CN110257283A - 一株适合黄淮区的耐药抗逆固氮的慢生根瘤菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株适合黄淮区域的耐药抗逆固氮的慢生根瘤菌及其应用。本发明提供了慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)HHPB1，其在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC No.17501。本发明的慢生根瘤菌HHPB1具有广泛的适应性，如耐干旱、耐受农药和耐酸等，是生物安全菌株。在黄淮区域可显著增加不同发育时期的花生地上鲜重、根瘤数、下针数，并一定程度上提高饱果率，花生产量最高提高27.6％。本发明所述慢生根瘤菌HHPB1是一株稳定高效的减肥增效微生物肥料菌种资源。

Description

一株适合黄淮区的耐药抗逆固氮的慢生根瘤菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及一株适合黄淮区的耐药抗逆固氮的慢生根瘤菌及其应用。

背景技术

氮肥是农作物生产中必不可少的肥料之一，尤其豆科植物对于氮肥的需求量更大。花生是我国农业生产中重要的粮食、油料作物，其产量的增加属于物质投入依赖型。我国花生生产一直依赖大量的化肥投入，而过度使用化肥不仅会造成大量的资源浪费而且会带来一系列的环境问题，例如：破坏土壤和土壤微生物群落结构、地下水源污染和温室气体排放等。为了发展绿色农业，在保证花生产量和品质的情况下减少化肥使用，是我国花生生产面临的严峻问题。

花生根瘤菌菌剂为解决这一问题提供了一种可行的方法。花生根瘤菌能够与花生共生形成根瘤，根瘤菌在根瘤中可以把空气中的氮气通过生物固氮作用形成氨，供给豆科植物同化利用，其氮素利用效率远远高于对化学氮肥的利用率，因此充分利用好花生根瘤菌的共生固氮作用，将大幅减少甚至替代花生种植中化学氮肥的使用；同时，根瘤菌还能分泌植物生长促生物质如IAA(吲哚乙酸)促进植物生长，也是一种植物生长根际促生细菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)；花生根瘤菌还能产生铁载体，还能防止病原菌对植物的侵染。因此，使用花生根瘤菌剂能减少化肥污染、保护环境、减少投入成本，在增产的同时又保证了可持续发展。符合当前国家倡导的绿色生态农业的需求。

上世纪三十年代起，国际上有些国家(如美国、澳大利亚，加拿大等)就开始大规模利用根瘤菌接种逐步减少化学肥料用量，在促进豆科作物和牧草的生产上收到了显著的效果，至今这些国家的根瘤菌剂产品研发和应用技术已遥遥领先，豆科接种根瘤菌已经成为基本农事措施。上世纪50年代起我国也开始对接种根瘤菌进行研究，在大豆、花生和紫云英等种植中应用根瘤菌剂也取得了不错的效果；但是由于化肥的应用和普及，导致了根瘤菌应用的停滞，致使我国的根瘤菌应用技术研究被扼杀在摇篮中，技术远远落后于发达国家。

目前我国根瘤菌应用方面存在很多问题尚未解决。主要问题是：缺乏适应性强的、高效固氮的根瘤菌菌株、缺乏在不同生态环境下的根瘤菌菌株应用效果的研究、缺乏适合当前种植方式的根瘤菌剂型和应用技术等等，这些问题严重制约了根瘤菌应用。我国只在大豆生产中有不足5％的种植面积接种过根瘤菌，而其他豆科作物基本没有应用接种根瘤菌技术，要想达到根瘤菌接种技术成为我国豆科种植中的基本措施的目标还有很长的路要走。

花生是我国种植面积仅次于大豆的油料作物，但花生的亩产量和产油量都是大豆的2倍，扩大花生种植面积是弥补我国油料不足的重要途径，因此花生根瘤菌剂的研发和应用前景广阔。黄淮平原是我国最大的花生主产区，种植面积和产量占全国的60-70％多。因此，筛选适合我国黄淮平原的耐药抗逆高效固氮的花生根瘤菌菌剂，对我国花生产业的发展具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一株适合黄淮区的耐药抗逆固氮的慢生根瘤菌及其应用。

第一方面，本发明要求保护一株慢生根瘤菌。

本发明所要求保护的慢生根瘤菌具体为慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)HHPB1，其在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC No.17501。

本发明所述慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)HHPB1经血琼脂平板培养法检测，溶血活性为阴性，表明对人畜无害。

本发明所述慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)HHPB1经鉴定具有多种功能特征，主要包括：(1)耐药性：可耐受农业应用中普遍使用的杀虫剂吡虫啉(58.3mg/L)和杀菌剂嘧菌酯(500mg/L)、戊唑醇(107.5mg/L)的最大使用剂量。(2)抗逆性：可耐盐8％；耐酸pH5；耐碱pH8；耐干旱(10％PEG，轻度干旱)。

第二方面，本发明要求保护一种菌剂。

本发明所要求保护的菌剂具体为活性成分为所述慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumsp.)HHPB1。

所述菌剂中除了含有作为活性成分的所述慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)HHPB1外，还含有辅料。所述辅料可根据需要选择。

在本发明的一个实施例中，所述菌剂具体为液体菌剂，是通过TY液体培养基培养所述慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)HHPB1获得的；所述慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumsp.)HHPB1在所述液体菌剂中的浓度为1×10^10-11cfu/ml。

第三方面，本发明要求保护所述慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)HHPB1或所述菌剂在制备用于促进植物生长的产品中的应用。

其中，所述产品可为微生物肥料。

第四方面，本发明要求保护所述慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)HHPB1的田间应用方法。

本发明所提供的所述慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)HHPB1的田间应用方法，具体可包括如下步骤：

(A1)将所述慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)HHPB1的菌液用生理盐水(即0.8％NaCl水溶液，％表示g/100ml)稀释，得菌液稀释液；；

(A2)向步骤(A1)获得的菌液稀释液中添加微量元素，然后将添加有微量元素的菌液稀释液喷洒于植物种子表面，阴干；

(A3)步骤(A2)阴干的种子，用1％的羧甲基纤维素钠溶液再拌种包衣，阴干；

(A4)播种。

进一步地，步骤(A1)中，所述慢生根瘤菌HHPB1的菌液可采用TY液体培养基培养所述慢生根瘤菌HHPB1所得。

更进一步地，所述慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)HHPB1的菌液可按照包括如下步骤制备得到：向TY液体培养基接种5％(体积分数)的所述慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumsp.)HHPB1的种子液，在28℃180rpm培养箱培养3-5天；所述种子液的OD₆₀₀为1.2。所述慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)HHPB1在所述菌液中的浓度为1×10^10-11cfu/ml。

进一步地，步骤(A1)中，将所述慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)HHPB1的菌液用生理盐水稀释时两者的配比为1体积所述慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)HHPB1的菌液：2体积生理盐水。

进一步地，步骤(A2)中，所述微量元素是以微量元素溶液的形式添加到所述菌液稀释液中的；所述微量元素液的组成如下：H₃BO₃ 2.86g/L，MnSO₄ 1.81g/L，CuSO₄·5H₂O0.80g/L，ZnSO₄ 0.22g/L，H₂MoO₄ 0.02g/L，余量为水。向所述菌液稀释液中添加的所述微量元素溶液的量为每mL所述菌液稀释液添加1μL所述微量元素溶液。其中，所述微量元素的作用是增加营养提高细菌活性和固氮能力。

进一步地，步骤(A2)中，所述添加有微量元素的菌液稀释液的用量以使种子表面湿润即可，千万不能用量过多或浸泡，否则造成种皮脱落。具体而言，所述添加有微量元素的菌液稀释液的用量可为每kg种子用10mL所述添加有微量元素的菌液稀释液。

进一步地，步骤(A3)中，所述1％的羧甲基纤维素钠溶液为含有终浓度为10g/L的羧甲基纤维素钠的水溶液。配制方法如下：10g羧甲基纤维素钠(800～1200mPa·s)溶于1L去离子水，在60℃水浴中搅拌溶解至透明糊状胶液。所述1％的羧甲基纤维素钠溶液的用量为每kg种子用20mL所述1％的羧甲基纤维素钠溶液(保持菌剂附着和湿度)。

进一步地，步骤(A4)中，在进行完所述播种前还包括浇水的步骤。保证菌株必要的湿度(土壤湿度达到60-70％)以利于菌株的生存。

第五方面，本发明要求保护所述慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)HHPB1或所述菌剂或所述方法在促进植物生长中的应用。

在上述各方面中，所述促进植物生长可为在以有机肥和/或化肥为主的底肥的土壤中促进植物生长。

进一步地，所述有机肥可为牛粪。

进一步地，所述化肥为减氮磷化肥(钾正常施用，减氮磷肥)。

在本发明的具体实施例方式中，以有机肥为底肥的土壤具体为我国山东地区(如临沂市平邑县)的土壤。以化肥为主的底肥的土壤具体为我国河南地区(如商丘市睢县)的土壤；

在上述各方面中，所述促进植物生长体现可为如下中的全部或部分：

(B1)在所述植物的不同发育时期促进所述植物的地上鲜重增加；

(B2)在所述植物的不同发育时期促进所述植物的根瘤数增加；

(B3)在所述植物的不同发育时期促进所述植物的主茎长增加；

(B4)在所述植物的开花期促进所述植物的下针数增加；

(B5)促进所述植物的饱果率增加；

(B6)促进所述植物的有效下针率增加；

(B7)促进所述植物的产量增加；

(B8)促进所述植物的生物量增加；

所述不同发育时期为如下中的任一种：开花期(如出苗后80天)、成熟期(如出苗后110-150天)。

在上述各方面中，所述植物可为豆科植物。

进一步地，所述豆科植物可为花生。

所述下针数为花生果针数。所述有效下针率为能够进入土壤中形成花生果的花生果针数与总果针数的比率。

本发明的第四方面和第五方面所述应用适用于中国黄淮区，或者与其具有相似地理环境的地方。其中，所述中国黄淮区是指河北，北京，天津，山东，河南，安徽和江苏北部所形成的黄淮大区域。

在本发明的具体实施方式中，所述花生具体为花生品种海花一号或四粒红。

本发明菌株慢生根瘤菌HHPB1分离自花生根瘤，该菌株具有较强的适应性如耐受农药、耐干旱和耐酸等，是生物安全菌株。在底肥为有机肥或减少氮磷化肥的情况下，田间施用该菌剂比未施用对照可显著增加不同发育时期的花生地上鲜重、根瘤数，显著增加开花期下针数，并一定程度上提高饱果率，花生产量最高提高了27.6％。本发明为我国花生主要种植区—黄淮平原提供了一株强耐药性的高效固氮和稳定促生的花生根瘤菌种质资源，应用此菌可减少氮肥的使用、减轻过量施用化学氮肥对环境造成的污染，符合我国可持续发展、绿色生态农业的要求。该发明专利扩大了我国粮食作物促生菌种质资源，为研发高效稳定的微生物肥料以及应用技术提供基础。

保藏说明

菌株名称：慢生根瘤菌

拉丁名：Bradyrhizobium sp.

参椐的生物材料(株)：HHPB1

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2019年3月29日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.17501

附图说明

图1为慢生根瘤菌HHPB1在YMA固体培养基上的菌落形态。

图2为慢生根瘤菌HHPB1在pH5酸性培养基的生长情况。

图3为慢生根瘤菌HHPB1在pH8弱碱性培养基的生长情况。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂、原料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、慢生根瘤菌HHPB1的分离和功能鉴定

本发明以河北唐山分离鉴定的花生根瘤菌为材料，测定菌株的固氮能力和适应性(耐药性、耐干旱和耐盐碱等)，筛选出一株适应于黄淮区的适应性强的高效固氮的花生根瘤菌。

一、材料和方法

1、实验材料

(1)菌株

本研究室前期从河北唐山采集、分类并鉴定的慢生根瘤菌。

(2)使用的培养基及试剂

①YMA培养基

甘露醇10.0g，K₂HPO₄ 0.25g，KH₂PO₄ 0.25g，MgSO₄ 0.1g，NaCl 0.1g，酵母提取物3.0g，琼脂15g(固体培养基加)，去离子水1L，pH 6.8-7.0，121℃灭菌20min。

②TY培养基

胰蛋白胨5.0g，酵母提取物3.0g，CaCl₂ 0.6g，琼脂15g(固体培养基加)去离子水1L，pH 6.8-7.2，121℃灭菌20min。

③血琼脂培养基

蛋白胨18g，酵母粉1g，NaCl 5g，琼脂15g-20g，去离子水1L，pH6.8-7.2。121℃灭菌20min后，待培养基冷却至50℃添加5％(5ml/100ml)脱纤维羊血，混匀后倒平板。

④耐盐培养基

配制的TY培养基，其中NaCl按1％、4％、8％NaCl(％表示g/100ml)盐浓度分别称取加入，121℃灭菌20min。

⑤耐酸碱培养基

配制TY培养基9瓶，灭菌后在超静工作台中，用无菌稀盐酸和氢氧化钠溶液调整培养基的pH值分别到pH 3、4、5、6、7、8、9、10、11冷却后到平板。

⑥耐药性培养基

选取黄淮区花生常用杀菌剂和杀虫剂，按照说明书的最高使用浓度，递减设置3-4个浓度梯度，并计算出各个梯度的用量(mg/L)，见表1。灭菌后的TY培养基冷却至50℃左右，快速分别加入4个浓度梯度的农药量，迅速摇匀后倒平板。

表1农药浓度梯度及有效含量

⑦耐干旱培养基

耐干旱培养基采用聚乙二醇(PEG 6000)调节水势，人工模拟干旱条件进行耐干旱菌株鉴定。共设置4个处理，PEG 6000含量分别为：0(CK)、10％(轻度干旱)、20％(中度干旱)和30％(重度干旱)。其对应的水势分别为：0，-0.185，-0.559，-1.122MPa，121℃灭菌20min。

⑧试剂等

无菌生理盐水：0.8g NaCl溶于100ml去离子水中，121℃灭菌20min。

微量元素液：溶剂为水，溶质及含量如下：H₃BO₃ 2.86g/L，MnSO₄ 1.81g/L，CuSO₄·5H₂O 0.80g/L，ZnSO₄ 0.22g/L，H₂MoO₄ 0.02g/L。

粘稠剂：10g羧甲基纤维素钠(800～1200mPa·s)溶于1L去离子水

(3)使用的引物信息

如表2所示。

表2本发明所用引物信息

2、实验方法

(1)菌株分离与鉴定

将采集的根瘤用清水洗干净，放入灭菌平皿中加无菌水完全泡胀，吸出水分，加95％的乙醇处理30s，使表面脱水，吸出乙醇，加0.2％HgCl₂进行表面消毒5min，然后用无菌水洗涤6～7次，将表面消毒的根瘤移入无菌的1ml离心管内，用无菌的1ml枪头捣碎根瘤，沾取捣出物在YMA平板上划线，放入28℃培养箱培养，约7-10d后长出菌落，再挑取单菌落通过平板划线法纯化2次，革兰氏染色镜检，菌落和菌体形态都符合根瘤菌的形态后，将菌体转接到YMA试管斜面，培养后放冰箱保存。也可制作冷冻干燥管或25％的甘油冻存。其中一株分离的菌株，将其编号为HHPB1。

(2)菌株安全性检测

将菌株HHPB1接种于血琼脂培养基中，28℃培养7d，观察有无溶血圈。有溶血圈出现代表菌株有溶血活性，对人畜有潜在威胁；若无溶血圈出现代表菌株无溶血活性，为安全菌种，可作为微生物肥料应用菌种。

(3)抗逆性检测

将菌株HHPB1接于耐盐、耐酸碱培养基中，28℃培养7d，观察细菌生长情况。

(4)耐干旱

将菌株HHPB1接于耐干旱培养基中，28℃培养7d，观察细菌生长情况。

(5)耐药性

将菌株HHPB1接于耐农药培养基中，28℃培养7d，观察细菌生长情况。

(6)16s r DNA序列测序鉴定

利用Trelief^TM Plant Genomic DNA kit(TsingKe)试剂盒提取菌体总DNA，并对16s rDNA序列进行PCR扩增，所用正向引物为16s rDNA P1，反向引物为16s rDNA P6。扩增反应条件为：95℃5min；94℃1min，60℃30s，72℃90s，30个循环；最后72℃终延伸10min。PCR扩增产物检测合格后送至北京擎科新业生物技术有限公司进行测序。

二、结果分析

1、菌株基本特征

菌株HHPB1接种于YMA固体培养基，28℃恒温培养7d，菌落呈淡黄色，圆形，表面光滑不透明(图1)；革兰氏染色为阴性，菌体杆状，具有鞭毛，可运动。

2、安全性检测结果

菌株HHPB1在血琼脂平板上培养7d，不出现溶血圈，溶血活性为阴性。

3、抗逆性结果

如表3所示：菌株HHPB1含可耐盐8％；耐酸pH5；耐碱pH8；耐干旱(10％PEG，轻度干旱)，在以上鉴定抗逆性培养基上可以生长。图2为菌株HHPB1在pH5酸性培养基的生长情况。图3为菌株HHPB1在pH8弱碱性培养基的生长情况。

表3菌株HHPB1的抗逆性

抗逆性	菌株生长情况	抗逆性	菌株生长情况
				耐盐8％	+	耐碱pH8	+
耐酸pH5	+	耐干旱10％PEG	+

注：+表示菌株生长；-表示菌株未生长；++代表菌株生长情况比+更好。

4、耐药性结果

如表4所示：菌株HHPB1耐受花生种植时常用的杀虫剂吡虫啉，常用的杀菌剂嘧菌酯和戊唑醇。

表4菌株HHPB1的耐药性鉴定结果

注：+表示菌株生长；+号越多代表菌株生长情况越好

5、菌株16s rDNA序列测序结果

双端测序序列用DNAMAN软件进行拼接，共1347bp，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。得到的16s rDNA序列(SEQ ID No.1)在NCBI网站进行BLAST比对，结果显示该菌株与Bradyrhizobium arachidis相似性最高，同源性为100％。

鉴于以上对菌株HHPB1的鉴定结果，确定该菌属于慢生根瘤菌属(Bradyrhizobiumsp.)将该菌株于2019年3月29日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为CGMCC No.17501。菌株名称：慢生根瘤菌；拉丁名：Bradyrhizobium sp.；参椐的生物材料(株)：HHPB1。

实施例2、慢生根瘤菌HHPB1的田间应用研究

一、慢生根瘤菌HHPB1的田间应用方法

1、菌株活化及扩大培养：于播种前15d左右将保藏于-80℃冰箱的慢生根瘤菌HHPB1菌种采用三区划线方式活化于YMA固体培养基，于28℃恒温培养箱培养7d，分离单菌落。将单菌落用无菌竹签挑至TY液体培养基中扩大培养，置于28℃，180转/分的摇床振荡培养至菌液OD₆₀₀＝1.2，得到种子液。然后将种子液按照5％(体积分数)的比例接种到新的TY液体培养基中，在28℃180rpm培养箱培养3-5天，得到菌液(以不接菌培养基为空白对照，菌液浓度为约1×10^10-11cfu/ml)。

2、使用前将菌液与生理盐水按照体积比1:2的比例混匀，然后向所得菌液稀释液中滴加微量元素液(1μl/ml)混匀并混匀。每mL菌液稀释液添加1μL微量元素液(配方见实施例1步骤一)。

3、包根瘤菌剂：按照每kg种子喷洒10ml左右稀释后菌液。将混匀的稀释后菌液均匀喷在种子表面至种子表面湿润即可，注意用量不宜过多，否则种皮易破裂脱落。放在阴凉通风处处阴干，避免阳光直射。

4、包保护剂：阴干的种子用1％的羧甲基纤维素钠溶液进行包衣，用量20ml/kg，将1％的羧甲基纤维素钠溶液均匀喷在种子表面至种子表面湿润即可，避免过量使用，不要使种皮破裂脱落，放在阴凉通风处处阴干，避免阳光直射。

5、人工或机器播种：播前浇水，保证必要的土壤湿度(达60-70％)利于根瘤菌生存。

二、慢生根瘤菌HHPB1田间应用实例

1、山东省田间试验

试验地点设在山东省临沂市平邑县。

花生品种为当地普遍使用的海花一号品种。

种植和采样时间：2018年4月27日播种，播种前浇水(即2018年4月26日浇水)；2018年7月8日-7月14日进行中期采样；2018年9月16日-2018年9月21日进行收获期采样。

试验田分为两个区，接种区和非接种区。不接种作为对照组CK，接种慢生根瘤菌HHPB1菌剂为实验组。对照组和实验组试验地面积各自约为146平方米，每个处理四个重复，共八个小区，每个小区约36.5平方米。

肥料等处理：有机肥，即每亩施用腐熟牛粪2-3立方米做底肥(前一年冬天即将牛粪撒入)，本试验田为有机种植模式定位点，不施用任何化肥和任何农药。

所用生物菌剂为慢生根瘤菌HHPB1液体根瘤菌剂。

具体结果如表5、表6，从表5可知：开花期菌株HHPB1实验组植株根瘤数、根瘤鲜重和下针数均显著高于对照组。

表5应用HHPB1菌剂花生开花期生物量一览表

注：±SD。不同小写字母表示在0.05水平上差异显著。

从表6可知：收获期菌株HHPB1实验组植株根瘤数和有效下针率(能够进入土壤中形成花生果的果针数与总果针数的比率)均显著高于对照组，产量增产27.6％，地上鲜重和饱果率也明显高于对照。结果表明在黄淮地区的有机肥土壤中，接种慢生根瘤菌HHPB1在花生不同生长发育阶段显著提高花生的生物量并最终提高产量，表明此慢生根瘤菌具备开发为稳定高效的微生物肥料菌种的潜力。

表6应用HHPB1菌剂花生成熟期生物量一览表

注：“有效下针率”是指能够进入土壤中形成花生果的果针数与总果针数的比率(下同)。±SD。不同小写字母表示在0.05水平上差异显著。

2、河南省田间试验

试验地点设在河南省商丘市睢县。

花生品种为当地普遍使用的花生品种四粒红。

种植和采样时间：2018年4月28日播种，播种前浇水(即2018年4月27日浇水)；2018年6月20日-6月27日进行中期采样；2018年8月9日-2018年8月17日进行收获期采样。

试验田分为三个肥料处理区，一区常规施肥做阳性对照CK+(磷酸二铵50斤/亩，氯化钾30斤/亩，有机肥80斤/亩)；二区减少氮磷肥40％(磷酸二铵30斤/亩，氯化钾30斤/亩，有机肥48斤/亩)；三区正常施用钾肥但不施加氮磷肥做阴性对照CK-(氯化钾30斤/亩)。每个处理占地面积约94平方米，每个处理四个重复，每个小区约23.5平方米。

各个区的肥料混合后做底肥均匀撒施，然后旋耕起垄种植。

所有处理都接种慢生根瘤菌HHPB1液体根瘤菌剂。

试验结果见表7、表8，从表7可知：开花期接种HHPB1的减少氮磷肥40％实验组植株主茎长和下针数显著高于不施氮肥的阴性对照组CK^-，且与正常施肥的阳性对照组CK⁺无显著性差异。

表7应用HHPB1菌剂花生开花期生物量一览表

注：±SD；CK^-：不施加氮磷肥；CK⁺：常规施肥。减氮磷40％：氮磷施肥量比常规施肥量的氮磷肥减少40％。不同小写字母表示在0.05水平上差异显著。

从表8可知：收获期接种HHPB1的减少氮磷肥40％实验组植株根瘤数与地上鲜重均显著高于阴性对照组，产量增产12.0％且与阳性对照组差异不大。根瘤数不多的原因可能是此地块前茬施肥量太多，抑制了根瘤形成，但是根瘤菌的促生作用依然显著。因此，在黄淮区使用化肥为主的土壤中，慢生根瘤菌HHPB1在花生不同生长发育阶段均可提高花生的生物量并最终提高产量，证明此慢生根瘤菌可作为开发稳定高效的微生物肥料菌种资源。

表8应用HHPB1菌剂花生成熟期生物量一览表

注：±SD；CK^-：不施加氮磷肥；CK⁺：常规施肥。减氮磷40％：氮磷施肥量比常规施肥量的氮磷肥减少40％。不同小写字母表示在0.05水平上差异显著。

<110> 中国农业大学

<120> 一株适合黄淮区的耐药抗逆固氮的慢生根瘤菌及其应用

<130> GNCLN191284

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1347

<212> DNA

<213> Bradyrhizobium sp.

<400> 1

gtcgagcggg cgtagcaata cgtcagcggc agacgggtga gtaacgcgtg ggaacgtacc 60

ttttggttcg gaacaacaca gggaaacttg tgctaatacc ggataagccc ttacggggaa 120

agatttatcg ccgaaagatc ggcccgcgtc tgattagcta gttggtaggg taatggccta 180

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ataatgacgg taccgcaaga ataagccccg gctaacttcg tgccagcagc cgcggtaata 420

cgaagggggc tagcgttgct cggaatcact gggcgtaaag ggtgcgtagg cgggtcttta 480

agtcaggggt gaaatcctgg agctcaactc cagaactgcc tttgatactg aagatcttga 540

gtccgggaga ggtgagtgga actgcgagtg tagaggtgaa attcgtagat attcgcaaga 600

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gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgaatg ccagccgtta 720

gtgggtttac tcactagtgg cgcagctaac gctttaagca ttccgcctgg ggagtacggt 780

cgcaagatta aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt 840

taattcgacg caacgcgcag aaccttacca gcccttgaca tgtccaggac cggtcgcaga 900

gacgtgacct tctcttcgga gcctggaaca caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg 960

tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ccgtccttag ttgctaccat 1020

ttagttgagc actctaagga gactgccggt gataagccgc gaggaaggtg gggatgacgt 1080

caagtcctca tggcccttac gggctgggct acacacgtgc tacaatggcg gtgacaatgg 1140

gatgcgaagg ggcaacccct agcaaatctc aaaaagccgt ctcagttcgg attgggctct 1200

gcaactcgag cccatgaagt tggaatcgct agtaatcgtg gatcagcacg ccacggtgaa 1260

tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg ggagttggtt ttacctgaag 1320

acggtgcgct aacccgcaag ggaggca 1347

Claims (10)

1.慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)HHPB1，其在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC No.17501。

2.一种菌剂，其活性成分为权利要求1所述的慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)HHPB1。

3.权利要求1所述的慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)HHPB1或权利要求2所述的菌剂在制备用于促进植物生长的产品中的应用。

4.权利要求1所述的慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)HHPB1的田间应用方法，包括如下步骤：

(A1)将权利要求1所述的慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)HHPB1的菌液用生理盐水稀释，得到菌液稀释液；

(A2)向步骤(A1)获得的菌液稀释液中添加微量元素，然后将添加有微量元素的菌液稀释液喷洒于植物种子表面，阴干；

(A3)步骤(A2)阴干的种子，用1％的羧甲基纤维素钠溶液再拌种包衣，阴干；

(A4)播种。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(A1)中，所述慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)HHPB1的菌液是采用TY液体培养基培养所述慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)HHPB1所得；所述慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)HHPB1在所述菌液中的浓度为1×10^10-11cfu/ml；

和/或

步骤(A1)中，将所述慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)HHPB1的菌液用生理盐水稀释时两者的配比为1体积所述慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)HHPB1的菌液：2体积生理盐水；

和/或

步骤(A2)中，所述微量元素是以微量元素溶液的形式添加到所述菌液稀释液中的；所述微量元素溶液的组成如下：H₃BO₃ 2.86g/L，MnSO₄ 1.81g/L，CuSO₄·5H₂O 0.80g/L，ZnSO₄0.22g/L，H₂MoO₄ 0.02g/L，余量为水；向所述菌液稀释液中添加的所述微量元素溶液的量为每mL所述菌液稀释液添加1μL所述微量元素溶液；

和/或

步骤(A2)中，所述添加有微量元素的菌液稀释液的用量为每kg种子用10mL所述添加有微量元素的菌液稀释液；

和/或

步骤(A3)中，所述1％的羧甲基纤维素钠溶液为含有终浓度为10g/L的羧甲基纤维素钠的水溶液；所述1％的羧甲基纤维素钠溶液的用量为每kg种子用20mL所述1％的羧甲基纤维素钠溶液；

和/或

步骤(A4)中，在进行完所述播种前还包括浇水的步骤。

6.权利要求1所述的慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)HHPB1或权利要求2所述的菌剂或权利要求4或5所述的方法在促进植物生长中的应用。

7.根据权利要求3或6所述的应用，其特征在于：所述促进植物生长为在以有机肥和/或化肥为底肥的土壤中促进植物生长。

8.根据权利要求3-7中任一的应用，其特征在于：所述促进植物生长体现为如下中的全部或部分：

(B1)在所述植物的不同发育时期促进所述植物的地上鲜重增加；

(B2)在所述植物的不同发育时期促进所述植物的根瘤数增加；

(B3)在所述植物的不同发育时期促进所述植物的主茎长增加；

(B4)在所述植物的开花期促进所述植物的下针数增加；

(B5)促进所述植物的饱果率增加；

(B6)促进所述植物的有效下针率增加；

(B7)促进所述植物的产量增加；

(B8)促进所述植物的生物量增加；

所述不同发育时期为如下中的任一种：开花期、成熟期。

9.根据权利要求1-8中任一所述的慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)HHPB1或菌剂或应用或方法，其特征在于：所述植物为豆科植物。

10.根据权利要求9所述的慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)HHPB1或菌剂或应用或方法，其特征在于：所述豆科植物为花生。