CN105567615A - 一种花生慢生根瘤菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属应用微生物技术领域，具体的说是一种花生慢生根瘤菌YIC61059及其应用。慢生根瘤菌(Bradyrhizobium？sp.)YIC61059，该菌株已于2015年10月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏编号为CGMCC？No.11507。本发明菌株生长速度快，共生固氮能力强，在温室和大田环境下能够显著促进花生的生长，提高花生的产量；可用于制作高效根瘤菌剂，减少化肥使用造成的环境污染，实现增产、节氮、生态的协调一致，因此本发明在花生种植业上有广阔的应用前景。

Description

一种花生慢生根瘤菌及其应用

技术领域

本发明属应用微生物技术领域，具体的说是一种花生慢生根瘤菌YIC61059及其应用。

背景技术

根瘤菌是一类无芽孢、能运动、好氧、化能有机营养型的杆状革兰氏阴性细菌，大小一般为0.5-0.9μm×1.2-3.0μm，鞭毛周生、端生或侧生。它广泛分布于土壤中，可以在土壤中以营养体形式生存，也可以侵染豆科植物根部或茎部形成根瘤或茎瘤，以类菌体形式固定空气中的氮气形成氨，供豆科植物吸收利用，形成共生固氮体系。在农业生产中，合理利用这一体系可以促进增产，减少施用化肥的对环境造成的污染，有利于农业和生态环境的发展。

花生，又名落花生、万寿果、长生果等，属蔷薇目，豆科一年生草本植物。花生具有很高的经济价值，其果实含丰富的脂肪和蛋白质，可直接食用，油一部分可以用于食用，另外还可以供给工业和医药，油粕既可以用作饲料也可肥田，茎叶可以当作燃料、沤制堆肥或者充当动物饲料。通过选育高效花生根瘤菌和施用根瘤菌剂，可以提高花生产量和品质，增加农民经济收入，减少化肥污染，维持生态平衡和人类可持续发展。

发明内容

本发明的目的在于提供一种花生慢生根瘤菌YIC61059及其应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种花生慢生根瘤菌，慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumsp.)YIC61059，该菌株已于2015年10月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏编号为CGMCCNo.11507。

所述花生慢生根瘤菌从山东省莱西市花生研究所实验基地花生新鲜根瘤中分离筛选出，通过对其持家基因recA基因序列与GenBank中的数据对比分析发现其与BradyrhizobiumliaoningenseUSDA3622^T相似性最高，为98.3％。从而将分离出来的根瘤菌YIC61059命名为Bradyrhizobiumsp.YIC61059。

该菌的菌落为圆形，菌落湿润，中间隆起，边缘整齐，乳白色半透明，不产生芽孢，能运动，胞外多糖含量较高，经革兰氏染色结果为阴性。

根瘤菌的应用，所述根瘤菌在促进花生生长中的应用。

所述根瘤菌在促进花生种植中作为产量增产剂的应用。其，根瘤菌能提高花生根瘤的固氮酶活性。

具体，将所述慢生根瘤菌于TY液体培养基中28℃，180rpm摇床震荡培养2-3天，待菌液OD600≥1.0；将所得菌液直接喷洒在花生种子表面，而后将喷洒有菌液的花生种子直接播种，即可使花生产量得以增长。

所述TY液体培养基(胰蛋白胨酵母提取物培养基)，配方为：胰蛋白胨5g/L,酵母提取物3g/L，无水CaCl₂0.66g/L,加水定容至1000mL。

本发明所具有的优点：

本发明的高效固氮花生根瘤菌YIC61059具有较强的共生固氮能力，能够显著促进花生根系生长，增强其光合作用，提高植株重量，增加果实产量，进而提高了花生的产量和品质。实验结果表明，接种本发明菌株的花生，与不接种任何菌的花生相比，单株花生的地上部分鲜重、干重分别增加了18.98％和24.48％。本发明根瘤菌对花生的生长安全，能够与花生建立有效的共生固氮体系，充分体现了生物固氮作用在生产实践中的应用，减少了化肥的施用带来的土壤和环境污染。本发明根瘤菌的推广和应用对保护生态环境和推动绿色农业的发展具有重要的实践价值。

附图说明

图1为本发明实施例设计的田间小区实验设计图。

图2为本发明实施例提供的接种菌株YIC61059种植花生的田间小区试验中促进花生主根和侧根长度效果。

图3为本发明实施例提供的接种菌株YIC61059种植花生的田间小区试验中促进花生单株果实鲜重和干重效果。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

本发明菌株生长速度快，共生固氮能力强，在温室和大田环境下能够显著促进花生的生长，提高花生的产量；可用于制作高效根瘤菌剂，减少化肥使用造成的环境污染，实现增产、节氮、生态的协调一致，因此本发明在花生种植业上有广阔的应用前景。

1.花生根瘤菌的分离、纯化和保存。

从山东省莱西市花生研究所花生育种实验基地选取植株健壮的花生，将大且饱满的根瘤摘下洗净，用95％乙醇浸泡30s以消除表面张力，对根瘤表面进行消毒后捣碎，将浸出液涂布于装有YMA固体培养基(甘露醇10g/L，酵母提取物3g/L，K₂HPO₄0.25g/L，KH₂PO₄0.25g/L，MgSO₄0.2g/L，CaCO₃3g/L，NaCl0.1g/L)的平板中，28℃倒置培养5-7天后挑取有典型根瘤菌菌落形态(圆形、乳白色、隆起、边缘整齐不蔓延、表面光滑、较湿润、稍透明)的菌落在TY平板上划线培养，重复3次，将纯化的单菌落经革兰氏染色后镜检，选出革兰氏染色阴性、细胞呈杆状且形态一致的细菌作为纯化的根瘤菌菌株。初筛后共分离出112株根瘤菌。

所述菌株短期保藏方式为，将纯化的根瘤菌菌株接种至YMA固体斜面，待菌株长好后保藏于4℃冰箱内；长期保藏方式为：将纯化的根瘤菌菌株培养至生长期的对数后期或稳定期，然后加入浓度为20％甘油中混匀，至-80℃冰箱中冷冻长期保存。

为了进一步去除重复的根瘤菌，首先提取菌株的总DNA，然后使用持家基因recA的通用引物recA41F/recA640R对112株根瘤菌的持家基因recA基因序列进行PCR扩增，将PCR产物进行分析并最终得到12株花生根瘤菌。将获得的12株菌株在花生上进行常规的回接实验，以确定该菌种是否有结瘤能力，在实验中使用的蛭石、花盆、浇灌用水、花生种子均进行了常规灭菌处理。

经过45天的观察培养，发现其中7个菌株能与宿主花生有效结瘤，而接种其它5个菌株的花生没有结瘤。因此对上述7个菌株作了保藏，以便进行后续实验。

2高效共生固氮菌株盆栽筛选实验

将初筛得到的7个菌株进行盆栽比较实验。

实验方法如下：

⑴菌种活化：将7株实验菌株在斜面培养基上28℃培养48h后,接种到TY液体培养基中，28℃，150r·min^-1转速的摇床中震荡培养48h，至OD600≥1.0,收集菌液保藏至4℃冰箱待用。

⑵选择颗粒饱满、种皮完整的花生种子，表面消毒后置于恒温箱内发芽。待主根长到2cm左右时，转移栽培到盛满拌有低氮营养液的灭菌蛭石的花盆中培养。将1ml用TY液体培养基活化好的供试菌菌液(OD600＝0.8～1.0)接种于幼苗的根部，用灭菌封口膜封住花盆，仅割开为幼苗生长的缝隙。对照处理仅在幼苗根部喷入1ml灭菌的TY液体培养基；每个处理做5个重复，共计8组。将所有培育在花盆里的幼苗按随机区组分置温度为26度，光照时间为14h/d的温室内培养，培养期间及时补充灭菌水。

⑶待花生生长到花期时，用叶绿素计SPAD-502Plus测叶片叶绿素含量。生长45天后收获，立即测量地上部株高、鲜重、干重、根瘤重、根瘤固氮活性。花生根瘤固氮活性检测采用乙炔还原法。。测量结果如下：

表1花生根瘤菌盆栽实验结果

由表1的实验结果可以看出，花生根瘤菌(Bradyrhizobiumsp.)YIC61059具有明显的促生和固氮能力，跟其他菌株相比固氮能力优势明显。

施用过花生根瘤菌(Bradyrhizobiumsp.)YIC61059的花生植株与对照组相比，单株叶绿素含量提高12.28％，单株鲜重提高40.60％，单株固氮活性提高695％。

为了进一步确定本实施根瘤菌菌株YIC61059的系统进化地位，通过对其16SrRNA基因进行扩增构建系统发育进化树。PCR反应采用通用引物：正向引物27F和反向引物1492R。PCR反应体系为：反应体系50μL体积，反应液组成：1μLDNA模板，25μL2×MastarMix，1μL27F，1μL1492R，超纯水补足至50μL。PCR扩增程序：95℃5min；30个循环(94℃1min，56℃1min，72℃1.5min)；72℃5min。扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测合格后送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序。将测到的DNA序列进行人工矫正后，使用NCBI中的BIAST软件在线比对，经过比对，本实施菌株与参比菌株BradyrhizobiumliaoningenseUSDA3622^T相似度为99.9％，所以断定这株菌株为慢生根瘤菌属，在上述盆栽实验中与花生有较好的结瘤效果，于是可以确定它为花生根瘤菌。

慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumsp.)YIC6105916SrRNA序列

3高效固氮花生根瘤菌YIC61059的菌剂制备与应用

⑴实验时间为7月上旬至10月中旬。小区实验设计图如附图1。将实验小区土地平整并起垄，垄间距约1.6m。参照实施例2中的菌株活化方法将本实施菌株活化培养制成根瘤菌剂。

挑取颗粒饱满、大小均匀的花生种子，在阴凉无阳光处将花生种子放入活化的接种菌液中浸泡20min。

实验组将粘有根瘤菌剂的种子均匀播种至试验田中，行间距为40cm，株距10cm，播种深度为5cm。实验对照组均不施加根瘤菌剂，直接将种子播种至整理好的试验田中，行距、株距、种植深度都与实验组相同。其中施肥对照组按每667m²施过磷酸钙1.5kg，硫酸钾8.0kg，尿素4.8kg用量施加肥料。

播种后立即用大水漫灌，及时喷施除草剂乙草胺。50％乙草胺每667m²用量100～150mL，喷施时按规定用量加水混匀后均匀喷施于垄面。

将大垄中双行的花生覆膜，膜宽100cm，厚度为0.005～0.006mm，透光率为70％～90％，膜与垄面贴实无褶皱，减少杂草的生长。

⑵田间管理

花生始花期植株生长旺盛，有效花大量开放，大批果针陆续入土，应及时检查将覆膜揭开以免导致下针困难，结果率、饱果率降低。花生根瘤菌固氮能力较强，固氮量基本可满足自身需求。花生生长期间要及时清除田间杂草。

花生既怕干旱又怕渍水，要以土壤含水量保持60％为宜，切忌土壤含水量过高，过度干旱也易降低花生产量。应根据降雨量的多少及时补充水量和排涝工作。

当中下部叶片转黄脱落，多数荚果果壳硬化，种子颗粒饱满、光润、呈现品种特有的色泽时收获。收获时对花生主侧根长度和果实鲜重进行统计分析。收获后及时晾晒，称量果实干重，统计果实百仁重和千克仁数，进行统计分析，试验结果如图2，3及表2。

表2为接种菌株YIC61059种植花生的田间小区试验中花生的百粒重和千克仁数。

统计结果表明，接种本实施菌株YIC61059的小区花生主根和侧根长度均较不施肥处理的花生大。同时与不施肥的花生相比，接种YIC61059的花生单株果实鲜重增加了18.98％，单株果实干重增加24.48％，促生增产效果明显，且与施肥处理相比差距不显著。接种本实施菌株YIC61059的花生百粒重均大于不施肥和施肥处理的花生，同时千克仁数也小于其他两个对照处理。此数据结果表明接种YIC61059能够有效提高花生果仁品质，增加果实饱满程度。

因此，本实施菌株YIC61059在花生的种植应用中能够显著促进花生的生长及果实产量品质的提高，达到显著增产的目的；此外，本实施菌株根瘤菌剂是绿色环保的微生物肥料，其在花生种植上的应用和推广能够有效降低生产成本，提高作物产量、改善作物品质，减少环境污染，并在一定程度上改善土壤的理化性状，促进农业的长远和可持续发展。

Claims (4)

1.一种花生慢生根瘤菌，其特征在于：慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumsp.)YIC61059，该菌株已于2015年10月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏编号为CGMCCNo.11507。

2.按权利要求1所述的花生根瘤菌的应用，其特征在于：所述根瘤菌在促进花生生长中的应用。

3.按权利要求2所述的花生慢生根瘤菌的应用，其特征在于：所述根瘤菌在促进花生种植中作为产量增产剂的应用。

4.按权利要求2或3所述的花生慢生根瘤菌的应用，其特征在于：将所述慢生根瘤菌于TY液体培养基中28℃，180rpm摇床震荡培养2-3天，待菌液OD₆₀₀≥1.0；将所得菌液直接喷洒在花生种子表面，而后将喷洒有菌液的花生种子直接播种，即可使花生产量得以增长。