重影响人、禽、畜这些地球生物们的健康和繁衍。又因为我国非林地栽参历史较短，存在缺少优良品种、栽培技术不配套、病虫害严重、农药残留偏高、人参的产量和质量也不高等问题，制约了非林地栽参的发展。

非林地栽参对地理、气候、土壤、水源等环境条件要求非常严格。土壤是植物生长的环境基础，人参生长的基础营养物质几乎都来自于土壤，土壤的性质严重影响着人参的生长发育、产量与质量。所以肥料和土壤对农田地栽参更是重中之重。目前，农田地栽培人参主要施用肥料为复合肥、有机肥和微生物肥等。复合肥就是大量营养元素氮、磷、钾不同比例的复混肥料，施用化学肥料成为了提高为农作物单位面积产量的常用手段，人们对于化肥的依赖性日益增加。然而，化肥在有效地提高农作物产量的同时又对环境产生负面影响也不容忽视。由于长期的不合理的使用化肥，化肥利用率低就会造成土壤板结、水体富营养化等重要问题亟待解决。薛振东等以施用量猪粪、牛粪、鹿粪22.5 kg/m²，树叶肥15.0kg/m²作为有机肥改良农田土壤理化性状，其结果表明猪粪和树叶肥对土壤结构改良效果良好，可明显降低农田土壤容重、树叶肥优质参重量比率可达到79.88 %。任一猛等将发酵玉米秆、EM菌、硅藻土等改良基质深翻施入土壤中，极大优化了人参生长条件。经改良后的农田土壤所栽培的人参，其各项生理指标和有效成分与对照组(CK)之间差异显著，尤其对人参的地下部分影响显著；其根重最大比CK提高了20.0 %、根粗比CK增加了34.6 %、根长也增加了20.0 %以上、总皂苷含量比CK增加50.0 %，而且参根的整体形状较好。因有机肥多为动物粪便和秸秆发酵而成，它富含了大量多种有机酸、肽类等有益物质以及氮、磷、钾等丰富的营养元索，一方面是能为人参生长提供了全面营养，另一方面是肥效长可增加和更新土壤有机质、改善土壤的理化性质、促进微生物繁殖。但是动物的粪便如猪粪、牛粪、鹿粪等含有大量的抗生素，通过发酵技术方法制备有机肥是无法消除这些抗生素的，抗生素对人参生长发育、人参质量和品质有很大影响的。微生物肥多为微生物菌剂、复合微生物肥料。微生物肥料不仅可以有效改良土壤物理状态、土壤养分、土壤微生物等方面性能，而且能调节土壤酸碱度、增加有机质含量、促进了有效营养元素的释放、改善了土壤微生态环境，从而有利于人参的生长。然而，普通生物肥和复合微生物肥料用作人参栽培可以改良土壤、培肥地力、增强抗逆、促进生长发育、提高产量等效果。另外，农田栽参一般需要4-6年才可采收获，因而人参生长周期长需肥量较大，普通生物肥和复合微生物肥料之中人参所需要的大量元素氮、磷、钾含量不高，难以满足人参生长发育和高产的要求，其效果也很不理想。人参菌肥一般为单一类型的菌种只起到生物防治作用，其效果单一且有的情况效果也不显著。因此，目前非林地栽培人参所使用的复合肥、有机肥和微生物肥等肥料都存在一些严重不足之处，研发一种比较理想的适合非林地栽培人参的微生物菌肥是目前规范化生态种植人参的当务之急和迫切需要。

发明内容

本发明是为了解决现有非林地栽培人参主要通过使用化肥农药等手段来实现达到提高人参产量的目的，而提供一种复合微生物菌肥促进非林地土壤中大量营养元素氮、磷、钾再利用和人参根系有效吸收营养成分、高效能多抗生防的效果达到提高人参产量和质量的复合微生物菌肥制备方法。

一种高效能、增加肥效、微生物多抗生防的复合微生物菌肥制备方法，具体是按以下步骤完成的：

一、采集：①、采集时间：在秋季待人参收货期进行采集，此时人参根系营养成分处于较高水平状态；②、选择要求：选择长势健壮良好、无病害的4~6年生人参，苗高为39~47cm、静止时根系长度大于10cm、静止时根系宽度为1~3cm、且无病害的非林地栽参土壤的人参根际土种；③、采集要求：采集时去掉人参地表枯枝落叶层，连人参苗根系周围的土坨一并挖出、小心取出参根，将其根际土小心抖落后收集到无菌的50ml离心管内且密封好，同时把干冰放在该离心管外边以保证人参根际土种的含水率和化学成分不受影响以及不被病菌病虫害感染的良好环境；④、贮存：人参根系的土种在4℃下保存，备用。

二、筛选分离：①、筛选：精确称取1g五年长势健壮良好、无病害的人参根际土壤加入到100ml无菌水中，然后在温控回旋立式双层振荡器（生产厂家为上海智城分析仪器制造有限公司，产品型号为ZWY-11128，温控范围为+4~60℃，温度分辨率为0.1℃，转速范围为30~300r/min）里震荡，摇床条件设置为200r/min，充分震荡2h混匀后静置1h，将其制备成为悬浊液，然后梯度稀释至10^-3、10^-4、10^-5后，分别涂布于pH为6.8~7.0固氮菌分离培养基（每1000ml培养基中加入蔗糖5g、七水硫酸镁0.2g、磷酸二氢钾0.2g、氯化钠0.2g、碳酸钙5g、琼脂20g）、pH为7.2~7.4解磷菌分离培养基（每1000ml培养基中加入葡萄糖10g、硫酸铵0.5g、氯化钠0.5g、酵母粉 0.5g、氯化钾0.3g、硫酸镁0.3g、硫酸亚铁0.03g、硫酸锰0.5g、卵磷脂0.2g、碳酸钙1.0g、琼脂20g）、pH为7.0~7.4解钾菌分离培养基（每1000ml培养基中加入蔗糖3g、磷酸氢二钠2g、七水合硫酸镁0.5g、氯化铁0.005g、碳酸钙0.1g、琼脂20g）各稀释梯度设3个重复，置于温控回旋立式双层振荡器里温度设置为30℃的黑暗环境下培养48h直至单菌落出现，分别选择在固氮菌分离培养基、解磷菌分离培养基、解钾菌分离培养基上出现透明圈且菌落生长迅速、活性高、菌落较大的菌落，进行分离纯化3次以上至获得纯培养，4℃条件下保存，备用；②、菌株培养：先将一种菌液涂布至pH为7.0固体LB细菌培养基（每1000ml水中加入酵母提取物5g、胰蛋白胨10g、氯化钠10g、20g琼脂）上，再使用另一种菌液再平板上划线，然后在温控回旋立式双层振荡器里温度设置为30℃的黑暗环境下培养48h后得到两种菌株样品；③、种子液制备：使用接种环挑取固体培养基上的菌落，接种至pH为7.0液体LB培养基（每1000ml水中加入酵母提取物5g、胰蛋白胨10g、氯化钠10g）中，置于温控回旋立式双层振荡器里摇床条件设置为200r/min、温度设置为30℃的黑暗环境下培养48h即可得到种子液样品；

、复合微生物菌液制备：分别将1ml菌株种子液接种至100ml液体LB培养基中，置于温控回旋立式双层振荡器里摇床条件设置为200 r/min、温度设置为30℃的黑暗环境下培养48h即可得到复合微生物菌液样品；该复合微生物菌液样品经菌种分子鉴定，其结果是成功培养了4种抗逆性强、增殖能力强新的人参菌株，分别为枯草芽孢杆菌（Bacillus_subtilis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、海洋芽孢杆菌（Oceanobacillussp.）、芽孢杆菌属细菌（Bacillus sp），与此同时亲和性试验结果为这四种人参菌株中两两之间无拮抗作用且菌株种子液比例为1:1:1:1。

三、复合微生物菌肥制备：①、复合微生物菌液生长的碳源：配制pH为7.2~7.4发酵培养基125ml（蔗糖1%、蛋白胨2%、0.2%磷酸氢二钠、0.2%磷酸二氢钠）置于250ml锥形瓶中，利用高压蒸汽灭菌锅（生产厂家为上海博迅医疗生物仪器股份有限公司，型号为YXQ-LS-75S，压力为0.25MPa，功率为3500w，工作温度为135/138℃）灭菌温度设置为121℃、灭菌时间设置为20min；冷却后，接种3%复合微生物菌株培养液（枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、海洋芽孢杆菌、芽孢杆菌属细菌）有利于菌株的生长与繁殖，然后在温控回旋立式双层振荡器里摇床条件设置为200 r/min、温度设置为28℃的黑暗环境培养14h；14h后使用移液器精确吸取发酵液1ml~9ml无菌水中，梯度稀释至原发酵液浓度10~8倍液；精确吸取稀释后的菌液200μL均匀涂布于pH为7.0固体LB细菌培养基（每1000ml水中加入酵母提取物5g、胰蛋白胨10g、氯化钠10g、20g琼脂）上，然后在温控回旋立式双层振荡器里温度设置为28℃的黑暗环境培养48h后得到发酵液中的活菌数目可达13.67×10⁹CFU·ml^-1；②、复合微生物菌液生长的氮源：配制pH为7.2~7.4发酵培养基125ml（1%蔗糖、2%牛肉膏、0.2%磷酸氢二钠、0.2%磷酸二氢钠）置于250ml锥形瓶中，利用高压蒸汽灭菌锅灭菌温度设置为121℃、灭菌时间设置为20min；冷却后，接种3%复合微生物菌株培养液（枯草芽孢杆菌、芽孢杆菌属细菌、地衣芽孢杆菌、海洋芽孢杆菌）有利于菌株的生长与繁殖，然后在温控回旋立式双层振荡器里摇床条件设置为200 r/min、温度设置为28℃的黑暗环境培养14h；14h后使用移液器精确吸取发酵液1ml~9ml无菌水中，梯度稀释至原发酵液浓度10~8倍液；精确吸取稀释后的菌液200μL均匀涂布于pH为7.0固体LB细菌培养基（每1000ml水中加入酵母提取物5g、胰蛋白胨10g、氯化钠10g、20g琼脂）上，最后在温控回旋立式双层振荡器里温度设置为28℃的黑暗环境培养48h后得到发酵液中的活菌数目可达14.27×10⁹CFU·ml^-1；③、复合微生物菌肥配制：以复合微生物菌液生长条件为碳源0.5%、氮源1.5%、发酵温度29±1℃、发酵液装瓶量125ml、初始接种量为2±1%，该条件下复合微生物菌肥中活菌数可达16.67×109 CFU·ml^-1；以重量份数进行配制复合微生物菌肥100份，其中枯草芽孢杆菌25份、地衣芽孢杆菌25份、海洋芽孢杆菌25份、芽孢杆菌属细菌25份所配制复合微生物菌肥中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、海洋芽孢杆菌、芽孢杆菌属细菌重量份数比为1:1:1:1。

本发明的优点

一、本发明是从长势良好无病害的非林地栽参土壤的人参根际土种通过筛选分离技术发现获得四种不同的互相之间无拮抗的菌株（并且这些菌株之间还能相互促进生长）制备出高效能的生态种植人参的复合微生物菌肥；

二、本发明的复合微生物菌肥富含有大量的解钾菌、解磷菌、固氮菌等菌株，这些菌株具有缓释性和持效性可高效地持续地供给植物苗木生长，提高了土壤中大量营养元素氮、磷、钾的利用率；

三、本发明的复合微生物菌肥可以有效地丰富人参根际微生物的群落，对人参黑斑病原菌、人参锈腐病菌、人参根腐病菌、人参灰霉病菌、黄瓜灰霉病菌、越桔灰霉病菌以及燕麦镰刀菌等引起的草莓叶斑病均有良好的抑制效果；

四、本发明的复合微生物菌肥可以很好改善土壤结构属性、防治人参病虫害的发生、有效促进人参对营养成分的吸收等性能，有效地解决了土壤结构与微生物生态环境的关系，显著地促进了人参生长，从而提高了人参产量和质量；

本发明的复合微生物菌肥具有防治人参病虫害发生的同时且能有效促进人参对大量营养成分的吸收等高效能，它具有操作简单、成本低廉、见效显著、环境友好等优点。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式是一种高效能、增加肥效、微生物多抗生防人参复合微生物菌肥制备方法，今天是按以下步骤完成的：

一、采集：①、采集时间：在秋季待人参收货期进行采集，此时人参根系营养成分处于较高水平状态；②、选择要求：选择长势健壮良好、无病害的4~6年生人参，苗高为39~47cm、静止时根系长度大于10cm、静止时根系宽度为1~3cm、且无病害的非林地栽参土壤的人参根际土种；③、采集要求：采集时去掉人参地表枯枝落叶层，连人参苗根系周围的土坨一并挖出、小心取出参根，将其根际土小心抖落后收集到无菌的50ml离心管内且密封好，同时把干冰放在离心管外边以保证人参根际土种的含水率和化学成分不受影响以及不被病菌病虫害感染的良好环境；④、贮存：人参根系的土种在4℃冰箱保存，备用。

三、复合微生物菌肥制备：①、复合微生物菌液生长的碳源：配制pH为7.2~7.4发酵培养基125ml（蔗糖1%、蛋白胨2%、0.2%磷酸氢二钠、0.2%磷酸二氢钠）置于250ml锥形瓶中，利用高压蒸汽灭菌锅（生产厂家为上海博迅医疗生物仪器股份有限公司，型号为YXQ-LS-75S，压力为0.25MPa，功率为3500w，工作温度为135/138℃）灭菌温度设置为 121℃、灭菌时间设置为20min；冷却后，接种3%复合微生物菌株培养液（枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、海洋芽孢杆菌、芽孢杆菌属细菌）有利于菌株的生长与繁殖，然后在温控回旋立式双层振荡器里摇床条件设置为200 r/min、温度设置为28℃的黑暗环境培养14h；14h后使用移液器精确吸取发酵液1ml~9ml无菌水中，梯度稀释至原发酵液浓度10~8倍液；精确吸取稀释后的菌液200μL均匀涂布于pH为7.0固体LB细菌培养基（每1000ml水中加入酵母提取物5g、胰蛋白胨10g、氯化钠10g、20g琼脂）上，然后在温控回旋立式双层振荡器里温度设置为28℃的黑暗环境培养48h后得到发酵液中的活菌数目可达13.67×10⁹CFU·ml^-1；②、复合微生物菌液生长的氮源：配制pH为7.2~7.4发酵培养基125ml（1%蔗糖、2%牛肉膏、0.2%磷酸氢二钠、0.2%磷酸二氢钠）置于250ml锥形瓶中，利用高压蒸汽灭菌锅灭菌温度设置为121℃、灭菌时间设置为20min；冷却后，接种3%复合微生物菌株培养液（枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、海洋芽孢杆菌、芽孢杆菌属细菌）有利于菌株的生长与繁殖，然后在温控回旋立式双层振荡器里摇床条件设置为200 r/min、温度设置为28℃的黑暗环境培养14h；14h后使用移液器精确吸取发酵液1ml~9ml无菌水中，梯度稀释至原发酵液浓度10~8倍液；精确吸取稀释后的菌液200μL均匀涂布于pH为7.0固体LB细菌培养基（每1000ml水中加入酵母提取物5g、胰蛋白胨10g、氯化钠10g、20g琼脂）上，最后在温控回旋立式双层振荡器里温度设置为28℃的黑暗环境培养48h后得到发酵液中的活菌数目可达14.27×10⁹CFU·ml^-1；③、复合微生物菌肥配制：以复合微生物菌液生长条件为碳源0.5%、氮源1.5%、发酵温度29±1℃、发酵液装瓶量125ml、初始接种量为2±1%，该条件下复合微生物菌肥中活菌数可达16.67×109 CFU·ml^-1；以重量份数进行配制复合微生物菌肥100份，其中枯草芽孢杆菌25份、地衣芽孢杆菌25份、海洋芽孢杆菌25份、芽孢杆菌属细菌25份；所配制复合微生物菌肥中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、海洋芽孢杆菌、芽孢杆菌属细菌重量份数比为1:1:1:1。

本实施方式步骤一中所述的采集时间一般每年的9月至10月25日之间；

本实施方式对非林地栽参的人参根际土壤土种的采集、运输、储运、筛选分离、菌株种子液制备、复合微生物菌液制备等一系列环节提出了一定的要求，否则常会出现菌株种子液制备效果不明显、菌株纤弱甚至整株死亡等的问题，在菌株筛选分离制备方法上也有一定的要求；

本实施方式制备复合微生物菌液时对固氮菌分离培养液、解磷菌分离培养液、解钾菌分离培养液、LB细菌培养液的选择也有一定要求，否则很难培养出抗逆性强、增殖能力强的新菌种；

本实施方式制备复合微生物菌肥时对复合微生物菌液生长的碳源、氮源、温度、菌株初始接种量及发酵液装瓶量等生长条件都有一定的要求，否则不利于扩繁出抗逆性强、增殖能力强的复合微生物菌肥液，而制备出的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、海洋芽孢杆菌、芽孢杆菌属细菌可快速有效地增强人参苗对病虫害的生物防治抵抗能力及同时活化了大量营养成分氮、磷、钾，人参根系有效吸收氮、磷、钾的营养成分从而实现了提高人参产量和质量；

本实施方式复合微生物菌肥中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、海洋芽孢杆菌、芽孢杆菌属细菌具有缓释效果，同时使人参苗木在生长过程中不至于出现体内养分供给不足的问题，使得整体苗木生长及质量得到充分保障；

本实施方式采用少量多次的施肥方式，可以使得人参苗木逐步吸收充足的养分，对于增加苗木的强壮性大有脾益，其优点是操作简单、成本低廉、见效显著；

本实施方式能大幅度提升人参地下部分鲜重较对照组增产101%，增产效果明显，同时施用菌肥后人参根长、根粗均有不同程度的增加且高剂量组对比对照组在5%水平上差异显著。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤三③、复合微生物菌肥配制是在碳源0.5%、氮源1.5%、发酵温度29±1℃、发酵液装瓶量125ml、初始接种量为2±1%的条件下，以重量份数进行配制复合微生物菌肥65份，其中枯草芽孢杆菌25份、地衣芽孢杆菌20份、海洋芽孢杆菌15份、芽孢杆菌属细菌5份；所配制复合微生物菌肥中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、海洋芽孢杆菌、芽孢杆菌属细菌重量份数比为5:4:3:1；其他与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤三③、复合微生物菌肥配制是在碳源0.5%、氮源1.5%、发酵温度29±1℃、发酵液装瓶量125ml、初始接种量为2±1%的条件下，以重量份数进行配制复合微生物菌肥70份，其中枯草芽孢杆菌25份、地衣芽孢杆菌20份、海洋芽孢杆菌15份、芽孢杆菌属细菌10份；所配制复合微生物菌肥中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、海洋芽孢杆菌、芽孢杆菌属细菌重量份数比为5:4:3:2；其他与具体实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤三③、复合微生物菌肥配制是在碳源0.5%、氮源1.5%、发酵温度29±1℃、发酵液装瓶量125ml、初始接种量为2±1%的条件下，以重量份数进行配制复合微生物菌肥75份，其中枯草芽孢杆菌25份、地衣芽孢杆菌20份、海洋芽孢杆菌15份、芽孢杆菌属细菌15份；所配制复合微生物菌肥中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、海洋芽孢杆菌、芽孢杆菌属细菌重量份数比为5:4:3:3；其他与具体实施方式一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤三③、复合微生物菌肥配制是在碳源0.5%、氮源1.5%、发酵温度29±1℃、发酵液装瓶量125ml、初始接种量为2±1%的条件下，以重量份数进行配制复合微生物菌肥90份，其中枯草芽孢杆菌25份、地衣芽孢杆菌25份、海洋芽孢杆菌20份、芽孢杆菌属细菌20份；所配制复合微生物菌肥中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、海洋芽孢杆菌、芽孢杆菌属细菌重量份数比为5:5:4:4；其他与具体实施方式一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤三③、复合微生物菌肥配制是在碳源0.5%、氮源1.5%、发酵温度29±1℃、发酵液装瓶量125ml、初始接种量为2±1%的条件下，以重量份数进行配制复合微生物菌肥110份，其中枯草芽孢杆菌30份、地衣芽孢杆菌30份、海洋芽孢杆菌25份、芽孢杆菌属细菌25份；所配制复合微生物菌肥中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、海洋芽孢杆菌、芽孢杆菌属细菌重量份数比为6:6:5:5；其他与具体实施方式一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤三③、复合微生物菌肥配制是在碳源0.5%、氮源1.5%、发酵温度29±1℃、发酵液装瓶量125ml、初始接种量为2±1%的条件下，以重量份数进行配制复合微生物菌肥160份，其中枯草芽孢杆菌50份、地衣芽孢杆菌50份、海洋芽孢杆菌30份、芽孢杆菌属细菌30份；所配制复合微生物菌肥中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、海洋芽孢杆菌、芽孢杆菌属细菌重量份数比为5:5:3:3；其他与具体实施方式一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤三③、复合微生物菌肥配制是在碳源0.5%、氮源1.5%、发酵温度29±1℃、发酵液装瓶量125ml、初始接种量为2±1%的条件下，以重量份数进行配制复合微生物菌肥250份，其中枯草芽孢杆菌75份、地衣芽孢杆菌75份、海洋芽孢杆菌50份、芽孢杆菌属细菌50份；所配制复合微生物菌肥中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、海洋芽孢杆菌、芽孢杆菌属细菌重量份数比为3:3:2:2；其他与具体实施方式一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤三③、复合微生物菌肥配制是在碳源0.5%、氮源1.5%、发酵温度29±1℃、发酵液装瓶量125ml、初始接种量为2±1%的条件下，以重量份数进行配制复合微生物菌肥350份，其中枯草芽孢杆菌100份、地衣芽孢杆菌100份、海洋芽孢杆菌75份、芽孢杆菌属细菌75份；所配制复合微生物菌肥中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、海洋芽孢杆菌、芽孢杆菌属细菌重量份数比为4:4:3:3；其他与具体实施方式一相同。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

采用下述试验验证本发明效果：

试验一种高效能、增加肥效、微生物多抗生防人参复合微生物菌肥制备方法，今天是按以下步骤完成的：

试验一：复合微生物菌肥具有生防效果采用牛津杯法试验：①、将1g菌肥溶于100mL无菌水中，于温控回旋立式双层振荡器里摇床条件设置为200r/min，充分震荡1h后，然后4000rpm离心后取上清液即为复合微生物菌肥液；②、将20ml培养基均匀的倒进培养皿中，冷却之后，将病原菌菌饼置于培养基中心位置，距离菌饼中心2cm处分别放置两个牛津杯，牛津杯中加入100μL复合微生物菌肥液，在温控回旋立式双层振荡器里温度设置为25℃全黑暗环境培养5d之后；③、观察牛津杯发现结果是该复合微生物菌肥对7种病原真菌（人参黑斑病原菌、人参锈腐病菌、人参根腐病菌、人参灰霉病菌、黄瓜灰霉病菌、越桔灰霉病菌以及燕麦镰刀菌，这7种病原真菌都是由吉林农业大学作物有害生物综合治理实验室提供）生长均有抑制效果。

试验二：复合微生物菌肥肥效试验采取盆栽试验方法：①、花盆规格：花盆直径为20cm、花盆高度为50cm；②、土壤采集：土壤使用山坯土，每个花盆装土壤为3kg；③、人参种栽要求：供试作物选择大小一致的二年生人参，苗高为7cm、根径为1cm、根长为5cm、根重为1.6g；④、盆栽要求：每盆种植三棵健康的二年生人参种栽；

、复合微生物菌肥液制备：将10g菌肥溶于1000mL无菌水中，于温控回旋立式双层振荡器里摇床条件设置为200r/min，充分震荡1h后，然后4000rpm离心后取上清液即为复合微生物菌肥液；

、复合微生物菌肥施肥要求：复合微生物菌肥试验设置3个复合微生物菌肥浓度梯度和1个对照组进行了四种处理方式（A为对照组，B、C、D分别为试验组），每个处理重复20次；复合微生物菌肥施肥方法尽量采用“少量多次”的原则，选择晴朗无雨傍晚均匀喷施在人参苗木表面，每两次施肥间的间隔时间为一周，施肥持续5个月后结束，A、B、C、D组肥料用量分别为0、60、80、100g/亩；

、样品采集与处理：生长过程中观察四组不同处理盆栽试验的人参地上部生长情况；在人参成熟期时连根取出，洗净泥沙后，分别测量四种不同处理组的茎粗、茎长、地上部分重量、根粗、根长、根重等指标，并取平均值；将人参地上部分与地下部分置于鼓风干燥箱中50℃恒温烘干至恒重，再次测量人参地上部重量及地下部重量；

、人参盆栽试验结果：施用本发明的复合微生物菌肥可以有效提高人参产量，三个菌肥浓度梯度均对人参有一定促生作用；就地上部生长情况来看，在菌肥使用量仅为60g/亩时，人参地上部分生长情况明显优于对照组，且三个试验组均叶片叶色浓绿、茎秆粗壮长势良好；施用菌肥后茎长较对照组明显增加，高剂量组在5%水平上与中低剂量相比有显著性差异；施用菌肥后茎粗明显增加，且在5%水平上与对照组相比有显著性差异，表明施用该种菌肥可以有效增加人参茎粗；随菌肥使用量增加，人参地上部重量明显提升，且与对照组在5%水平上有显著性差异；地下部生长情况，施用菌肥后无人参锈腐、根腐等常见病害发生，随着施菌肥量的增加增产效果逐渐提高，施药高剂量对人参地下部增产效果与中低剂量相比，在5%水平上差异性显著，在1%水平上呈极显著性差异。在施用菌肥浓度为100g/亩，地下部分鲜重较对照组增产101%，增产效果明显。同时施用菌肥后人参根长、根粗均有不同程度的增加且高剂量组对比对照组在5%水平上差异显著。

表1为肥效测试结果：

注：不同处理之间差异显著性用小写字母表示（p＜0.05）

Claims

1.一种以长势健壮良好、无病害的非林地栽参的人参根系土种为原料制备出高效能、增加肥效、微生物多抗生防人参复合微生物菌肥，非常适宜非林地生态种植人参的复合微生物菌肥，是一种微生物多抗生防菌肥制备技术方法；其特征在于为了解决现有非林地栽培人参主要通过使用化肥农药等手段来实现达到提高人参产量的目的，而提供一种复合微生物菌肥具有防治人参病虫害发生的同时且能有效促进人参对大量营养成分的吸收等高效能，它的优点是具有缓释性和持效性可高效地持续地供给植物苗木生长，提高了土壤中大量营养元素氮、磷、钾的利用率，进而促进人参等药用苗木的健康高质量快速生长的复合微生物菌肥制备方法是按以下步骤完成的：

一、采集：①、采集时间：在秋季待人参收货期进行采集，此时人参根系营养成分处于较高水平状态；②、选择要求：选择长势健壮良好、无病害的4~6年生人参，苗高为39~47cm、静止时根系长度大于10cm、静止时根系宽度为1~3cm、且无病害的非林地栽参土壤的人参根际土种；③、采集要求：采集时去掉人参地表枯枝落叶层，连人参苗根系周围的土坨一并挖出、小心取出参根，将其根际土小心抖落后收集到无菌的50ml离心管内且密封好，同时把干冰放在该离心管外边以保证人参根际土种的含水率和化学成分不受影响以及不被病菌病虫害感染的良好环境；④、贮存：人参根系的土种在4℃下保存，备用；

二、筛选分离：①、筛选：精确称取1g五年长势健壮良好、无病害的人参根际土壤加入到100ml无菌水中，然后在温控回旋立式双层振荡器（生产厂家为上海智城分析仪器制造有限公司，产品型号为ZWY-11128，温控范围为+4~60℃，温度分辨率为0.1℃，转速范围为30~300r/min）里震荡，摇床条件设置为200r/min，充分震荡2h混匀后静置1h，将其制备成为悬浊液，然后梯度稀释至10-3、10-4、10-5后，分别涂布于pH为6.8~7.0固氮菌分离培养基（每1000ml培养基中加入蔗糖5g、七水硫酸镁0.2g、磷酸二氢钾0.2g、氯化钠0.2g、碳酸钙5g、琼脂20g）、pH为7.2~7.4解磷菌分离培养基（每1000ml培养基中加入葡萄糖10g、硫酸铵0.5g、氯化钠0.5g、酵母粉 0.5g、氯化钾0.3g、硫酸镁0.3g、硫酸亚铁0.03g、硫酸锰0.5g、卵磷脂0.2g、碳酸钙1.0g、琼脂20g）、pH为7.0~7.4解钾菌分离培养基（每1000ml培养基中加入蔗糖3g、磷酸氢二钠2g、七水合硫酸镁0.5g、氯化铁0.005g、碳酸钙0.1g、琼脂20g）各稀释梯度设3个重复，置于温控回旋立式双层振荡器里温度设置为30℃的黑暗环境下培养48h直至单菌落出现，分别选择在固氮菌分离培养基、解磷菌分离培养基、解钾菌分离培养基上出现透明圈且菌落生长迅速、活性高、菌落较大的菌落，进行分离纯化3次以上至获得纯培养，4℃条件下保存，备用；②、菌株培养：先将一种菌液涂布至pH为7.0固体LB细菌培养基（每1000ml水中加入酵母提取物5g、胰蛋白胨10g、氯化钠10g、20g琼脂）上，再使用另一种菌液再平板上划线，然后在温控回旋立式双层振荡器里温度设置为30℃的黑暗环境下培养48h后得到两种菌株样品；③、种子液制备：使用接种环挑取固体培养基上的菌落，接种至pH为7.0液体LB培养基（每1000ml水中加入酵母提取物5g、胰蛋白胨10g、氯化钠10g）中，置于温控回旋立式双层振荡器里摇床条件设置为200r/min、温度设置为30℃的黑暗环境下培养48h即可得到种子液样品；

、复合微生物菌液制备：分别将1ml菌株种子液接种至100ml液体LB培养基中，置于温控回旋立式双层振荡器里摇床条件设置为200 r/min、温度设置为30℃的黑暗环境下培养48h即可得到复合微生物菌液样品；该复合微生物菌液样品经菌种分子鉴定，其结果是成功培养了4种抗逆性强、增殖能力强新的人参菌株，分别为枯草芽孢杆菌（Bacillus_subtilis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、海洋芽孢杆菌（Oceanobacillussp.）、芽孢杆菌属细菌（Bacillus sp），与此同时亲和性试验结果为这四种人参菌株中两两之间无拮抗作用且菌株种子液比例为1:1:1:1；

三、复合微生物菌肥制备：①、复合微生物菌液生长的碳源：配制pH为7.2~7.4发酵培养基125ml（蔗糖1%、蛋白胨2%、0.2%磷酸氢二钠、0.2%磷酸二氢钠）置于250ml锥形瓶中，利用高压蒸汽灭菌锅（生产厂家为上海博迅医疗生物仪器股份有限公司，型号为YXQ-LS-75S，压力为0.25MPa，功率为3500w，工作温度为135/138℃）灭菌温度设置为 121℃、灭菌时间设置为20min；冷却后，接种3%复合微生物菌株培养液（枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、海洋芽孢杆菌、芽孢杆菌属细菌）有利于菌株的生长与繁殖，然后在温控回旋立式双层振荡器里摇床条件设置为200 r/min、温度设置为28℃的黑暗环境培养14h；14h后使用移液器精确吸取发酵液1ml~9ml无菌水中，梯度稀释至原发酵液浓度10~8倍液；精确吸取稀释后的菌液200μL均匀涂布于pH为7.0固体LB细菌培养基（每1000ml水中加入酵母提取物5g、胰蛋白胨10g、氯化钠10g、20g琼脂）上，然后在温控回旋立式双层振荡器里温度设置为28℃的黑暗环境培养48h后得到发酵液中的活菌数目可达13.67×109 CFU·ml-1；②、复合微生物菌液生长的氮源：配制pH为7.2~7.4发酵培养基125ml（1%蔗糖、2%牛肉膏、0.2%磷酸氢二钠、0.2%磷酸二氢钠）置于250ml锥形瓶中，利用高压蒸汽灭菌锅灭菌温度设置为121℃、灭菌时间设置为20min；冷却后，接种3%复合微生物菌株培养液（枯草芽孢杆菌、芽孢杆菌属细菌、地衣芽孢杆菌、海洋芽孢杆菌）有利于菌株的生长与繁殖，然后在温控回旋立式双层振荡器里摇床条件设置为200 r/min、温度设置为28℃的黑暗环境培养14h；14h后使用移液器精确吸取发酵液1ml~9ml无菌水中，梯度稀释至原发酵液浓度10~8倍液；精确吸取稀释后的菌液200μL均匀涂布于pH为7.0固体LB细菌培养基（每1000ml水中加入酵母提取物5g、胰蛋白胨10g、氯化钠10g、20g琼脂）上，最后在温控回旋立式双层振荡器里温度设置为28℃的黑暗环境培养48h后得到发酵液中的活菌数目可达14.27×109 CFU·ml-1；③、复合微生物菌肥配制：以复合微生物菌液生长条件为碳源0.5%、氮源1.5%、发酵温度29±1℃、发酵液装瓶量125ml、初始接种量为2±1%，该条件下复合微生物菌肥中活菌数可达16.67×109 CFU·ml^-1；以重量份数进行配制复合微生物菌肥100份，其中枯草芽孢杆菌25份、地衣芽孢杆菌25份、海洋芽孢杆菌25份、芽孢杆菌属细菌25份；所配制复合微生物菌肥中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、海洋芽孢杆菌、芽孢杆菌属细菌重量份数比为1:1:1:1。

2.本发明的复合微生物菌肥中4种人参菌株都具有抗逆性强、增殖能力强的，所述复合微生物菌种包括为枯草芽孢杆菌（Bacillus_subtilis）、地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）、海洋芽孢杆菌（Oceanobacillus sp.）、芽孢杆菌属细菌（Bacillus sp）。

3.本发明的复合微生物菌肥中4种不同的互相之间无拮抗的菌株且这些菌株之间还能相互促进生长因而具有协同作用；该复合微生物菌肥富中活菌数可达16.67×109 CFU·ml^-1。

4.本发明的复合微生物菌肥对7种病原真菌（人参黑斑病原菌、人参锈腐病菌、人参根腐病菌、人参灰霉病菌、黄瓜灰霉病菌、越桔灰霉病菌及燕麦镰刀菌等生长均有较强的抑制效果。

5.施用本复合微生物菌肥可以有效增加人参茎粗；随菌肥使用量增加，人参地上部重量明显提升，且与对照组在5%水平上有显著性差异；在施用菌肥浓度为100g/亩，地下部分鲜重较对照组增产101%，增产效果明显；同时施用菌肥后人参根长、根粗均有不同程度的增加且高剂量组对比对照组在5%水平上差异显著；复合微生物菌肥对人参的地上部分叶片浓绿、茎秆粗壮和人参地下根茎的长势及产量都有显著提高效果。

6.根据权利要求1所述的一种以长势健壮良好、无病害的非林地栽参的人参根系土种为原料制备出高效能、增加肥效、微生物多抗生防人参复合微生物菌肥，其特征在于步骤三中③所述的复合微生物菌肥配制处理是按以下步骤完成的：复合微生物菌肥配制是在碳源0.5%、氮源1.5%、发酵温度29±1℃、发酵液装瓶量125ml、初始接种量为2±1%的条件下，以重量份数进行配制复合微生物菌肥65份，其中枯草芽孢杆菌25份、地衣芽孢杆菌20份、海洋芽孢杆菌15份、芽孢杆菌属细菌5份；所配制复合微生物菌肥中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、海洋芽孢杆菌、芽孢杆菌属细菌重量份数比为5:4:3:1。

7.根据权利要求1所述的一种以长势健壮良好、无病害的非林地栽参的人参根系土种为原料制备出高效能、增加肥效、微生物多抗生防人参复合微生物菌肥，其特征在于步骤三中③所述的复合微生物菌肥配制处理是按以下步骤完成的：复合微生物菌肥配制是在碳源0.5%、氮源1.5%、发酵温度29±1℃、发酵液装瓶量125ml、初始接种量为2±1%的条件下，以重量份数进行配制复合微生物菌肥70份，其中枯草芽孢杆菌25份、地衣芽孢杆菌20份、海洋芽孢杆菌15份、芽孢杆菌属细菌10份；所配制复合微生物菌肥中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、海洋芽孢杆菌、芽孢杆菌属细菌重量份数比为5:4:3:2。

8.根据权利要求1所述的一种以长势健壮良好、无病害的非林地栽参的人参根系土种为原料制备出高效能、增加肥效、微生物多抗生防人参复合微生物菌肥，其特征在于步骤三中③所述的复合微生物菌肥配制处理是按以下步骤完成的：复合微生物菌肥配制是在碳源0.5%、氮源1.5%、发酵温度29±1℃、发酵液装瓶量125ml、初始接种量为2±1%的条件下，以重量份数进行配制复合微生物菌肥75份，其中枯草芽孢杆菌25份、地衣芽孢杆菌20份、海洋芽孢杆菌15份、芽孢杆菌属细菌15份；所配制复合微生物菌肥中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、海洋芽孢杆菌、芽孢杆菌属细菌重量份数比为5:4:3:3。

9.根据权利要求1所述的一种以长势健壮良好、无病害的非林地栽参的人参根系土种为原料制备出高效能、增加肥效、微生物多抗生防人参复合微生物菌肥，其特征在于步骤三中③所述的复合微生物菌肥配制处理是按以下步骤完成的：复合微生物菌肥配制是在碳源0.5%、氮源1.5%、发酵温度29±1℃、发酵液装瓶量125ml、初始接种量为2±1%的条件下，以重量份数进行配制复合微生物菌肥90份，其中枯草芽孢杆菌25份、地衣芽孢杆菌25份、海洋芽孢杆菌20份、芽孢杆菌属细菌20份；所配制复合微生物菌肥中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、海洋芽孢杆菌、芽孢杆菌属细菌重量份数比为5:5:4:4。

10.根据权利要求1所述的一种以长势健壮良好、无病害的非林地栽参的人参根系土种为原料制备出高效能、增加肥效、微生物多抗生防人参复合微生物菌肥，其特征在于步骤三中③所述的复合微生物菌肥配制处理是按以下步骤完成的：复合微生物菌肥配制是在碳源0.5%、氮源1.5%、发酵温度29±1℃、发酵液装瓶量125ml、初始接种量为2±1%的条件下，以重量份数进行配制复合微生物菌肥110份，其中枯草芽孢杆菌30份、地衣芽孢杆菌30份、海洋芽孢杆菌25份、芽孢杆菌属细菌25份；所配制复合微生物菌肥中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、海洋芽孢杆菌、芽孢杆菌属细菌重量份数比为6:6:5:5。

11.根据权利要求1所述的一种以长势健壮良好、无病害的非林地栽参的人参根系土种为原料制备出高效能、增加肥效、微生物多抗生防人参复合微生物菌肥，其特征在于步骤三中③所述的复合微生物菌肥配制处理是按以下步骤完成的：复合微生物菌肥配制是在碳源0.5%、氮源1.5%、发酵温度29±1℃、发酵液装瓶量125ml、初始接种量为2±1%的条件下，以重量份数进行配制复合微生物菌肥160份，其中枯草芽孢杆菌50份、地衣芽孢杆菌50份、海洋芽孢杆菌30份、芽孢杆菌属细菌30份；所配制复合微生物菌肥中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、海洋芽孢杆菌、芽孢杆菌属细菌重量份数比为5:5:3:3。

12.根据权利要求1所述的一种以长势健壮良好、无病害的非林地栽参的人参根系土种为原料制备出高效能、增加肥效、微生物多抗生防人参复合微生物菌肥，其特征在于步骤三中③所述的复合微生物菌肥配制处理是按以下步骤完成的：复合微生物菌肥配制是在碳源0.5%、氮源1.5%、发酵温度29±1℃、发酵液装瓶量125ml、初始接种量为2±1%的条件下，以重量份数进行配制复合微生物菌肥250份，其中枯草芽孢杆菌75份、地衣芽孢杆菌75份、海洋芽孢杆菌50份、芽孢杆菌属细菌50份；所配制复合微生物菌肥中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、海洋芽孢杆菌、芽孢杆菌属细菌重量份数比为3:3:2:2。

13.根据权利要求1所述的一种以长势健壮良好、无病害的非林地栽参的人参根系土种为原料制备出高效能、增加肥效、微生物多抗生防人参复合微生物菌肥，其特征在于步骤三中③所述的复合微生物菌肥配制处理是按以下步骤完成的：复合微生物菌肥配制是在碳源0.5%、氮源1.5%、发酵温度29±1℃、发酵液装瓶量125ml、初始接种量为2±1%的条件下，以重量份数进行配制复合微生物菌肥350份，其中枯草芽孢杆菌100份、地衣芽孢杆菌100份、海洋芽孢杆菌75份、芽孢杆菌属细菌75份；所配制复合微生物菌肥中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、海洋芽孢杆菌、芽孢杆菌属细菌重量份数比为4:4:3:3。